הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Summary

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

Abstract

עוברי דג הזברה הם כלי רב עוצמה להקרנה בקנה מידה גדולה של מולקולות קטנות. דג הזברה מהונדס המבטאים את חלבוני כתב ניאון משמש לעתים קרובות כדי לזהות כימיקלים המווסתים את ביטוי הגנים. מסכי כימיים שassay הקרינה בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכים על ציוד יקר, מיוחד להקרנת תוכן גבוה. אנו מתארים הליך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence רגיל עם במה ממונעת באופן אוטומטי לעוברי דג הזברה תמונה ולזהות הקרינה רקמות ספציפיות. שימוש בדג זברה מהונדס שלדווח על פעילות קולטן אסטרוגן דרך ביטוי של ה-GFP, פיתחנו הליך חצי אוטומטי למסך לligands קולטן אסטרוגן המפעיל את הכתב באופן רקמות ספציפיות. בסרטון זה אנו מתארים נהלים לעריכת עוברי דג הזברה ב24-48 שעות שלאחר הפריה (hpf) בצלחת 96 היטב והוספת מולקולות קטנות אשר נקלטות קולטני אסטרוגן. ב72-96 hpf, תמונות של כל אחד גם מכל הצלחת באופן אוטומטי שנאספו ונבדקה באופן ידני לקרינת רקמות ספציפיות. פרוטוקול זה מדגים את היכולת לזהות אסטרוגנים המפעילים קולטנים במסתמי לב, אך לא בכבד.

Introduction

דג הזברה מהונדס פותחו המאפשרת הדמיה הישירה של פעילות במסלולי איתות, כגון צמיחת פיברובלסטים גורמי ^1, חומצה רטינואית ² ואסטרוגנים ^3, בעוברים בשידור חי. כלים אלה מאפשרים הקרנה של כימיקלים שיוצרים הפרעת מסלולי איתות (assayed כשינוי בעוצמת הקרינה) או לכימיקלים המווסתים איתות באופן רקמות ספציפיות (שינוי בלוקליזציה הקרינה) ^4. לכידת תמונה אוטומטית מגדילה את התפוקה של מסכי כימיים באופן דרמטי ^5,6. מסכים שהקרינה באופן אוטומטי assay בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכת על ציוד יקר, מיוחד. מה שנקרא גבוה הקרנת תוכן מספקת את היתרון של רזולוציה גבוהה, הדמיה כמותית אך במחיר של שימוש בקוראי צלחת מיוחדים מצוידים למיקרוסקופיה confocal ^7,8. מטרתה של שיטה זו היא באופן אוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות assay בעוברי דג הזברהבצלחת 96 היטב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence סטנדרטי. הקרינה רקמות ספציפיות ניתן להבחין באמצעות טכניקה זו ועלולה להיות גישה סבירה למעבדות שאין גישה לקוראי צלחת מיוחדות או ציוד גבוה הקרנת תוכן.

בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהדמיה אוטומטית כדי לזהות קולט רקמות ספציפיות אסטרוגן (ER) אגוניסטים בדג הזברה לחיות ב3 ימים לאחר הפריה (DPF). הקו המהונדס Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 מכיל 5 רצפי טנדם תגובת אסטרוגן אלמנט ה-DNA (ERE) במעלה הזרם של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ^3. בהעדר ליגנד, מיונים הם בדרך כלל לא פעילים. ליגנד מחייב מעורר שינוי קונפורמציה, המאפשר הקולטנים להיקשר ERE-DNA ולווסת את השעתוק ^9. 5xERE: ניתן להשתמש בדגים GFP למסך ספריות כימיות למאפנני ER ויכולים לשמש מסך דגימות מים סביבתיים למזהמים אסטרוגניים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית ברמינגהאם.

