אפיון של קשקשים דגים שכבתיים Multi-(<em&gt; מרית Atractosteus</em&gt;) באמצעות Nanoindentation, רנטגן CT, FTIR, וSEM

Summary

נייר זה מציג את השיטות המשמשות לחיטוט כימי מרחבית מתואמת, מבני, ותכונות מכאניות של קנה המידה רב שכבתית של מרית Atractosteus (מרית א ') באמצעות nanoindentation, התמרת אינפרא אדום ספקטרוסקופיה (FTIR), במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), וה-X ray טומוגרפיה ממוחשבת (CT רנטגן). תוצאות הניסוי שנעשו שימוש כדי לחקור את עקרונות העיצוב של חומרים ביולוגיים מגן.

Abstract

הארכיטקטורה ההיררכית של חומרים ביולוגיים מגן כגון סולמות mineralized דגים, קונכיות חילזון, הקרן של איל, קרן צבי, ושריון של צב מספקת עקרונות עיצוב ייחודיים עם פוטנציאל למנחה את העיצוב של חומרים ומערכות הגנה בעתיד. הבנת נכס מבנה היחסים למערכות חומר אלה במידה הזעירה וננומטרי שבו כישלון יוזם היא חיונית. נכון לעכשיו, ניסיוני בטכניקות כגון nanoindentation, CT רנטגן, וSEM לספק לחוקרים עם דרך, כדי לקשר בין ההתנהגות מכאנית עם microstructures ההיררכי של מערכות חומר אלה ^1-6. עם זאת, הליך סטנדרטי מוגדר היטב להכנת דגימה של חומרים ביולוגיים mineralized אינו זמין כרגע. במחקר זה, השיטות לחיטוט כימי מרחבית מתואמת, מבני, ותכונות מכאניות של קנה המידה רב שכבתית של א ' מרית באמצעות nanoindentation, FTIR, SEM, עם חדרergy-נפיצה microanalysis רנטגן (edx), ו-CT רנטגן מוצגים.

Introduction

חוקרים בודקים חומרים ביולוגיים מבניים ומנסים להבהיר את עקרונות עיצוב, המספקים חומרים ביולוגיים מבניים עם תכונות מכאניות משופרות, כגון קשיחות וחוזק בהשוואה למרכיבים האישיים שלהם הרבה יותר גבוהות. החקירות על עקרונות העיצוב של קשקשי דגים משוריינים לPagrus גדול ^7, Polypterus senagalus ^2,6, gigas Arapaima ^3, carpio Cyprinus ^4, ומרית Atractosteus ¹ הדגימו את הצורך להרחיב את היישום של שיטות ניסיוניות קיימות כדי ללמוד את התגובות המבניות ומאפייני microstructural, שכן נהלים סטנדרטיים מפורטים אינם זמינים עבור סוגים אלה של חומרים וניסויים.

בין קשקשי דגים המשוריינים השונים דנו, א מרית היא טורף מבחינה היסטורית שיא המרכזי בארה"ב ⁸ והיא מין עם גבוהקשקשי mineralized ly. חילופי מיני מסת שריר למסת עור כדי להשיג מערכת הגנת טורף משופרת בהשוואה לדגים בגודל דומה שהוזכרו בעבר ^9. לדברי פייג' ^ו10 בר, א ' מרית היא דגי מים מתוקים השלישי בגודלה בצפון אמריקה עם חדקן הלבן (transmontanus Acipenser) וחידקן האטלנטי (oxyrhynchus Acipenser) להיות מינים גדולים יותר. קשקשי דגי הפערים mineralized של א ' מריתם רק לאחרונה הנלמד. תומפסון ^ו11 מק 'קיון הציעו כי המורפולוגיה של קשקשי גאור יש לי הרכב שלוש שכבות מורכבות משכבה ganoine חיצונית, שכבת עצם מפוזרת, ושכבת עצם שבשבת. מחקר הנוכחי על א קשקשי מרית לא הבדילו את שכבת העצם לתוך מפוזר או אזורי עצם טבלית, אלא רק חקר את אזור העצם כשכבת פנימית אחת ^1,12.

במחקר זה, את הליכים בvestigating מיקרו, nanostructure, הרכבו כימי, והפצות המרחבית של התכונות מכאניות של הקשקשים של א ' מרית מבוססים על תוצאות של ספקטרוסקופיה FTIR, SEM, רנטגן CT, וטכניקות nanoindentation מוצגים.

