Caractérisation des échelles de poissons multi-couches (<em&gt; Atractosteus spatule</em&gt;) En utilisant Nanoindentation, CT à rayons X, FTIR, et SEM

Résumé

Cet article présente les méthodes utilisées pour sonder les propriétés mécaniques de l'échelle multicouche de Atractosteus spatule (A. spatule) à l'aide de nano-indentation chimique spatialement corrélée, structurelle, et, infrarouge transformée de Fourier (FTIR), la microscopie électronique à balayage (MEB), et X- ray tomodensitométrie (CT à rayons X). Les résultats expérimentaux ont été utilisées pour étudier les principes de conception de matériels biologiques de protection.

Résumé

L'architecture hiérarchique de matériaux biologiques de protection tels que les échelles minéralisées de poissons, coquilles de gastéropodes, la corne de bélier, de bois, et des carapaces de tortues fournit des principes de conception unique avec des potentiels pour guider la conception de matériaux et systèmes de protection à l'avenir. Comprendre les relations structure-propriété de ces systèmes matériels à l'échelle microscopique et nanométrique où l'échec déclenche est essentiel. Actuellement, les techniques expérimentales telles que la nano-indentation, CT à rayons X, et SEM fournissent aux chercheurs une façon de corréler le comportement mécanique de microstructures hiérarchiques de ces systèmes matériels ^1-6. Toutefois, une procédure standard bien défini pour la préparation des échantillons de biomatériaux minéralisées n'est pas disponible actuellement. Dans cette étude, les méthodes pour sonder les propriétés mécaniques de l'échelle multicouche de A. chimique spatialement corrélée, structurelle, et spatule à l'aide nanoindentation, FTIR, SEM, avec enénergie dispersive des rayons X (EDX) microanalyse, et CT à rayons X sont présentés.

Introduction

Les chercheurs étudient les biomatériaux structurelles et tentent d'élucider les principes de conception, qui fournissent des biomatériaux structurelles avec des propriétés mécaniques améliorées telles que la ténacité et la force beaucoup plus élevé par rapport à leurs électeurs individuels. Les enquêtes sur les principes de conception des écailles de poisson blindés pour Pagrus major ^7, Polypterus senagalus ^2,6, Arapaima gigas ^3, Cyprinus carpio ^4, et Atractosteus spatule ¹ ont démontré la nécessité d'élargir l'application des méthodes expérimentales existantes pour étudier les réponses structurelles et les caractéristiques de la microstructure, car les procédures standard détaillées ne sont pas disponibles pour ces types de matériaux et expériences.

Parmi les différentes échelles de poissons blindés discutés, A. spatule est un prédateur historiquement sommet de la centrale américaine ⁸ et est une espèce à hautely échelles minéralisées. Les échanges d'espèces de la masse musculaire pour la masse de la peau pour obtenir un système de défense contre les prédateurs améliorée par rapport aux poissons de taille comparable mentionné précédemment ^9. Selon la page et Burr ^10, A. spatule est le troisième plus grand poisson d'eau douce en Amérique du Nord avec l'esturgeon blanc (Acipenser transmontanus) et l'esturgeon noir (Acipenser oxyrhynchus) étant plus grandes espèces. Les écailles de poisson hautement minéralisées de A. spatule sont que récemment à l'étude. Thompson et McCune ¹¹ suggéré que la morphologie des échelles de gar encore une composition à trois couches consistant en une couche de ganoine extérieure, une couche d'os diffuse, et la couche d'os lamellaire. Les recherches actuelles sur le A. échelles de spatule n'ont pas distingué de la couche diffuse dans l'os ou les régions de l'os lamellaire, mais a seulement étudié la région de l'os en une seule couche interne ^1,12.

Dans cette étude, les procédures pour envestigating la microstructure, nanostructure, la composition chimique, et les distributions spatiales des propriétés mécaniques des échelles de A. spatule sur la base de résultats de la spectroscopie FTIR, SEM, X-ray CT, et les techniques de nanoindentation sont présentés.

