טכניקה למסך בוק האמריקאי להתנגדות לחרקי האשור Scale (<em&gt; Fagisuga Cryptococcus</em&gt; לינד.)

Summary

מחלה קליפת אשור היא ביוזמת האכלת פעילויות של החרק בקנה מידה אשור שיוצרים נקודות כניסה פטרייתי בקליפה. עצים, כי הם עמידים לחרקים בקנה מידה הם גם מחלה עמידה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול שפיתחנו למסך עצי אשור פרט להתנגדות בקנה מידה אשור.

Abstract

מחלה אשור קליפת תוצאות (BBD) ברמות גבוהות של תמותה ראשונית, והשאירה מאחורי עצי הניצולה שנחלשו מאוד ומעווה. המחלה היא ביוזמת האכלת פעילות של החרקים פולשני בקנה מידה אשור, Cryptococcus fagisuga, אשר יוצרים נקודות כניסה לזיהום על ידי אחד המינים במיקרוסקופ סטראו של פטרייה. ללא נגיעות בקנה מידה, יש הזדמנות קטנה לזיהום פטרייתי. שימוש בביצים בקנה מידה לשורצת באופן מלאכותי עצים בריאים בדוכנים בכבדות השפיעו BBD הראתה כי עצים אלה היו עמידים לחלק החרקים בקנה מידה של מורכבות המחלה ^1. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפיתחנו, המבוסס על הטכניקה המלאכותית שריצה על ידי יוסטון ^2, אשר יכול לשמש מסך לעצים בקנה מידה עמידה בתחום ובקטן יותר שתילים ושתלים בעציצים. זיהוי של עצים בקנה מידה עמידה הוא מרכיב חשוב של ניהול BBD של דרך עץתוכניות שיפור ומניפולציה silvicultural.

Introduction

מחלה אשור קליפה (BBD) יש לו השפעה מזיקה על אשור אמריקאי בצפון אמריקה מאז כניסתה של החרקים פולשני בקנה מידה אשור, fagisuga Cryptococcus, במחוז הקנדי של נובה סקוטיה בסוף 1890s ^3. מורכבת חרקי מחלה זו היא יזמה כאשר החרק בקנה מידה האשור מוסיף stylet ההאכלה שלה לתוך הקליפה יוצרת סדקים קטנים המספקים כניסה לזיהום על ידי אחד המינים במיקרוסקופ סטראו של פטרייה (ditissima מיקרוסקופ סטראו או faginata מיקרוסקופ סטראו). כתפטיר הפטרייה לגדול, אזורים גדולים של רקמה עלולים למות, בסופו חוגרים את העץ לגמרי. הנזק מהמחלה מחליש את העץ, מה שהופך אותו נוטה למצלמים ברוחות חזקות ^4. רמת התמותה בגל הראשון של המחלה דווח להיות גבוה ככל 50% ^5. עצים ששרדו לעתים קרובות מעוותים באופן חמור כcankers יוצר הפחתת ערכו של העץ כמוצר עץ.0, יש עצים מסוג זה נטייה לשורש הנבטה שמובילה להיווצרות של "סבך אשור" שמונע מין רצוי יותר אחר מהקמת, הפחתת הערך הכלכלי ואקולוגי של העמדה ^6. למרות המחלה קליפת אשור אינה צפויה להוביל להכחדה של האשור האמריקאי, זה משנה לעמוד הרכב ובריאות שמוביל לירידה במזון ובית גידול ^ל7,8 חיות בר.

ביציעים מושפעים BBD במשך שנים רבות, עצים שנותרו ללא כל סימפטומים של המחלה כבר דיווחו. ניסויים חיסון מלאכותיים הראו כי עצים אלה הם עמידים לחרקים בקנה מידה ^2. ללא נגיעות בקנה מידה, יש הזדמנות קטנה לזיהום במיקרוסקופ סטראו, למזער את השפעתה של הפטרייה. תמותה בקנה מידה גדולה באשור אמריקאי עקב הזיהום במיקרוסקופ סטראו בהעדר התפשטות בקנה מידה לפני מעולם לאדווח, ולכן התנגדות לתוצאות חרקים בקנה מידה אשור בהתנגדות לBBD.