Protocol

1. לדוגמא הכנת סולם דגים

במחקר זה, קשקשים התקבלו מצבא ארה"ב מהנדס מרכז מחקר ופיתוח (ERDC) הסביבה מעבדה באמצע אורך (עמודת 29 ^בזנב) מגאר הארוך כ 600 מ"מ (מרית א '). קשקשי הדגים התקבלו על פי מכון ERDC והלאומי לבריאות הנחיות טיפול בבעלי חיים (NIH).

1. חומרים
   רשום את המיקום המרחבי על הדגים של הקשקשים המתקבלים ללימודים. הקפד לדבוק בארגון המתאים או הנחיות ממשלתיות לקבלת דגימות ביולוגיות כגון הנחיות טיפול בבעלי חיים-NIH. אחסן את הכף למדיום מתאים כגון תמיסת מלח פוספט שנאגרו כדי לשמר את הלחות ולשמור על תכולת מינרלים ברגע שהם יוסרו מן הדגים. הימנע מאחסון ממושך שיכול לגרום לאובדן מינרלים, אשר עשוי להשפיע על נתוני nanoindentation. השתמש בינוני זיפי מברשת ולאweezers להסיר את כל רקמה רכה מהקשקשים קשים.
2. דגימת הרכבה וחתך
   בחינה רוחבי של סעיף הקצר הציר של סולם הדגים (איור 1), תוך שימוש FTIR וnanoindentation דורשת הרכבה ראשונה בקנה המידה בינוני נוקשה כגון אפוקסי שני חלקים המורכב של שרף ומקשה. השתמש epoxies RT למטרות כלליות ריפוי עם טמפרטורות שיא נמוכות כגון אפוקסי למטרות כלליות המסחרי המשמש במחקר זה שהיה בטמפרטורת שיא של פחות מ 55 ° C.

תמונות איור 1. CT רנטגן של א ' בקנה מידה מרית מתארת ​​את הסעיף הרוחבי קצר הציר נבדק במחקר זה של א ' מרית באמצעות nanoindentation וFTIR [(קדמי), P (אחורי), ד '(גב), V (הגחון)].

2. 1. החזק את קנה המידה הדגים בתבנית מדגם קוטר 32 מ"מ באמצעות בעל מדגם פלסטיק זמין מסחרי. הדבר זה שומר את הדגימה בכיוון נכון בעת ​​ההרכבה באפוקסי.
   2. , ברגע שהמדגם שנערך בעובש לשפוך אפוקסי הדפוק על המדגם ולאחר מכן לאפשר אפוקסי לרפא על פי הוראות היצרן.
   3. לאחר אפוקסי הוא נרפא, סעיף המדגם רכוב באמצעות דיוק גבוה חתך להב יהלום ראה על קו האמצע של המדגם.
   4. Sonicate במים מזוקקים ל15 דקות כדי להסיר כל פסולת מהדגימה.
3. פוליש לNanoindentation וFTIR
   כדי לקבל משטח שטוח חלק עבור nanoindentation כמתואר באיור 2, הליך הליטוש הבא והפרמטרים מוצעים מבוססים על דיונים עם ייצור לטש ודגימות בדיקה. עם זאת הפרמטרים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לחומרים ביולוגיים שונים המבוססים על תגובותכגון שיעורי הסרת חומר. Ultrasonication של דגימות באמבט של מים מזוקקים בין שלבי ליטוש הוא חיוני כדי להבטיח חלקיקים מגסי ליטוש צעד לא הוכנס לצעד עדין ליטוש שלאחר מכן.

איור 2. תמונה של א 'סעיף רוחבי קצר ציר מלוטש בקנה מידה מרית רכוב באפוקסי.