1. רבייה דג הזברה ואוספי ביצה

1. שלושה ימים לפני תחילת חשיפה לחומרים כימיים, להרכיב טנקי רבייה עם חוצצים לזכרים ונקבות נפרדים. ממלא כל מחצית הדרך מיכל עם מים מערכת חקלאות ימית. שימוש ברשת, להעביר Tg (5xERE: GFP) דגי ^c262/c262 לטנקים רבייה, הצבת 2 זכרים ונקבות 3 בכל אחד טנק מופרד על ידי מחיצה. מניחים את המכסה על כל טנק ותווית עם תאריך וזנים שחצו.
2. למחרת בבוקר, להסיר את כל המחסומים והטיה מתסכלת ליצור אזור רדוד בקצה אחד של מיכל הרבייה. לאפשר דג הזברה להזדווג, איסוף עוברים ב10 מרווחי דקות כדי להבטיח היערכות התפתחותית מדויקת. ביצים נקיות על ידי שטיפה דרך מסננת תה באמצעות מדיום E3B ועוברים בעדינות סומק לצלחות פטרי. חזור דגים בוגרים לקבועיםטנקים.
3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, למיין, לספור, והסר את כל עוברים מופרים, נורמליים או פגומים. עוברי מקום בצלחות פטרי במדיום E3B ובית ב28.5 ° C עם אור 14:10: מחזור כהה. צפיפות עובר יכולה להשפיע על התפתחות. מניחים לא יותר מ 100 עוברים בצלחת מ"מ 100 x 35 ולא יותר מ 50 עוברים בצלחת מ"מ 60 x 15.
4. על ידי 24 hpf, להחליף מדיה עם E3B מכיל 200 1 מיקרומטר-פניל 2-thiourea (PTU). PTU מונע היווצרות פיגמנט ושומר על עוברי דג הזברה וזחלים שקופים לבהירות תמונה משופרת. זהירות: מניית PTU מרוכזת היא מסוכנת; ללבוש כפפות בעת ביצוע פתרון E3B + PTU.
5. ביום 1 לאחר ההפריה (DPF), להסיר באופן ידני את סיסי מכל עובר באמצעות מלקחיים בסדר. סיסי אינו מופיע כדי להשפיע על חדירה של אסטרוגנים, עם זאת ההסרה משפרת את בהירות תמונה. אין צורך להסיר את chorions מהתקשורת. הערה: כחלופה לdechorionation הידני, ניתן צ'ה קבוצות של עובריםmically dechorionated באמצעות 1 מ"ג / מיליליטר pronase טיפול, כפי שתואר ¹¹ בעבר.

2. טיפול הכימי של עוברים

1. היום לפני הטיפול, להכין פתרונות מניות של כל כימי בריכוז של פי 1,000 בDMSO (או ממס מתאים). לדוגמה, כדי לחשוף את העוברים ל10 יספנול מיקרומטר (BPA), להכין פתרון מניות 10 מ"מ BPA ב100% DMSO. זה מבטיח ריכוז DMSO אחיד בכל טיפול ומאפשר 1:1,000 דילול רעיל של DMSO לשמש כשליטה ברכב. פתרונות מניות חנות ב -20 ° C. עבור פרוטוקול זה, עוברים יהיו חשופים ל1 מיקרומטר ומיקרומטר 10 BPA, 18.5 ננומטר ו1.85 מיקרומטר גניסטאין, 367 אסטרדיול ננומטר (בקרה חיובית) ורכב (DMSO 0.1%, בקרה שלילית).
   זהירות: כימיקלים כגון BPA ואסטרדיול הם מסוכנים ויכולים להיות השפעה מזיקה על העובר האנושי. ידית משבשים האנדוקרינית בזהירות ותמיד להשתמש בציוד מגן אישי מתאים.
2. ביום של טיפול, הפשרה הכינה פתרונות כימיים מניות. לדלל 1:1,000 ידי pipetting 1 מיליליטר E3B + PTU לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge והוספת 1 μl של תמיסה כימית מניות. וורטקס במרץ. לדלל DMSO 1:1,000 לE3B + PTU כמו שליטה ברכב. השתמש 1 מ"ל E3B + PTU בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר כביקורת שלא טופלה.
3. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק גדולה נשא, עוברי העברה מצלחות פטרי לבאר כל צלחת 96 היטב, 3 עוברים לכל טוב, 3 בארות לכל מצב. על מנת למנוע אידוי במהלך טיפול ממושך, להשמיט עוברים משורות ועמודות חיצוניות של הצלחת (שורות ו-E, עמודות 1 ו 12). יכולות להיות מלאות בארות חיצוניות עם 300 μl של E3B + PTU. לתייג את המכסה הצלחת כראוי.
4. הסר את המדיה מכל טוב עם פיפטה העברה פלסטיק קנס הטתה. לעבוד במהירות כדי למנוע התייבשות העוברים.
5. הוסף 200 μl של פתרון טיפול למתאים היטב. מניחים את המכסה underneath הצלחת כמדריך כדי להבטיח תוספת של טיפולים לתוך הבארות המתאימות. מערבולת צינור אחד לפני pipetting להפיץ הכימי בתמיסה. חזותי לאשר כל עובר הוא בפתרון הטיפול. אם הם עוברים בצד של הבאר, השתמש pipet העברה נקי כדי לשטוף אותם לתוך הבאר עם פתרון הטיפול.
6. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 28.5 ° C. עוברים ינותחו לקרינה ב72 hpf.