Protocole

1. Échelle de poissons Préparation de l'échantillon

Pour cette étude, les échelles ont été obtenus auprès de l'US Army Engineer Research et Development Center (ERDC) Laboratoire de l'environnement à mi-longueur (29 ^e colonne caudale) à partir d'un environ 600 mm de long gar (A. spatule). Les écailles de poisson ont été obtenus selon l'Institut national de la ERDC et de la santé (NIH) Les directives de protection des animaux.

1. Matériels
   Notez l'emplacement spatial sur les poissons de la balance obtenues pour l'étude. Assurez-vous d'adhérer à l'organisation appropriée ou directives gouvernementales pour obtenir des échantillons biologiques tels que les directives de protection des animaux du NIH. Stocker les échelles dans un milieu adéquat, tels que solution saline tamponnée au phosphate à préserver l'hydratation et de maintenir la teneur en minéraux, une fois qu'ils sont retirés du poisson. Eviter le stockage prolongé qui peut entraîner la perte de minéraux, ce qui peut influer sur les données de nanoindentation. Utilisez une brosse à poils et à moyen tweezers pour enlever tout le tissu mou des écailles dures.
2. Spécimen de montage et de sectionnement
   L'examen d'une coupe transversale de l'axe court échelle du poisson (figure 1) par FTIR et nanoindentation faut d'abord monter l'échelle dans un milieu rigide comme un époxy en deux parties comprenant une résine et un durcisseur. Usage général RT époxydes de durcissement avec des températures basses de pointe tels que l'époxy général commercial utilisé dans cette étude qui a eu un pic de température de moins de 55 ° C.

Images Figure 1. Rayons X CT de A. échelle de spatule représentant la section transversale à court axe examiné dans cette étude de A. en utilisant une spatule et nanoindentation FTIR [A (antérieure), P (postérieur), D (dorsal), V (ventrale)].

2. 1. Maintenir l'écaille de poisson dans un moule de 32 mm de diamètre échantillon en utilisant un support d'échantillon en matière plastique disponible dans le commerce. Cela permet de maintenir l'échantillon correctement orienté lors du montage dans l'époxy.
   2. Une fois l'échantillon est maintenu dans le moule, versez la résine époxy non durci sur l'échantillon, puis laisser durcir l'époxy selon les instructions du fabricant.
   3. Après l'époxy est durcie, la section de l'échantillon monté à l'aide d'une lame de diamant de haute précision Tronçonneuse à la ligne médiane de l'échantillon.
   4. Traitement par ultrasons dans de l'eau distillée pendant 15 minutes pour enlever les débris de l'échantillon.
3. Polissage pour Nanoindentation et FTIR
   Pour obtenir une surface lisse et plane pour nanoindentation comme le montre la figure 2, la procédure et les paramètres de polissage suivantes sont proposées sur la base de discussions avec la fabrication de polissage et analyser des échantillons. Les paramètres peuvent toutefois être nécessaire d'ajuster les différents biomatériaux à partir des réponsestels que les taux d'enlèvement de matière. Ultrasons des échantillons dans un bain d'eau distillée entre les étapes de polissage est essentiel de veiller à particules à partir d'une grossière étape de polissage ne sont pas introduits dans une fine polissage étape ultérieure.

Figure 2. L'image d'un brillant petit axe section transversale A. échelle de spatule monté en époxy.