4. 1. פולני גס עם כרית 15 מיקרומטר SiC ומים כחומר סיכה עד המדגם הוא מטוס באמצעות כוח ראש הליטוש האוטומטי של 7 ליברות ומהירות של 200 סיבובים לדקה (סל"ד).
   2. Sonicate המדגם באמבט של מים מזוקקים ל15 דקות.
   3. פולני ביניים עם כרית 6 מיקרומטר SiC באמצעות חומר סיכה מים במהירות של platen 130 סל"ד וכוח של 7 ליברות ל5 דקות.
   4. Sonicate מדגם באמבט של מים מזוקקים ל15 דקות.
   5. פולני עם כרית 1 מיקרומטר SiC באמצעות חומר סיכה מים במהירות של platen 130 סל"ד וכוח של 7 ליברות למשך 5 דקות.
   6. Sonicate המדגם באמבט של מים מזוקקים ל15 דקות.
   7. ליטוש סופי עם השעיה 50 ננומטר colloidal סיליקה באמצעות כרית ליטוש מתאימה כגון צפיפות גבוהה פוליאוריטן, שאינו ארוגה, נמוכה תנומה נקבובית שיצרן מציע ל50 השעיות ננומטר. פולני במהירות של סל"ד 130 עם כוח של 7 ליברות למשך 5 דקות.
   8. Sonicate המדגם באמבט של מים מזוקקים ל15 דקות.

2. בדיקת Nanoindentation

1. לכייל את מערכת nanoindentation לפני כל אצווה של בדיקות לכל מייצר הנחיות. הכיול צריך לכלול קביעת פונקצית השטח של המערכת לקצה ברקוביץ' ומסגרת הנוקשות. בנוסף, לבצע כיול מיקרוסקופ לindenter בשלב זהעל מנת להבטיח את הכניסות מתואמות למקומות מיקרוסקופ בחרו.
2. טען את הדגימה לnanoindenter ולהשתמש בפקדי מיקרוסקופ האופטי על nanoindenter כדי להביא את המדגם אל מוקד.
3. השתמש בפקדי התוכנה כדי להעביר את הדגימה למיקום לכניסה הראשונה. באופן אידיאלי, זה הוא כ 10 מיקרומטר באפוקסי מהקצה של שכבת ganoine לאורך האמצע של החתך של קנה המידה.
4. לבצע 4 שורות מקבילות של כניסות במרווחי 15 מיקרומטר בנפרד כדי לקבל נתונים מובהקים סטטיסטי מוגדרים מתחילים במיקום זה. הגדר את nanoindenter לעומס מרבי של 5 מחירים MN, העמסה ופריקה של 0.1 mN / שנייה, זמן המתנה של 30 שניות, וריווח כניסה מינימאלי של 5 מיקרומטר עבור כל שורה. השורה של כניסות צריכה להיות התקנה לרוץ מאונך למשטח ganoine, ומספר מספיק של כניסות יש לציין לנסוע על פני חתך הרוחב של קנה המידה תוך התגברות על כ 10 מיקרומטר לepoxy עבר השכבה הגרמית.
5. כאשר אצווה הושלם, יש לי nanoindenter ליצור כניסות fiducial עם עומס מרבי של 100 mN בכניסה הראשונה ואחרונה, שאמור להיות באפוקסי לפני שכבת ganoine ואחרי שכבת העצם, בהתאמה. אלה תואמים לנקודות ההתחלה וסיום עבור כל שורה של כניסות.
6. לאחר nanoindentation, הנח את הדגימה חזרה בפתרון PBS כדי למנוע התייבשות נוספת.
7. השתמש בתוכנת nanoindentation כדי לקבוע את מודול ואת הקשיות המבוסס על שיטת אוליבר-פאר ¹³ אם תגובת חומרים בזמן העצמאי הוא ציין. אחרת אחיזה בזמן ייתכן שיהיה הצורך להאריך להתגבר השרץ נצפה מהפריקה מהר מדי.

3. ספקטרוסקופיה ATR-FTIR נפתר מרחבית

השימוש בשקופיות על ATR אבזר המצורף למיקרוסקופ FTIR הוא שיטה הציעה אחד לאסוף פורייה נפתרו מרחבית להפוך ספקטרום אינפרא אדום (FTIR) של להyers במדגם בקנה מידה דגים. אבזר ATR מאפשר לאוסף של ספקטרום באיכות גבוהה עם רזולוציה קטנה מאוד (~ 10 מיקרומטר ²⁾ במרחב, שאינה בר השגה בכל טכניקת FTIR אחרת. אותו מדגם מלוטש (איור 2) מוכן לניסויי nanoindentation שימש בניסויים אלה.