מחקר שנערך לאחרונה בניהולו של BBD התמקד בזיהוי, התפשטות, רבייה, ושמירה של עצי אשור אמריקאים עם התנגדות לחרקים בקנה מידה אשור. מחקרים גנטיים הראו כי התנגדות לחרקים בקנה מידה היא תורשתית ובחירת רבייה זהירה של עצים עמידים יכולים לגרום לשיפור משמעותי בדור אחד ^9. ממצא זה הגבירו את מאמציהם של מנהלי מדינה ויער לאומי בארצות הברית להקמת מטעי זרעים אזוריים של אשור אמריקאי עמיד לספק מקור זרע BBD עמיד גנטי מגוון לנטיעות שיקום ^10,11. המחקר גם הצביע על כך שמניפולצית silvicultural גנטיקה עמדה על ידי הסרה של עצים ושימור עצים עמידים רגישים יכולה לגרום ^9,12 שיפור עמדה.

ניהול של BBD באמצעות פעילויות שיפור עץ או באמצעות ביצוע המרשמים silvicultural דורש את היכולת לבחור וללהבחין בין עצים בקנה מידה עמידה ורגישה אשור. השיטות שהוצגו כאן הותאמו משיטה הוצגה לראשונה על ידי דייב יוסטון לחסן באופן מלאכותי שתילים עם ביצים בקנה מידה אשור ^1. השיטה יכולה לשמש ככלי מיון לזהות לוקוסי תכונה כמותית (QTL) הקשורים להתנגדות או להבחין בין שתילים בעציץ עמידים ורגישים או ramets מורכב במחקרים גנטיים. לחלופין, ניתן להשתמש בו לסינון עצים בוגרים בתחום לזהות עצים עמידים לפיתוח מטע זרע, או שמירה בתחום. ניתן לזהות עצים רגישים והוסרו כדי למזער את השפעות מחלה.

Protocol

1 צמח חומר:. למבוגרים שדה עצים, שתילי עציצים, או עציצים שתלי

1. בתחום בדיקות, בחר עצים בוגרים בריאים אמריקאים אשור שלא מראים סימנים של התפשטות בקנה מידה או מחלה לבדיקת התנגדות אפשרית. בעליל עצים רגישים גם צריכים להיות מזוהים כדי לשמש כביקורת (איור 1).
2. לבדיקת שתילים או שתלים בעציץ, לאסוף ולנבוט beechnuts כפי שמתואר בקוך וקארי, 2004 או נצר שתל כמתואר בקארי ואח', 2013.
3. גדל שתילים או שתלים בשתילת תערובת אדמה מתוקנת עם 47 micronutrients גרם, 477 גרם דשן שחרור 15N-3.9P-9.9K האיטי, פרלייט גס 700 גרם ו75 סולפט האלומיניום גרם לכל 2.8 מ"ק. תיק מטר. אם יש צורך בהמשך עונת הגידול, לדשן צמחים שבועיים עם 17N-1.3P-14.1K מסיס ב200 חנקן עמודים לדקה.
4. במהלך עונת הגידול, לשמור על צמחים בבית צל. מאפשר לצמחים ללכת רדומים מחוץ בסתיו לפני מעברםלמתקן אחסון בטמפרטורה מבוקר (~ 4 ° C) מנובמבר עד אפריל.