4. 1. Poli grossier avec un tampon de 15 um de SiC et de l'eau comme lubrifiant jusqu'à ce que l'échantillon est plane à l'aide de la force automatique de la tête de polissage de 7 lbf et la vitesse de 200 tours par min (rpm).
   2. Soniquer l'échantillon dans un bain d'eau distillée pendant 15 min.
   3. Vernis intermédiaire avec un pad 6 pm SiC en utilisant le lubrifiant de l'eau à une vitesse de 130 tours par minute platine et une force de 7 lbf pour5 min.
   4. Soniquer l'échantillon dans un bain d'eau distillée pendant 15 min.
   5. Polir avec un tampon de SiC 1 um en utilisant le lubrifiant de l'eau à une vitesse d'impression de 130 tours par minute et une force de 7 lbf pendant 5 min.
   6. Soniquer l'échantillon dans un bain d'eau distillée pendant 15 min.
   7. Polissage final avec un nm suspension de silice colloïdale 50 l'aide d'un tampon de polissage approprié comme une haute densité, non-tissé, faible sieste polyuréthane poreux que le fabricant propose pour 50 suspensions nm. Polonais à une vitesse de 130 tours par minute avec une force de 7 lbf pendant 5 min.
   8. Soniquer l'échantillon dans un bain d'eau distillée pendant 15 min.

2. Nanoindentation essais

1. Calibrer le système de nanoindentation avant chaque lot de tests par la fabrique des lignes directrices. L'étalonnage doit inclure la détermination de la fonction de la zone du système de la pointe Berkovich et la rigidité du cadre. En outre, effectuer un étalonnage microscope à pénétrateur à cette étapepour assurer les tirets sont en corrélation avec les emplacements choisis de microscope.
2. Chargez l'échantillon dans le nanoindenteur et utiliser les commandes au microscope optique sur le nanoindenteur d'apporter l'échantillon au point.
3. Utilisez les commandes de logiciels à déplacer l'échantillon à l'emplacement du premier tiret. Idéalement, il s'agit d'environ 10 um de la résine époxy à partir du bord de la couche de ganoine le long de la ligne centrale de la section transversale de l'échelle.
4. Effectuer 4 rangées parallèles de tirets espacés de 15 um à part pour obtenir un ensemble de données statistiquement significatives définies à partir de cet endroit. Réglez le nanoindenteur à une charge maximale de 5 mn, chargement et déchargement des taux de 0,1 mN / s, un temps d'attente de 30 sec, et un espacement de retrait minimum de 5 um pour chaque ligne. La rangée de tirets doit être configuré pour fonctionner perpendiculairement à la surface de ganoine, et un nombre suffisant de tirets doit être spécifiée à voyager à travers la section transversale de l'échelle tout en traversant d'environ 10 um dans le epoxy passé la couche osseuse.
5. Lorsque le lot est terminé, disposer la nanoindenteur créer tirets repères avec une charge maximale de 100 mN à la première et dernière tiret, qui devrait être dans la résine époxy avant la couche de ganoine et après que la couche de l'os, respectivement. Ce sont en corrélation avec les points de début et de fin de chaque rangée de tirets.
6. Après nanoindentation, placer l'échantillon de retour dans la solution de PBS pour éviter une déshydratation.
7. Utiliser le logiciel de nanoindentation pour déterminer le module et la dureté sur la base de la méthode Oliver ^Pharr-13 si une réponse de matériel indépendante du temps est observée. Sinon, le temps de maintien peut être étendue à surmonter le fluage observé de décharger trop rapidement.

3. Résolution spatiale ATR-FTIR Spectroscopie

L'utilisation d'une lame-sur ATR accessoire fixé à un microscope FTIR est une méthode proposée pour recueillir résolue spatialement infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) de la l'yers dans un échantillon d'écailles de poisson. L'accessoire ATR permet la collecte de spectres de haute qualité avec un très petit (~ 10 um ²⁾ la résolution spatiale, ce qui n'est pas réalisable avec toute autre technique FTIR. Le même échantillon poli (figure 2), préparée pour les expériences de nanoindentation a été utilisé dans ces expériences.

