Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Özet

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Özet

Zebrafish embriyolar küçük moleküllerin büyük ölçekli tarama için güçlü bir araçtır. Floresan haberci proteinleri eksprese eden transjenik zebra balığı sıkça, gen ekspresyonunu modüle eden kimyasal tanımlamak için kullanılır. Canlı Zebrafish floresan tahlil Kimyasal ekranlar genellikle yüksek içerik tarama için pahalı, özel ekipman güveniyor. Biz, bir motorlu kaide otomatik görüntü zebra balığı embriyolar için olan standart bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak bir prosedür tarif ve dokuya özel floresan tespit eder. GFP ekspresyonu üzerinden östrojen reseptörü aktivitesi rapor transgenik zebrafish kullanarak, bir dokuya-özgü şekilde raportör aktif östrojen reseptör ligandları taranması için bir yarı-otomatik bir prosedür geliştirilmiştir. Bu videoda, 96 oyuklu bir plaka içerisinde 24-48 saat sonra döllenme (HPF) at zebra balığı embriyolar arraying ve östrojen reseptörlerine bağlanan küçük moleküller eklemek için işlemleri tarif eder. 72-96 hpf, her görüntüleri kuyudantüm plaka otomatik olarak toplanan ve el doku-spesifik floresan için denetlenmektedir. Bu protokol, ancak karaciğer, kalp valfleri reseptörlerinin aktive östrojen algılama yeteneği göstermektedir.

Giriş

Transgenik zebra balığı gibi fibroblast büyüme ^1, retinoik asit ² faktörleri ve canlı embriyolar, ^3, östrojen gibi sinyal yolaklarına aktivite doğrudan görselleştirme için izin geliştirilmiştir. Bu tür araçlar (flüoresan yoğunluğundaki değişim olarak analiz) sinyal yolları bozmakta ve kimyasal ya da dokuya özel bir şekilde, ⁴ (floresan lokalizasyonunda değişim) olarak işaret modüle maddeler için tarama sağlar. Otomatik görüntü yakalama dramatik ^5,6 kimyasal ekranların verimini artırır. Canlı Zebrafish otomatik tahlil floresan genellikle pahalı, özel ekipman güveniyor Ekranları. Sözde yüksek içerik tarama yüksek çözünürlük, sayısal görüntüleme ama konfokal mikroskopi ^7,8 donanımlı özel plaka okuyucu kullanarak maliyetle yarar sağlar. Bu yöntemin amacı, zebra balığı embriyolar otomatik olarak analiz dokuya özel floresan etmektirStandart bir epifluorışıma mikroskobu kullanılarak 96 oyuklu bir plaka içerisinde. Doku spesifik floresan bu tekniği kullanarak ayırt edilebilir ve özel plaka okuyucu veya yüksek içerik tarama donanımları ulaşamadıkları laboratuvarlar için makul bir yaklaşım olabilir.

Bu protokol, biz 3 gün sonra döllenme (DPF) doku-spesifik östrojen reseptörü (ER) canlı zebrabalıkları agonistleri algılamak için otomatik görüntüleme kullanın. Transgenik satır Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 yeşil floresan protein (GFP) akış yukarı 5 tandem östrojen tepki elemanı DNA dizileri (ERE) içeren ^3. Ligandın yokluğunda, ER normal olarak etkin değildir. Ligand bağlayıcı bir reseptör ERE DNA bağlama ve transkripsiyonu düzenleyen ⁹ sağlayan uygun bir değişiklik başlatır. 5xERE: GFP balık ER modülatörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için kullanılabilir ve östrojenik kirletici maddeler için çevre su örnekleri taranması için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokol Birmingham Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi de Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1.. Zebra balığı Yetiştiriciliği ve Yumurta Koleksiyonlar

1. Üç gün kimyasal maruz başlamadan önce, ayrı erkek ve kadınlar için bölücüler ile üreme tankları monte. Yetiştiricilik sistemi su ile her bir tank yarıya doldurun. Bir bölücü ayırarak her tankta 2 erkek ve 3 kadın yerleştirerek, üreme tanklarında ^c262/c262 balık: Bir ağının kullanılması, Tg (GFP 5xERE) aktarmak. Her tankın üzerinde bir kapak yerleştirin ve tarih ve çapraz olmak üzere suşları ile etiket.
2. Ertesi sabah, bütün engelleri kaldırmak ve eğim üreme tankının bir ucunda sığ bir alan yaratmak için perdeler. Zebra balığı kesin gelişimsel evreleme sağlamak için 10 dk aralıklarla embriyolar toplama, çiftleşmek için izin verin. Petri kapları içine E3B orta ve nazikçe yıkayın embriyolarını kullanarak bir çay süzgeci ile durulayarak temizleyin yumurta. Kalıcı yetişkin balık dönüntanklar.
3. Diseksiyon mikroskop kullanarak, sıralama, sayma, ve herhangi bir, döllenmemiş anormal veya hasarlı embriyolar kaldırmak. Karanlık döngüsü: 14:10 ışık ile 28.5 ° C'de E3B orta ve evde Petri kapları içinde yer embriyolar. Embriyo yoğunluk gelişimini etkileyebilir. 60 x 15 mm tabak içinde bir 100 x 35 mm tabak en fazla 100 embriyolar ve en fazla 50 embriyolar yerleştirin.
4. 24 hpf tarafından, 200 uM 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren E3B ile medya değiştirin. PTU pigment oluşumunu önler ve zebra balığı embriyolar ve gelişmiş görüntü netliği için şeffaf larva tutar. DİKKAT: konsantre PTU stok tehlikelidir; E3B + PTU çözüm yaparken eldiven giyin.
5. 1 gün sonrası döllenme (DPF), elle ince forseps kullanarak her embriyo koryon çıkarın. Koryon östrojenlerin penetrasyonu etkileyecektir görünmüyor, ancak kaldırma görüntü netliğini artırır. Medyadan chorions kaldırmak için bir ihtiyaç vardır. Not: el Dechorionation için bir alternatif olarak, embriyo toplu che edilebilir^11, daha önce tarif edildiği gibi mically, 1 mg / ml pronaz tedavi ile dechorionated.