1. בחר מדגם עם משטח וממדים מתאים למיקרוסקופ FTIR בשימוש לניתוח על מנת להבטיח איכות גבוהה ספקטרום מתקבל spectromicroscopy ATR-FTIR.
2. הכן את המיקרוסקופ FTIR כדי לאסוף נתונים. microspectroscopy FTIR דורש כיול של אות FTIR באותם תנאי הדגימה כפי שמשמשים למדידת המדגם. בדרך כלל, זה כולל קירור הגלאי ומאפשר זמן לזה לייצוב, כמו גם לאסוף את כל ספקטרום הרקע וספקטרה מדגם תחת אותם התנאים סביבתיים. זה יכול להיות חשוב במיוחד, משום שאדים CO ₂ ומים באוויר יכול דramatically להשפיע ספקטרומי FTIR. כמו כן, חשוב לוודא כי האופטיקה של המכשיר מיושרות.
3. איסוף ספקטרום רקע מתאים ללחסר מדגם נגד. בניסויים אלה, שקופיות מיקרוסקופ מלוטשות, מצופה זהב שימשו כרקע לspectromicroscopy FTIR.
4. שימוש אובייקטיבי מתאים, להתמקד במדגם ובחר שטח של עניין לניתוח.
5. ברגע ששטח של עניין נמצא, לצרף אבזר ATR למטרת מיקרוסקופ FTIR, להעלות את המדגם עד שהוא יוצר קשר אינטימי עם אלמנט ההשתקפות הפנימי ATR, ולאסוף ספקטרום מדגם.
6. לאחר איסוף ספקטרומי FTIR, לבצע עיבוד נתונים הסטנדרטי הנדרש.

4. רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (CT)

1. להשיג ולהכין בקנה מידה כפי שפורט בסעיף 1.1
2. התקנת סורק
   1. חימום רנטגן המקור בהתאם למפרט של היצרן.
   2. סט רנטגן מתח וזרם ל50 ק ו160 μA, בהתאמה.
   3. להגדיר זמן חשיפה ל1,450 אלפיות שניים.
   4. בחר מסנן אלומיניום 1.0 מ"מ.
   5. לפני מדגם טעינה, לעשות תיקון שטוח שדה כאשר רנטגן המקור כבוי (כהה שדה) ועל (בהיר שדה).
3. דגימת הר וטען
   סולמות חייבים להיות מותקנים בצורה כל כך שהם לא להסיט או להעביר בכל אורכו של הסריקה. דגימות אלה גם חייבים להיות מותקנים תוך שימוש בחומרים שהם כמעט שקופים לקרן רנטגן. שילוב של קלקר וParafilm ניתן להשתמש בם כדי להבטיח את קנה המידה לשלב ה-CT.
   1. נוקשות הר המדגם, כך שהממד הארוך ביותר הוא במקביל לגלאי.
   2. Secure המדגם רכוב על הבמה של הסורק.
   3. מקם את המדגם, כך שהוא יהיה במרכז הסיבוב לאורך הסריקה.
   4. בחר ברזולוציה הגבוהה ביותר המאפשרת לכל קנה המידה להיות בשדה הראייה (FOV), במקרה זה 7.5 מיקרומטר.
4. הגדרות רכישה
   לבצע סריקות במחקר זה עם צעד סיבובי של 0.25 ° וערך מיצוע מסגרת של 15. אם רזולוציות נמוכות מקובלות, להגדיל את גודל הצעד ו / או להקטין את המסגרת בממוצע כדי לצמצם את זמן הסריקה הכולל.
5. פרמטרים לשיקום
   ברגע שערכת נתונים מתקבלת, לשחזר את תמונות הקרנת רנטגן כדי ליצור ערכת נתונים המכילה תמונות חתך. בחר הגדרות ברירת המחדל של תוכנת NRecon של Skyscan למעט הבא.
   1. שנה את תיקון הטבעת Artifact 20.
   2. שנה את תיקון Beam הקשחת 25%.
   3. התאם את CS סטטי הסיבוב לעשות ברמת תמונת חתך.
6. עיבוד תמונה
   השתמש בתוכנת CTAn של Skyscan להשיג את התמונה בגוונים אפורים 3D הסופי. התאם את מגוון אפור בקנה מידה לרמה מתאימה כדי להסיר את הממצאים מהקלקר וParafilm.