1. Choisir un échantillon avec une surface et des dimensions appropriées pour le microscope FTIR étant utilisée pour l'analyse des spectres d'assurer de haute qualité est obtenue à partir d'ATR-FTIR spectromicroscopie.
2. Préparer le microscope FTIR pour recueillir des données. Microspectroscopie FTIR nécessite un étalonnage du signal FTIR dans les mêmes conditions d'échantillonnage comme il sera utilisé pour la mesure de l'échantillon. Typiquement, cela inclut le refroidissement du détecteur et laissant du temps pour se stabiliser ainsi que la collecte de tous les spectres de référence et les spectres de l'échantillon dans les mêmes conditions environnementales. Cela peut être particulièrement important, parce que le CO ₂ et la vapeur d'eau dans l'air peut daffecter ramatically spectres FTIR. Il est également important de veiller à ce que l'optique de l'appareil sont alignés.
3. Recueillir un spectre de fond appropriée pour soustraire l'échantillon contre. Pour ces expériences, une, lame de microscope revêtu d'or poli a été utilisé comme un fond pour FTIR spectromicroscopie.
4. L'utilisation d'un objectif approprié, se concentrer sur l'échantillon et de sélectionner une zone d'intérêt pour l'analyse.
5. Une fois une zone d'intérêt se trouve, fixez l'accessoire ATR à l'objectif du microscope FTIR, augmenter l'échantillon jusqu'à ce qu'il entre en contact intime avec l'élément de réflexion interne ATR, et de recueillir un spectre de l'échantillon.
6. Après avoir recueilli les spectres FTIR, effectuer le traitement de données standard nécessaire requise.

4. X-ray tomodensitométrie (CT)

1. Obtenir et préparer échelle comme indiqué à la section 1.1
2. Configuration du scanner
   1. La source de rayons X Warm-up selon les spécifications du fabricant.
   2. Set X-ray tension et le courant à 50 kV et 160 uA, respectivement.
   3. Réglez le temps d'exposition à 1450 ms.
   4. Sélectionnez un filtre de 1,0 mm d'aluminium.
   5. Avant de chargement d'échantillon, effectuer une correction de champ plat lorsque la source de rayons X est éteint (fond noir) et sur (champ lumineux).
3. Mount and Charger des échantillons
   Elles doivent être montées de manière afin qu'ils ne se déplacent ou se déplacent sur toute la longueur de la numérisation. Ces échantillons doivent également être montés à l'aide de matériaux qui sont pratiquement transparent aux rayons X. Une combinaison de la mousse de polystyrène et Parafilm peut être utilisé pour fixer l'échelle de la scène CT.
   1. Monter rigidement l'échantillon de telle sorte que la plus grande dimension est parallèle au détecteur.
   2. Fixer l'échantillon monté à l'étape de scanner.
   3. Placer l'échantillon de sorte qu'il sera dans le centre de rotation tout au long du balayage.
   4. Sélectionnez la plus haute résolution qui permet à l'ensemble de l'échelle pour être dans le champ de vision (FOV), dans ce cas7,5 um.
4. Paramètres d'acquisition
   Effectuer des analyses de cette étude avec une étape de rotation de 0,25 ° et une valeur moyenne de cadre 15. Si des résolutions inférieures sont acceptables, augmenter la taille de l'étape et / ou diminuer la trame moyenne de réduire le temps de cycle total.
5. Paramètres de reconstruction
   Une fois qu'un ensemble de données est obtenue, reconstituer des images de projection de rayons X pour créer un ensemble de données contenant des images en coupe transversale. Sélectionnez les paramètres par défaut du logiciel de NRecon de SkyScan sauf pour ce qui suit.
   1. Changer la correction Anneau artefact à 20.
   2. Changer la correction de faisceau de durcissement à 25%.
   3. Réglez le CS statique Rotation à faire niveau d'image en coupe.
6. Traitement de l'image
   Utilisez le logiciel ctan de Skyscan pour obtenir l'image finale en 3D gris. Régler la gamme de gris à un niveau approprié pour éliminer les artefacts de la mousse de polystyrène et Parafilm.