2. אוסף של אשור סולם ביצים

1. בדוכן שורץ-BBD, לבדוק עצים נגועים בכבדות (המזוהים בקלות על ידי המראה, 1A "המסויד" איור) עם זכוכית מגדלת יד כדי לאשר את קיומו של ביצים, בדרך כלל בשפע מאמצע יולי עד אמצע אוגוסט.
2. שימוש במכחול להבריש בעדינות את גושי שעווה הלבנים של כנימות בוגרות, ביצים ופסולת אחרים, לתוך שקית איסוף ליטר אחד סגר פלסטיק (איור 1). לאסוף ממינימום של שלושה עצים שונים זה מזה לפחות 12 מ '.
3. במידת צורך, לאחסן ביצים בשקית האיסוף האטומה עד שבועיים ב 4 ° C. קלטת חתיכה קטנה (2.5 סנטימטר מרובע) של פוליאתילן מוקצף לח לחלק הפנימי של השקית כדי למנוע את הביצים מהתייבשות.
4. להפריד את הביצים בקנה מידה (0.15 x 0.25 מ"מ) מהמבוגרים (0.60 מ"מ) וdebriים, לבנות מסננת באמצעות קטע קצר של 2 צינור PVC 'וצימוד לתמוך פיסה רבועה של 250 רשת ניילון מיקרון (איור 2).
5. רוקן את התערובת של מבוגרים, שעווה, ביצים, ופסולת משקית האיסוף על גבי המסננת ולהשתמש במברשת צבע קטנה כדי לעודד בעדינות את הביצים לעבור דרך הרשת לתוך צלחת פטרי זכוכית בהמשך. יש להימנע ממאכלי פלסטיק פטרי כי הם מחזיקים את חשמל הסטטי יותר, מה שהופך את זה קשה להעביר את הביצים. ביצים לפני ואחרי הסנון מוצגות באיור 3.
6. ניתן לאחסן ביצים מטוהרים בצלחת פטרי על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפחות. כדי למנוע את הביצים מהתייבשות, קלטת פיסה לחה של קצף למכסה ולאטום עם Parafilm.

3. ביצת מבחני הכדאיות

1. כדי להעריך את כדאיות ביצה, להשתמש במזרק 10 סמ"ק ליישם טבעת דקה של וזלין סביב ההיקף של החלק התחתון של צלחת פטרי זכוכית 60 מ"מ (איור 4 א ).
2. העבר על 100 ביצים למרכז הזירה, הנח את המכסה על צלחת פטרי ולאטום עם Parafilm. לאפשר את צלחת פטרי האטום להישאר באין מפריע בטמפרטורת חדר למשך 2 שבועות, או 3 שבועות אם ביצים היו מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס לפני תחילת assay.
3. נימפות בקעו יהפכו תקועות בוזלין וניתן לספור בקלות, וביצים ריקות בקלות להבחין בין ביצים שעדיין לא בקעו לפי צבעם וברק (איור 4). חישוב כדאיות על ידי חלוקת מספר נימפות בסכום של הביצים הריקות בתוספת ביצים מלאה שנותרו. כדאיות טובה צריכה להיות ב75% עד 90% טווח הביצים בקע.

4. הקרנה בקנה מידה התנגדות של גדולים למבוגרים אשור עצים בשדה

1. למבחן כמוני, לספור את 500 ביצים באמצעות מיקרוסקופ לנתח ובעזרת מרית קטנה בעדינות ומפזרים אותם על פני המרכז לפתוח תאי 10 x 15 x 1.3 מלבן של פוליאתילן מוקצף predampened, סנטימטר. אללצנן את הקצף, הרטבת אותו ואז לסחוט את מים רבים ככל האפשר. למבחן איכותי, ניתן לספור 500 ביצים והניחו בבקבוקון זכוכית קטן וקו "מילוי" נמשך, שניתן להשתמש כדי למדוד קבוצות נוספות של כ 500 ביצים.
2. הנח את כרית הקצף על גבי עץ הבדיקה עם צד הביצה פונה נגד לנבוח. להחזיק את הכרית במקום עם חבל, מחרוזת, חוט, חוט או חומרת פלסטיק מצופה. פלסטיק או חומר מבוסס מתכת אמור לשמש במקום חומרי סיבים טבעיים אשר בזז יותר בקלות על ידי חיות הבר.
3. קו העליון ואת הצדדים של פיסת סנטימטר חתוך מראש 23 x 30 של לעטוף אדים חדירים למים בית עם דבק סיליקון אצטט מבוססת ומניחים אותו על משטח בדיקת קצף. לחץ על הקצוות של לעטוף את בית העץ כדי ליצור חותם אטום למים. הנח חוט ניילון או חוט חומרה מצופה פלסטיק מסביב לעץ והבית לעטוף, כדי להחזיקו במקום בזמן שקבוצות הדבק (איור 5).
4. מניחים מינימום של שנירפידות מבחן על כל עץ בדיקה, רצוי בצדדים מנוגדים של גזעו. בכל אתר, הנח כריות מבחן על לפחות 2 עצים רגישים (עם נגיעות בקנה מידה טבעית ברורות) כביקורת. לפני הצבת רפידות מבחן על עצי שליטה, להסיר כל חרקים באופן טבעי בקנה מידה או ביצים באמצעות משרד זיפי מברשת.
   הערה: רפידות קצף עם ביצים גם ניתן להציב על עצים לצורך ביצי היקף גידול, אשר יכול להיות מועילות במיוחד באזורים בהם רמת הנגיעות נמוכה.