= "Jove_title"> 5. SEM הדמיה והניתוח edx

דגימות שהוכנו על ידי ליטוש לאפיון nanoindentation וmicro-/nano-structure נבדקו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). מצב נמוך ואקום נוצל כדי למזער את ההתייבשות של דגימות ואת הצורך ביישום של ציפויים מוליכים. ניתוח כימי מקומי בוצע על דגימות מלוטשות בשילוב עם ההדמיה SEM באמצעות ספקטרוסקופיית רנטגן באנרגיה נפיצה (edx). ניתוחי EDX בוצעו על אותו הקו / הרשת שנותחה על ידי nanoindentation על מנת לספק מתאמים בין תכונות כימיות ומכאניות. משטחים סדוקים טרי גם נבדקו על ידי SEM לספק מידע טוב יותר על המורפולוגיה והכיוון של מבני biomineralized הווה בקשקשי הדגים. כדי לשפר את הרזולוציה לתצפית של מבנה בקנה מידה ננו על משטחים שבורים, דגימות היו מצופים גמגום עם זהב (Au) והדמיה במצב ואקום גבוה. הבאמספק פרטים נוספים על הנהלים בשימוש.

1. ההדמיה SEM של משטחים מלוטשים
   1. הנח דגימה מלוטשת לתוך תא SEM ולשאוב תא למצב נמוך ואקום עם לחץ לשכת .1-0.5 mbar.
   2. התאם מרחק עבודה כ 5.0 מ"מ.
   3. הפעל מתח גבוה (HV) ולנווט לאזור של עניין על דגימה הכולל את אזור המעבר בין sublayers ganoine והגרמי או באזורים אחרים של עניין.
   4. להשיג תמונות ב15 HV ק וקרן הנוכחי של כ 3.9 NA.
   5. פוקוס תמונה ולבצע את כל מערכים נחוצים והתאמות stigmation.
   6. צלם תמונות מלפחות שלושה אזורים של עניין בהגדלה רלוונטית (בדרך כלל 250X ל10,000 X) באמצעות האלקטרונים backscattered הנמוך ואקום הגלאי (BSE), כדי לסייע בזיהוי של שינויים בתוכן ובצפיפות biomineral (כלומר עצם, צפוף לעומת עצם נקבובי ).
2. SEM הדמיה של משטחים סדוקים
   1. תצמיד את הדגימה טרי שבר לבדל 90 ° SEM באמצעות קלטת דו צדדית פחמן עם המשטח שבר כלפי מעלה.
   2. גמגום מעיל עם Au כדי לספק שכבת מוליך עבה תת ננומטר על פני השטח שבר.
   3. הנח דגימה לתוך תא SEM ולשאוב תא למצב ואקום גבוה.
   4. התאם מרחק עבודה לבין 3.0 ו5.0 מ"מ.
   5. הפעל HV ולנווט לאזורים של עניין על הדגימה. אזורים העיקריים של עניין במקרה זה היו הווה המבנה בשכבות ganoine וגרמי.
   6. להשיג תמונות שבבין ק ו 5 ו15 HV ק וקרן נוכחית נמוכה יותר של 0.24 Na כדי לשפר את הרזולוציה.
   7. בתחילה יתמקד דגימה ולבצע יישור ראשוני.
   8. עליית ההגדלה ל X גדול מ 5,000 ו לעבור עדשת פליטת שדה רגילה לטבילה / רזולוציה גבוהה במיוחד עדשה (UHR).
   9. לבצע יישור UHR והתאמות stigmation.
   10. צלם תמונות מלפחות שלושה אזורים oריבית ו בהגדלה רלוונטית (בדרך כלל 5,000 X כדי 250,000 X) באמצעות באמצעות גלאי עדשה (TLD) פעלו בשני אלקטרונים במצב (SE).
3. הניתוח edx של משטחים מלוטשים (בוצע בשיתוף עם ההדמיה SEM). פרמטרים אלה תלויים בחומר ויהיה צריכים להיות מותאמים כך EDX האינטראקציה הנפח דומה בגודלו לאינטראקציה nanoindentation הנפח כפי שנדונו על ידי ¹⁴ מוזר.
   1. נווט לאזור של עניין בדגימה מלוטשת הכולל רשת nanoindentation מסומנת על ידי סימני fiducial בסוף כל שורה של כניסות.
   2. ודא HV הוא לפחות 15 KV, קרן נוכחית הוא לפחות 3.9 NA, ומרחק עבודה גדול יותר מ5.0 מ"מ.
   3. לכידת תמונת BSE של האזור שנותח באמצעות EDX.
   4. שימוש בתוכנת ניתוח edx, ללכוד את אותה תמונה כדי לסייע באיתור שטחים לביצוע אנליזה כימית לאורך הקו של כניסות.
   5. באמצעות "ניתוח הקו" הטכניקה, פוsition קו לבצע אנליזה כימית לאורך הקו של ריבית בשיעור של כניסות החל מהכניסה הראשונה ומסתיים בכניסה האחרונה.
   6. ציין את מספר נקודות ניתוח כדי להיות ממוקם לאורך הקו. עדיף להשתמש באותו מספר נקודות ניתוח והכניסות שנמצאות לספק מתאם המרחבי ישיר בין הרכב הכימי ותכונות מכאניות.
   7. כאשר הקו מוצב ונקודות שצוינו בצורה נכונה, ליזום את ניתוח הקו באמצעות תוכנת EDX.
   8. כאשר ניתוח הקו הושלם, לזהות אלמנטים של עניין ללכמת מספקטרום הנקודה שהושג לאורך הקו שצוין על פני השטח המלוטשים של הדגימה.
   9. ברגע שאלמנטים של עניין מזוהים, לבצע כיול רקע כדי להסביר את קרינת Bremsstrahlung ואפקטים אחרים.
   10. בחר באפשרות ניתוח deconvolution של התוכנה כדי לקבל ניתוח כמוני בכל נקודה לאורך הקו שצוין לקוואןתצדיק את ההרכב הכימי בכל נקודה.
   11. שמירת תוצאות אנליזה כימית כמותית יחד עם התמונה של קו שצוין שנותח כדי לסייע במתאם המרחבי עם תכונות מכאניות נמדדו באמצעות nanoindentation.