Embriyoların 2. Kimyasal Arıtma

1. İşlemden önceki gün, 1000-kat DMSO konsantrasyonu (ya da uygun bir çözücü) her kimyasal stok çözelti hazırlayın. Örneğin, 10 uM, bisfenol A (BPA) için embriyolar maruz% 100 DMSO içinde bir 10 mM stok solüsyonu BPA hazırlamak. Bu, her bir tedavi muntazam bir DMSO konsantrasyonu sağlar ve DMSO içinde, toksik olmayan bir 1:1000 seyreltme, bir vasıta kontrolü olarak hizmet sağlar. -20 ° C'de Mağaza stok çözümleri Bu protokol için, embriyolar 1 ve 10 uM BPA, 18.5 nM ve 1.85 mcM genistein, 367 nM östradiol (pozitif kontrol) ve araç (% 0.1 DMSO, negatif kontrol) maruz kalacağı.
   DİKKAT: BPA ve östradiol gibi kimyasallar tehlikeli ve insan fetus üzerinde zararlı etkileri olabilir. Dikkatle endokrin bozucular Kulp ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
2. Tedavi gününde, çözülme hazır kimyasal çözeltiler hazırlanabilir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 1 ml E3B + PTU pipetlenerek ve stok kimyasal çözelti 1 ul ekleyerek 1:1,000 sulandırmak. Vortex şiddetle. Bir vasıta kontrolü olarak E3B + propiltiyourasil'i içine DMSO 1:1000 seyreltin. İşlem yapılmamış bir kontrol olarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1 mL E3B + PTU kullanın.
3. 96 oyuklu bir plakanın her bir geniş çaplı plastik bir transfer pipeti, Petri tabaklarına transfer embriyolar kullanılarak, embriyolar per 3 de, durum başına 3 kuyu. Uzun süreli tedavi sırasında buharlaşmasını önlemek için, plakanın dış satırlar ve sütunlar (satırlar A ve E, kolon 1 ve 12) 'dan embriyolar sayın. Dış kuyu E3B + PTU 300 ul ile doldurulabilir. Uygun plaka kapağı etiketleyin.
4. Ince uçlu bir plastik transfer pipet ile her kuyu bulunan ortamı çıkarın. Embriyoların kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.
5. De karşılık gelen muamele çözeltisinin 200 ul ekleyin. Unde kapağı yerleştirinuygun kuyulara ilave tedaviler sağlamak için bir kılavuz olarak plaka rneath. Vortex her tüp çözelti içinde kimyasal dağıtmak için pipetleme önce. Görsel olarak, her embriyo muamele çözeltisi içinde olduğunu teyit. Embriyolar kuyunun tarafında ise, muamele çözeltisi ile iyice içine yıkamak için temiz bir aktarma pipeti kullanın.
6. 28.5 ° C'de inkübatör plaka koyun Embriyolar 72 hpf floresan için analiz edilecektir.