5. SEM imagerie et analyse EDX

Les échantillons préparés par le polissage de nanoindentation micro-/nano-structure et la caractérisation ont été examinés par microscopie électronique à balayage (MEB). Mode basse vide a été utilisé pour minimiser la déshydratation des échantillons et de la nécessité pour l'application de revêtements conducteurs. L'analyse chimique locale a été réalisée sur des échantillons polis en association avec l'imagerie SEM en utilisant la spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDX). Des analyses EDX ont été effectuées sur la même ligne / grille qui a été analysé par nanoindentation dans le but de fournir des corrélations entre les propriétés chimiques et mécaniques. Surfaces fraîchement fracturés ont également été examinés par SEM à fournir une meilleure information sur la morphologie et l'orientation des structures biominéralisée présents dans les écailles de poisson. Pour améliorer la résolution pour l'observation de la structure à l'échelle nanométrique sur des surfaces fracturées, les échantillons ont été revêtus par pulvérisation avec de l'or (Au) et imagés en mode haute vide. Ce qui suitfournit des détails supplémentaires sur les procédures utilisées.

1. SEM imagerie de surfaces polies
   1. Placez spécimen poli dans la chambre SEM et la chambre de pompe en mode bas-vide avec une pression de chambre de 0,1 à 0,5 mbar.
   2. Réglez la distance de travail à environ 5,0 mm.
   3. Activer haute tension (HT) et accédez à la région d'intérêt sur l'échantillon qui comprend la zone de transition entre ganoine et osseuses sous-couches ou d'autres domaines d'intérêt.
   4. Obtenir des images à haute tension 15 kV et un courant de faisceau d'environ 3,9 nA.
   5. Concentrer l'image et effectuer tous les alignements nécessaires et des ajustements de stigmation.
   6. Capturez des images à partir d'au moins trois régions d'intérêt à des grossissements pertinentes (généralement 250X à 10.000 X) en utilisant le faible vide électrons rétrodiffusés (BSE) de détection pour aider à l'identification des changements dans le contenu biominéral et densité (c'est-à-os dense vs os poreux ).
2. SEM imagerie de surfaces fracturées
   1. Apposer échantillon fraîchement fracturés à un talon de 90 ° SEM en utilisant du ruban adhésif double-face carbone avec la surface de rupture vers le haut.
   2. Pulvérisation manteau avec Au fournir un sous-nm épaisse couche conductrice sur la surface de rupture.
   3. Placer l'échantillon dans la chambre SEM et la chambre de pompe en mode haute vide.
   4. Réglez la distance de travail à entre 3,0 et 5,0 mm.
   5. Activer HV et accédez à des régions d'intérêt sur l'échantillon. Principaux domaines d'intérêt dans cette affaire étaient la structure présente dans les couches de ganoine et osseuses.
   6. Obtenir des images à entre 5 kV et 15 kV HV et un courant de faisceau inférieure de 0,24 nA pour améliorer la résolution.
   7. Concentrer initialement échantillon et effectuer des alignements préliminaires.
   8. Augmenter le grossissement à plus de 5000 X et passer de lentille normale à émission de champ en immersion / ultra-haute résolution (UHR) lentille.
   9. Effectuer UHR alignements et ajustements de stigmation.
   10. Capturez des images à partir d'au moins trois régions of intérêt à des grossissements correspondants (généralement 5000 à 250 000 X X) en utilisant le détecteur à travers la lentille (DTL) fonctionnant en mode d'électrons secondaires (SE).
3. Analyse EDX de surfaces polies (réalisée en collaboration avec l'imagerie SEM). Ces paramètres dépendent de la matière et auront besoin d'être ajusté de sorte que le volume d'interaction EDX est la même taille que le volume d'interaction de nanoindentation comme on le verra par Moser ^14.
   1. Accédez à la région d'intérêt sur échantillon poli qui comprend grille de nanoindentation indiqué par points repères à la fin de chaque ligne de tirets.
   2. Assurez-HV est d'au moins 15 kV, courant du faisceau est d'au moins 3,9 nA, et la distance de travail est supérieur à 5,0 mm.
   3. Capturer l'image de l'ESB de la région à être analysées à l'aide EDX.
   4. En utilisant le logiciel d'analyse EDX, capturer la même image pour aider à localiser les zones d'effectuer des analyses chimiques le long de la ligne de tirets.
   5. Utilisation de la "Analyse Line" technique, potion d'une ligne pour effectuer l'analyse chimique le long de la ligne de l'intérêt des tirets à partir du premier tiret et se terminant au dernier tiret.
   6. Indiquez le nombre de points d'analyse pour être placé le long de la ligne. Il est préférable d'utiliser le même nombre de points d'analyse et des retraits qui sont présents pour fournir une corrélation spatiale directe entre la composition chimique et les propriétés mécaniques.
   7. Lorsque la ligne est positionné et les points spécifié correctement, lancer l'analyse en ligne en utilisant le logiciel EDX.
   8. Lorsque l'analyse de la ligne est terminée, identifier des éléments d'intérêt à être quantifiés à partir des spectres de points obtenus le long de la ligne spécifiée sur la surface polie de l'échantillon.
   9. Une fois les éléments d'intérêt sont identifiés, effectuer un étalonnage de fond pour tenir compte de Bremsstrahlung rayonnement et d'autres effets.
   10. Choisissez déconvolution analyse l'option du logiciel pour obtenir une analyse quantitative sur chaque point le long de la ligne spécifiée à quantifiertifier la composition chimique en chaque point.
   11. Enregistrer les résultats quantitatifs de l'analyse chimique avec l'image de ligne spécifié qui a été analysée à l'aide de la corrélation spatiale des propriétés mécaniques mesurées à l'aide nanoindentation.