3. אוטומטית הדמיה של עוברים בצלחות 96 היטב

1. הרדימי עוברים על ידי הוספת 10 μl של 4 מ"ג / מיליליטר tricaine היטב כל אחד.
   הערה: הרדימי עוברים לפני ההדמיה. ב24-96 hpf, דג הזברה תערוכת תנועה ספונטנית ותגובה בהלה למקור האור משתנה במהלך לכידת תמונה. הרדמה עובר מפחיתה את התנועה במהלך הדמיה.
2. מניחים את צלחת 96, גם בשלב הממונע ולכייל את הבמה. באמצעות Zeiss זן הכחול 2011 תוכנה לאוטומצית מיקרוסקופיהובבקרה, בחר באפשרות ספק מדגם ובחר 96 multiwell. בחר לכייל. בצע את ההוראות בשלבים לכייל את הבמה.
   הערה: אל תסיר את סימון כפתור האריחים לאחר שלב זה. אם לחצן האריחים אינו מסומן, הגדרות כיול עלולות ללכת לאיבוד וצלחת 96 היטב תהיה צורך recalibrated.
3. באמצעות 10x אובייקטיבי וbrightfield (BF) הגדרה, לזהות עובר בקרה חיובי ולהגדיר הגדרות חשיפה הולמת לBF וערוצי ה-GFP, ולוודא כי אות הקרינה לא להרוות את המצלמה. התמקד בעובר יחיד ולתכנת את מיקרוסקופ כדי לרכוש 3 Z-סעיפי סך הכל, תמונה אחת 50 מיקרומטר לעיל ואחד 50 מיקרומטר מתחת למישור המוקד הנוכחי.
   הערה: מאחר שרקמות שונות לכבוש מטוסי מוקד שונים, זה יבטיח שלכל תמונות דג הזברה שנתפסו עם הלב וכבד בפוקוס.
4. להגדיר את הפרמטרים בתוכנה כדי לרכוש תמונת רעפים באמצעות GFP וchanne BFls. תחת לשונית הרכישה, בחר התקנה מתקדמת. אזורי אריח בחרו, אז אריחים. בחרו את האפשרות גם המעגל.
   הערה: אריח משמש ליצירת תמונה מורכבת של כל אחד. שדה ראייה של יחיד לוכדת רק חלק קטן מכל אחד. פונקצית הריצוף יכולה באופן אוטומטי ללכוד מרובה סמוכה משדות של נוף כל טוב, ויוצרת תמונה מורכבת של כל כן. ניתן, אפוא, כדי ללכוד באופן אוטומטי 96 תמונות משולבות לכל צלחת, שבו כל תמונה מורכבת מכילה כמה עשרות תמונות בודדות מבאר אחת.
5. בחר ספק ולמלא גורם 90%. בחירת גורם מילוי של 90% יהיה ללכוד מספר תמונות של הבארות שנבחרו כך ש90% מהשטח של כל אחד גם יהיו גלויים בתמונה המורכבת.
   הערה: בעת בחירת גורם מילוי, תרשים יוצג מייצג את האזור להיות צילם. בחר אחוז שיכלול את האזור היטבמתאים לניסוי.
6. תחת אפשרויות, בחר את מידת חפיפה הרצויה.
   הערה: כאשר תופרים יחד אריחים לתמונת נציג יחיד, חפיפה של 5-10% מאפשרת תפר חלק בין תמונות. עם זאת, אם תפרים תמונה הוא מיותרים, באמצעות חפיפה 0% יפחית את זמן הדמיה. שימוש 90% גורם מילוי וחפיפה של 5%, תמונה מורכבת של גם אחת מורכבת מ59 תמונות בודדות.
7. להתחיל הדמיה. מיקרוסקופ באופן אוטומטי לרכוש תמונות.
8. באופן ידני לבדוק תמונות משולבות של כל טוב לקרינת רקמות ספציפיות (איור 1).
9. הערה: עדיף להתחיל עם הביקורת החיובית כדי לאשר שהחשיפה הכימית עבדה לפני התבוננות בארות טיפול ניסיוני.

4. לכידת תמונה ידנית של עוברים בצלחת 96 היטב

הערה: כדי לאשר את התוצאות, השתמש מטרת 20x מרחק עבודה ארוכה לacמקהלת תמונות מפורטות יותר באופן ידני (איור 2).

1. באמצעות 20x אובייקטיבי וbrightfield (BF) הגדרה, לזהות עובר בקרה חיובי ולהגדיר הגדרות חשיפה לערוצי BF ו-GFP כראוי, ולוודא כי אות הקרינה לא להרוות את המצלמה.
2. לזהות עוברי אדם וללכוד תמונות באופן ידני.
   הערה: ברגע שהגדרות החשיפה נבחרו לעובר השליטה החיובי, אינו משנה את ההגדרות. זה מאפשר השוואה של עוצמת הקרינה כמו כל תמונה שנתפס בתנאים אחידים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מציג תמונות מרוכבים מבארות בודדות של צלחת 96 היטב. כל תמונה מורכבת מורכבת מ59 תמונות בודדות עם 5% חפיפה תמונה. שים לב שדג הזברה לחיות מכוונים באופן אקראי בתוך כל טוב, אך אנו מסוגלים להבחין הקרינה בלב מהכבד. תמונות brightfield שימושיות כמו אזכור להעריך נטייה דג ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לאוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות תמונה בעוברי דג הזברה. הפרוטוקול פותח באמצעות Zeiss Axio אובזרוור. Z1 עם תוכנת זן 2011 כחול, עם זאת הטכניקה יכולה להיות מותאם באמצעות כל מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת ותוכנת שליטת מיקרוסקופ שיכול לבצע ריצוף כדי ליצו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water