5. הקרנה בקנה מידה התנגדות של שתילי עציצים או שתלי

1. לבדיקה, בחר עצים בעציצים בקוטר מינימאלי של 1 סנטימטר (קליפר 5 ס"מ מעל קו אדמה) שהם גבוהים מספיק כדי לקבל לפחות 2 רפידות מבחן נפרדות מוטלות עליהם. לגזום צד סניפים קטנים בעת צורך כדי לפנות מקום לרפידות המבחן.
2. השתמש במיקרוסקופ לנתח לספור את 150 ביצים ולפזר אותם על פני חתוך ולח 2.5 x 7.6 x 1.3 סנטימטר תיקים עשויים לפתוח תאיםמשטח קצף Lene.
3. להדביק משטח הקצף לשתיל עם צד הביצה נגד לנבוח, באמצעות חוט מצופה פלסטיק. לעטוף את הריבוע קטן של הבית לעטוף סביב השתיל בדיוק מעל הקצף ולאטום אותו עם סיליקון מבוסס אצטט (ראה איור 6 א).
4. כולל ידוע משפחות שתיל רגישות או שתלי שולטת.

6. איסוף נתונים

הערה: כ 52-57 שבועות לאחר הצבת כריות הקצף וביצים על עצי הבדיקה, ניתן לאסוף נתונים. זה חשוב כי זה לא נעשה עד לאחר המבוגרים החלו להטיל ביצים, כך שהיכולת שלהם להתרבות ניתן לקבוע. על כמה עצים עמידים זה לא יוצא דופן לראות מספר קטן של מבוגרים להקים אך ללא רבייה מתרחשת.

1. מוציא בזהירות את משטח הקצף ולספור את מספר הכנימות למבוגרים שהוקמו על הקליפה באמצעות יד או עדשת זכוכית מגדלת (10X).
2. כאשר משטח הקצף מוסר, זה לא uncommon לחלק ממבוגרים ורוב אשכולות ביצה שהוריד מהעץ עם הקצף (ראה איור 7). באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור את אשכולות הביצה ומבוגרים שנשארו מחובר למשטח הקצף.

תוצאות

איור 6 מראה שתיל עמיד (C) ושני שתילים רגישים (D, E) המציג דרגות שונות של רגישות. דוגמא למה שעץ בוגר רגיש נראה כמו 57 שבועות לאחר בדיקת נגיעות המלאכותית הוקמה מוצגת באיור 5. כשהקצף התקלף מהעץ, זה לא נדיר עבור כנימות ואשכולות הביצה שלהם כדי...

Discussion

הנדרשים להצלחה של assay זה השלבים הקריטיים כוללים ביצוע בדיקת כדאיות על הביצים והשימוש בפקדים רגישים בכל אתר נבדק, ועם חומרים בעציצים. חשוב גם להשתמש בכרית מבחן יותר מפעם אחת לכל עץ או שתיל. מצאנו כי גם בשטח והן בבדיקות מבוקרות יותר על עציצים, מקור תכוף של טעות יכול להיו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nylon Mesh Sheet, 250 micron	Small Parts	CMN-0250-D	Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1
Tyvek Home Wrap	DuPont	D1349991	9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half.
Polyethylene foam, ½” thick	Columbus Foam Products		2 ft x 50 ft roll
MetroMix 510	Sun Gro Horticulture		2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone.
Osmocote Plus 15-9-12	Everris	E903206	Standard 3-4 month release
Sight Savers 10X	Bausch & Lomb	813434	10X magnification illuminated coddington
Nikon Mini Field Stereoscope	Nikon	7314	20X magnification
Silicone II clear	GE	159538	2.9 oz clear window & door caulk