Résultats

La figure 3 représente la moyenne des résultats spatialement corrélée nanoinidentation / SEM / EDX analyses menées dans la longue axe court d'environ 800 um section transversale. Dans la couche de ganoine environ 60 um d'épaisseur, le module nanoindenteur calculé une moyenne de 69,0 GPa et une dureté de 3,3 GPa. Le nanoindenteur un module déterminé moyenne de 14,3 GPa et une dureté de 0,5 GPa pour la couche d'os d'environ 740 um d'épaisseur.

EDX déterminée carbone, l'oxygène, le calcium et le phosphore, qui sont typiquement trouvées dans des échelles minéralisées. Cependant, les couches de ganoine et osseuses contenues différences mesurables dans des compositions chimiques. Le pic observé en carbone dans la couche d'os peut être attribuée à cette région n'étant pas aussi fortement minéralisées, ce qui entraîne une légère augmentation du carbone qui a également provoqué la diminution observée de la luminosité globale de l'image de l'ESB. Plus précisément, la couche de ganoine '; S signifie le rapport atomique de la concentration de Ca: P de 1,71 apparu semblable à de l'hydroxyapatite avec un rapport théorique de 1,67. Ca moyenne de l'os couche: ratio de P a diminué à 1,51 représente une diminution de la quantité de minéralisation de la couche de ganoine.

Les spectres FTIR de la figure 4, pour la couche d'os et de la couche de ganoine identifié les principaux groupes fonctionnels tels que amide, carboxylique, phosphate, et carbonyle. Plus précisément, FTIR a confirmé l'observation visuelle de signatures d'hydroxyapatite dans les externe (ganoine) couche de collagène et signatures dans le (os) couche interne. Pics à 3,500-3,000 cm ^-1 dû à l'étirement et NH NH flexion entre 1550 et 1500 ^cm-1 représentent des groupes amide dans la couche d'os. Des pics dans la région de nombre d'onde 1,470-1,365 cm ^-1 représentent des groupes alkyle amide substitué. En outre, une caractéristique C = O stretching à 1641 ^cm-1 a été observée sur la couche d'os. Poisks de 3,000-2,500 cm ^-1 représentent des groupes carboxyliques. Les spectres de deux os et la ganoine couches produit un pic distinctif près de 1,079.33 cm ^-1 indicatifs d'étirement phosphate.