96 oyuklu plakalar içinde Embriyolar 3. Otomatik Görüntüleme

1. Her bir oyuğa, 4 mg / ml tricaine 10 ul ekleyerek embriyolar anestezisi.
   NOT: önce görüntüleme embriyolar anestezisi. 24-96 hpf, zebra balığı kendiliğinden hareket ve görüntü çekimi sırasında değişen ışık kaynağına bir irkilme tepkisi gösterirler. Embriyoların anestezi görüntüleme sırasında hareket azaltır.
2. Motorlu aşamasında 96 oyuklu plaka yerleştirin ve sahne kalibre edin. Zeiss Zen Mavi mikroskopi Automati için 2011 yazılımı kullanmave kontrol, numune taşıyıcı seçeneğini seçin ve çukurlu 96 seçin. kalibre seçin. Sahne kalibre adım adım yönergeleri izleyin.
   NOT: Bu adımdan sonra kiremit düğmesini işaretini kaldırın etmeyin. Fayans düğmesi işaretli ise, kalibrasyon ayarları kaybolabilir ve 96-plaka yeniden kalibre edilmesi gerekir.
3. Ayarı (BF), 10x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, BF ve GFP kanallar için uygun pozlama ayarlarını. Tek embriyo odaklanın ve toplam 3 Z-bölümleri, yukarıda bir görüntü 50 mikron ve mevcut odak düzleminin altında bir 50 um elde etmek için mikroskop programlamak.
   NOT: Farklı dokular farklı odak düzlemleri işgal Çünkü her zebrabalıkları görüntüleri odak kalp ve karaciğer ile yakalanan için, bu sağlayacaktır.
4. GFP ve BF channe kullanarak bir kiremitli bir görüntü elde etmek için yazılım parametrelerini ayarlayınls. Satın alma sekmesi altında, gelişmiş ayarları seçin. Seç karo bölgeler, daha sonra fayans. Daire iyi seçeneği seçin.
   NOT: Fayans her oyuğa bileşik bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Tek bir alan-of-view her iyi sadece küçük bir kısmını yakalar. Fayans fonksiyonu otomatik olarak tüm kuyunun bir kompozit görüntü oluştururken, alanlar-görünümü her kuyudan birden fazla bitişik yakalayabilir. Her kompozit görüntü tek bir kuyudan birkaç düzine bireysel görüntüleri içeren nerede, otomatik olarak plaka başına 96 kompozit görüntüler yakalamak mümkündür.
5. Taşıyıcıyı seçmek ve faktör% 90 doldurun. % 90 dolgu faktörü belirlemek, her bir kuyunun alanının% 90, kompozit görüntüde görülebilir olacağı seçilmiş kuyucuklara birden fazla çekim olacaktır.
   Not: dolgu faktörü seçilirken, bir diyagramdır, görüntülenecek olan alanı temsil görüntülenecektir. Kuyunun alanını içerecek bir yüzdesini seçinbu deney için uygundur.
6. Seçenekleri altında, istenilen örtüşme miktarını seçin.
   NOT: Tek bir temsili görüntü için birlikte fayans Dikiş zaman,% 5-10 bir örtüşme görüntüleri arasında düzgün bir dikiş sağlar. Görüntü dikiş gereksiz Ancak,% 0 örtüşme kullanarak görüntüleme süresini azaltacaktır. % 90 dolgu faktörü ve% 5 üst üste kullanılarak, tek bir kuyunun bir kompozit görüntü 59 tek tek görüntü oluşur.
7. Görüntüleme başlayın. Mikroskop görüntüleri otomatik olarak kazanacaklardır.
8. Elle doku-spesifik floresan için de her kompozit görüntüler (Şekil 1) inceleyin.
9. NOT: Bu kimyasal maruziyet öncesinde deneysel tedavi kuyuları gözlemleyerek çalıştı onaylamak için pozitif kontrol ile başlamak en iyisidir.

96 oyuklu bir plaka içerisinde Embriyolar 4. Manual Resim yakalama

NOT: sonuçlarını onaylamak ac için 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanmak içinquire daha detaylı görüntüleri manuel (Şekil 2).

1. Ayarı (BF), 20x objektif ve aydınlık kullanarak, bir pozitif kontrol embriyo tespit ve floresan sinyal kamerayı doyurarak değil emin, uygun BF ve GFP kanalları için pozlama ayarlarını.
2. Elle tek tek embriyo ve yakalama görüntüleri tespit.
   NOT: pozlama ayarları pozitif kontrol embriyo için seçildikten sonra, ayarları değiştirmek yok. Her bir görüntü muntazam koşullar altında yakalanır gibi bu floresan yoğunluğunun bir karşılaştırma sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1, bir 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğinden bileşik görüntüleri gösterir. Her kompozit görüntü% 5 görüntü bindirme ile 59 ayrı görüntü oluşur. Canlı Zebrafish de her biri içinde rastgele odaklı, henüz biz karaciğer kalp floresan ayırt edebiliyoruz unutmayın. Zebra balığı aydınlık görsel yönünü belirlemek ve morfolojik anormallikleri (Şekil 1 A ve 1 C) görselleştirmek için referans olarak yararlıdır. 10x objektif kullanılarak otomatik g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, zebra balığı embriyolar otomatik görüntü dokuya özel floresan için basit bir yöntem tarif edilir. Protokol, bir Zeiss Axio Observer kullanılarak geliştirilmiştir. Z1 Zen Blue 2011 yazılım ile, ancak teknik kompozit görüntüler oluşturmak için fayans gerçekleştirebilirsiniz motorlu bir sahne ve mikroskop kontrol yazılımı ile herhangi bir ters mikroskop kullanılarak adapte edilebilir. Motorlu bir sahne ile ters bir mikroskop donatılması yüksek içerik tarama için özel ekipman sat?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water