תוצאות

איור 3 מתאר את התוצאות הממוצעת של מרחבית המתואמת nanoinidentation / SEM / EDX ניתוחים שנערך על פני הציר הקצר שאורכו כ 800 מיקרומטר רוחבי חתך. בשכבה העבה ganoine כ 60 מיקרומטר, nanoindenter מחושב מודול ממוצע של 69.0 GPA וקשיות של 3.3 GPA. Nanoindenter נקבע מודולוס של 14.3 GPA וקשיות של 0.5-GPA ממוצע לשכבת העצם העבה כ 740 מיקרומטר.

EDX נקבע פחמן, חמצן, סידן, וזרחן, הנמצאים בדרך כלל בסולמות mineralized. עם זאת, שכבות ganoine והעצם הכילו הבדלי כימות בהרכבים כימיים. ספייק פחמן נצפה בשכבת העצם עשוי להיות מיוחס לאזור זה לא להיות כמו mineralized מאוד, וכתוצאה מכך עלייה קלה בפחמן שגם גרמה לירידה שנצפתה בבהירות כוללת של תמונת BSE. באופן ספציפי, את שכבת ganoine '; ים מתכוון יחס ריכוז אטומי של Ca: P של 1.71 הופיע דומה לhydroxyapatite עם יחס תיאורטי של 1.67. Ca הממוצע של שכבת העצם: יחס P ירד ל 1.51 קיטון בסך של מינרליזציה משיכבת ganoine.

ספקטרומי FTIR באיור 4 לשכבת העצם ושכבת ganoine זיהו את הקבוצות פונקציונליות העיקריות כאמיד, קרבוקסיליות, פוספט, וקרבוניל. באופן ספציפי, FTIR אישר את התצפית ויזואלית של חתימות hydroxyapatite בחתימות שכבה החיצונית (ganoine) וקולגן בשכבה הפנימית (עצם). פסגות ב3,500-3,000 ^-1 סנטימטר עקב NH מתיחה וNH כיפוף בין 1,550 ו -1,500 ^-1 סנטימטר מייצגות קבוצות אמיד בשכבת העצם. פסגות באזור של מספר גל 1,470-1,365 ^-1 סנטימטר מייצגות קבוצות אלקיל אמיד להחליף. בנוסף, C = O ייחודי המשתרע על 1,641 סנטימטר ^-1 נצפה על שכבת העצם. אפונהKS מ3,000-2,500 ^-1 סנטימטר מייצג קבוצות קרבוקסיליות. ספקטרה 'שכבות שני העצם וganoine הופקה שיא ייחודי ליד 1,079.33 ^-1 סנטימטר מעיד על מתיחת פוספט.

ההדמיה CT רנטגן באיור 5 לוכדת כי שכבת ganoine אינה מכסה את שכבת העצם שבו הקשקשים חופפים זה לזה. שכבות ganoine האפורות בהירות מצביעות על שלבים צפופים יותר, קשים יותר, ונוקשים ואילו שכבות עצם אפורות כהות יותר מצביעות על שלבים פחות צפופים ופחות נוקשה. בנוסף, דימויי CT רנטגן סייעו בזיהוי אי - האחידות בעובי שכבת ganoine. למעשה, בורות ברורות הם נצפו בסמוך למרכז של שכבת ganoine, שאינו מכסה את שכבת העצם בכלל.

תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק באיור 6A של פני השטח שבר חרוטים עם H ₃ PO ₄ חשפו ננו המאורגן בדפוס שכבתי לשכבת ganoine. מאורגן nanorod זה מבנה בקורלציה לחתימות hydroxyapatite מתקבלות מFTIR לאזור ganoine.

איור 6 א מתאר מיקרוסקופ אופייני ההגדלה נמוכה SEM של פני השטח שבר זיהוי ברור של המעבר בין שכבות ganoine ועצם עם הקו המקווקו. איור 6 מציג את תמונות SEM ההגדלה גבוהות יותר של פני השטח שבר לאחר תחריט עם H ₃ PO _4. לאחר תחריט, nanorods אוריינטציה בשכבת ganoine החיצונית הוא זיהוי בבירור תוך nanostructure כמו סיבים הוא ציין בשכבת העצם.

איור 3. מודולוס ונתוני קשיות מnanoindentation מרחבית בקורלציה להרכב כימי SEM / EDX.

her.within-page = "תמיד">
איור 4. ספקטרומי FTIR נאספו מחיצוני (ganoine) ופנימי (גרמית) שכבות.

איור 5. רנטגן תמונות CT מראים pitting על החיצוני (ganoine) שכבה המכסה את השכבה הפנימית (הגרמית).

איור 6. (א) תמונה נמוכה הגדלת SEM של פני השטח שבר טיפוסיים, (ב ') תמונות בהגדלה גבוהות יותר של nanorods בחיצוני (ganoine) וסיבים בפנימיים (בony) שכבות .. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מנקודת מבט של ניסוי, חוקרים צריכים לזכור כי כאשר עובדים עם באופן טבעי חומרים ביולוגיים, כגון קשקשי דגי mineralized, דיווח המיקום המרחבי של הסולם על הדגים הוא קריטי שכן המחקר קודם הראה תכונות מכאניות של קשקשי דגי mineralized תלויים לשם הקשקשים היו ממוקמים על הדגים ^4.

תכונות מכאניות של חומרים ביולוגיים mineralized גם הוכח להיות תלוי במצב הלחות של הדגימות ^4. זה מגביל את השימושיות של טכניקה זו כאשר מנסה להשוות דגימות טריות שכבר hydrated כראוי לתוצאות שפורסמו בספרות מקצועית, המשתמשות בדגימות מאובנות יבשות. לכן, פעמים בדיקות ממושכות צריכה להימנע כדי למזער את ההשפעות של התייבשות על התכונות מכאניות של מדגם במהלך nanoindentation. מחקרי טייס ספציפיים חומר מומלצים כדי להבטיח ההתנסותהריצה ment היא מינימאלית מספיק כדי לא לשנות את ההתנהגות מכאנית של החומר. nanoindentation תא הרטוב יהיה שיטה מועדפת כדי לשמור על מצב לחות מתמיד של החומר אם ציוד הבדיקה מאפשר את זה.

שיטת nanoindentation שימשה במחקר זה, אשר מחושבת מודולוס אלסטיות מעקומת הפריקה מניחה את החומר מתנהג כחומר איזוטרופיים אלסטי ליניארי. הטכניקה יכולה לשמש למגוון רחב של טיפים indenter. עם זאת, בקצה ברקוביץ תלת צדדי עם זווית מחצית 65.35 ° שימש במחקר זה. טיפים אלטרנטיביים כגון פינת הקובייה (מחצית זווית = 35.36 °) מתאימים להליך שהוצג בכתב היד הזה, אבל מאז את קצה פינת הקובייה הוא יותר חריף מסדקי הקצה ברקוביץ' יכולים להיות שנוצרו במדגם בהרבה עומסים נמוכים יותר מאשר עם טיפ ברקוביץ'.