X-ray CT imagerie capture sur la figure 5 que la couche de ganoine ne couvre pas la couche d'os où les écailles se chevauchent les uns les autres. Les couches lumineuses de ganoine grises indiquent les phases plus denses, plus dures, et plus rigide tandis que les couches les plus sombres de l'os gris indiquent les phases moins denses et moins raides. En outre, l'imagerie par tomographie à rayons X assisté dans l'identification de la non-uniformité de l'épaisseur de la couche de ganoine. En fait, on observe des puits claires à proximité du centre de la couche de ganoine, qui ne couvre pas la couche d'os du tout.

L'image MEB de la figure 6A de la surface de fracture gravé avec H ₃ PO ₄ a révélé nanostructures organisées selon une configuration en couches pour la couche de ganoine. Cette nanotige organiséla structure est en corrélation avec les signatures d'hydroxyapatite obtenus à partir de la FTIR pour la zone ganoine.

La figure 6A représente une caractéristique plus faible grossissement Micrographie MEB d'une surface de fracture d'identifier clairement la transition entre les couches de ganoine et des os avec la ligne en pointillés. Figure 6B illustre les plus élevés grossissement des images MEB de la surface de fracture après la gravure avec H ₃ PO _4. Après gravure, nanotiges orientées dans la couche de ganoine externe sont clairement identifiables tout en une nanostructure analogue à des fibres est observée dans la couche d'os.

Figure 3. Module et les données de dureté de nano-indentation spatialement corrélés à la composition chimique SEM / EDX.

Figure 4. Spectres FTIR collectées depuis la extérieur (ganoine) et intérieure (osseux) couches.

Figure 5. X-ray images CT montrant des piqûres sur la partie extérieure (ganoine) couvrant la couche (osseux) couche interne.

Figure 6. (A) à faible grossissement image MEB de la surface de fracture typique, (B) des images de grossissement de nanotubes dans l'extérieur (ganoine) et des fibres dans le intérieure (bony) couches .. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

D'un point de vue expérimental, les chercheurs doivent se rappeler que lorsque vous travaillez avec naturellement matériaux biologiques tels que des écailles de poisson minéralisées, les rapports de la localisation spatiale de l'échelle sur le poisson est critique car les recherches antérieures ont montré des propriétés mécaniques des écailles de poisson minéralisées sont dépendants à l'endroit où les écailles sont situées sur le poisson ^4.

Propriétés mécaniques des matériaux biologiques minéralisées a également été démontré que dépendante de l'état des ^quatre échantillons d'hydratation. Cela limite l'utilité de cette technique lorsque vous essayez de comparer des échantillons frais qui ont été correctement hydratées aux résultats publiés dans la littérature scientifique, qui utilisent des échantillons fossiles secs. Par conséquent, les temps de tests prolongés doivent être évités afin de minimiser les effets de la déshydratation sur les propriétés mécaniques d'un échantillon au cours de nanoindentation. Matériel études pilotes spécifiques sont recommandées pour garantir l'expérienceRuntime ment est suffisamment minime pour ne pas modifier le comportement mécanique du matériau. Nanoindentation cellule humide serait une méthode préférée pour garder un état d'hydratation constante de la matière si l'équipement d'essai le permet.

Le procédé de nano-indentation utilisée dans cette étude, ce qui a calculé le module d'élasticité de la courbe de décharge assume le matériau se comporte comme un matériau isotrope élastique linéaire. La technique peut être utilisée avec une variété de pointes de sertissage. Toutefois, la pointe Berkovich à trois côtés avec un demi-angle de 65,35 ° a été utilisé dans cette étude. Conseils alternatifs tels que le coin de cube (la moitié de l'angle = 35.36 °) sont adaptés à la procédure présentée dans ce manuscrit, mais depuis la pointe de coin de cube est plus aigu que les fissures de pointe Berkovich peuvent être générés dans l'échantillon à beaucoup charges inférieures à la pointe Berkovich.