פוליש הוא צעד חיוני כדי לקבל משטח חלק ושטוח עם surfac ממוזערחספוס דואר לא להשפיע על תוצאות nanoindentation. צעדי הליטוש שהוצגו בכתב היד הזה הם הליך שהציע שאולי צריך להיות שונה בהתאם לסוג של ליטוש בשימוש. עם זאת, השלב הקריטי כדי להבטיח נתונים nanoindentation מדויקים הוא שחספוס פני השטח ממוזער, ולחומר מסוים זה נדרש ליטוש סופי ננומטר 50 להשיג משטח שטוח חלק במעמקי הכניסה שנחקרו.

המרווח של כניסות גם מבטיח נתונים nanoindentation מדויקים שאינו מושפע מעיוות החומר המתרחשת מכניסות קודמות. המדריך למשתמש nanoindenter לציוד במחקר זה הציע כי מרווח כניסה צריך להיות לפחות 20-30x עומק החדירה המקסימאלי לרקוביץ' indenters ^15. לחומרים חלופיים, ריווח הכניסה הנדרש יצטרך להיקבע על בסיס העומס המופעל ועומק כניסה מרבי כפי שנדון בעבר בשטח הפתוחספרות ^16,17. בנוסף, זמן ההמתנה לחומר הזה נבחר כדי להתגבר על כל השרץ נצפה עבור שלבי חומר השונים חקרו מאפשר שיטת ניתוח אוליבר-פאר התוכנה של nanoindenter לשמש. עם זאת, כפי שפורט על ידי Oyen ¹⁸ שיטות ניתוח חלופיות זמינות עבור חומרים ביולוגיים כאשר תגובות חומרים תלויי זמן לא ניתן להתגבר עם זמני המתנה מתאימים.

כדי להשיג תוצאות ברזולוציה גבוהה מ-X-Ray CT, כמה הגדרות חייבות להיות מותאמות. מאמר זה מתאר קבוצה ספציפית מאוד של פרמטרים לשימוש בקנה מידת דגים בגודל ייחודי ועובי שכבות. עם מדגם גדלים שונים, הגדרות אלה צריכים להיות מותאמות כדי להשיג בסיס נתוני באיכות הגבוהה ביותר. התהליך של בחירת כל פרמטר צריך להיות מוגדר בצורה ברורה בהוראות שימוש שמגיעה עם שימוש במכונה. הגדרות סריקה (מתח, זרם, חשיפה, בחירת מסנן) והגדרות שחזור(ממצא טבעת, התקשות קורה) ייתכן שיצטרך להיות שונה כדי להתאים למגוון רחב של גדלי מדגם אחרים וגיאומטריות.

רנטגן CT סיפק תמונה של מורפולוגיה כל קנה מידת זיהוי שכבת ganoine מכסה שכבה גרמית של חומר היחיד שבו הסולמות לא חופפים זה לזה. ההדמיה CT רנטגן זיהתה גם כי שכבת ganoine כללה עובי לא אחיד על פני קנה המידה, ואפילו בורות שהפגינו חסרות שכבת ganoine לגמרי.

מעניין לציין, כי נתונים nanoindentation מרחבית בקורלציה לניתוח הכימי SEM / EDX זיהו מעבר בדיד חד בין 2 השכבות במקום מעבר הדרגתי יותר נצפה עבור קשקשי דגי mineralized של פ senagalus (בBruet et al. ^2).

שילוב של nanoindentation, FTIR, EDX, וSEM סיפקו נכס מכאני, אנליזה כימית, ומידע מבני כדי לאשרהשכבה החיצונית כganoine עם מורפולוגיה של זגוגית וכימיה. בנוסף, טכניקות אלה אישרו את השכבה הפנימית כשכבת גרמית של חומר.

לסיכום, השיטות שתוארו במחקר זה זיהו את ההליך ותוצאות מקבילה לבחון את היקף דגי mineralized של א ' מרית מהמבנה בתפזורת למטה להרכב nanostructure וכימי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy resin	Buehler	701-501512
Epoxy hardener	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
High precision cut-off saw	Buehler	Isomet
UltraMet 2002 sonic cleaner	Buehler	B2510R-MT
Polisher	Buehler	49-1750-160
1,200 grit (15 μm) SiC paper	Struers	40400012
4,000 grit (6 μm) SiC paper	Struers	40400014
50 nm colloidal silica	Buehler	40-10075
Chemomet polishing pad for 50 nm suspension	Buehler	40-7918
Nanoindenter	MTS	G200
FTIR continuum microscope	Thermo Nicollet	6700
X-ray computed tomography	Skyscan	Skyscan 1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Bruker	AXS Xflash detector 4010
Sputter coater	Denton	Desk II