Le polissage est une étape essentielle pour obtenir une surface lisse et plat avec un surfactant minimisée rugosité pour ne pas affecter les résultats de nanoindentation. Les étapes de polissage présentés dans ce manuscrit sont une procédure a suggéré qu'il pourrait être nécessaire de modifier en fonction du type de polisseuse utilisée. Cependant, l'étape essentielle pour s'assurer que les données de nanoindentation précis est que la rugosité de surface est réduite au minimum, et pour ce matériau particulier un polissage final nm 50 a été nécessaire pour obtenir une surface lisse et plane à des profondeurs d'indentation étant sondés.

L'espacement des tirets assure également des données de nanoindentation précis qui n'est pas influencée par la déformation de la matière se produisant à partir de tirets précédents. Le manuel d'utilisation de nanoindenteur pour l'équipement dans cette étude suggère que l'espacement tiret devrait être d'au moins 20 30x la profondeur de pénétration maximale de Berkovich pénétrateurs ^15. Pour les matériaux de substitution, le tiret espacement requis devra être déterminé en fonction de la charge appliquée et de la profondeur de pénétration maximale comme décrit précédemment à l'air librelittérature ^16,17. En outre, le temps de maintien de cette matière a été choisie pour surmonter tout fluage observée pour les différentes phases de matériau sondé permettant Oliver-Pharr la méthode d'analyse par le logiciel d'nanoindenteur à être utilisé. Cependant, comme nous le verrons par Oyen ¹⁸ méthodes alternatives d'analyse sont disponibles pour les matériaux biologiques lorsque les réponses de matériels en fonction du temps ne peuvent pas être surmontés avec temps d'attente appropriés.

Pour obtenir des résultats à haute résolution à partir de X-Ray CT, plusieurs paramètres doivent être optimisés. Ce document présente un ensemble très spécifique de paramètres pour une utilisation sur une échelle de poissons d'une taille unique et épaisseur couches. Avec des échantillons différents, ces paramètres devront être ajustés pour obtenir un ensemble de données de la plus haute qualité. Le processus de sélection de chaque paramètre doit être clairement définie dans le manuel d'utilisation fourni avec la machine utilisée. Paramètres de numérisation (tension, courant, exposition, sélection de filtre) et des paramètres de reconstruction(artefacts de cycle, durcissement du faisceau) peuvent avoir besoin d'être modifié pour accueillir une variété de tailles et d'autres géométries d'échantillons.

X-ray CT fourni une image de l'ensemble de la morphologie à l'échelle identifier une couche de ganoine osseux recouvrant une couche de matériau uniquement lorsque les échelles ne se chevauchent pas les uns les autres. L'imagerie de tomographie à rayons X a également identifié que la couche de ganoine composée d'une épaisseur non uniforme sur l'échelle, et même des fosses exposés qui n'avaient pas la couche d'ganoine tout.

Fait intéressant, les données de nanoindentation spatialement corrélées à l'analyse chimique SEM / EDX ont identifié une transition discrète nette entre les deux couches au lieu d'une transition plus graduelle observée pour les écailles de poisson minéralisées du P. senagalus (en Bruet et al. ^2).

Une combinaison de nanoindentation, FTIR, EDX, et SEM fournies propriété mécanique, analyse chimique, et des informations structurelles pour confirmerla couche externe comme ganoine d'émail comme la morphologie et la chimie. En outre, ces techniques ont confirmé que la couche intérieure une couche d'un matériau osseux.

En conclusion, les méthodes décrites dans cette étude ont identifié la procédure et les résultats correspondants à examiner l'échelle de poissons minéralisée de A. spatule à partir de la structure en masse vers le bas à la composition chimique et de la nanostructure.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy resin	Buehler	701-501512
Epoxy hardener	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
High precision cut-off saw	Buehler	Isomet
UltraMet 2002 sonic cleaner	Buehler	B2510R-MT
Polisher	Buehler	49-1750-160
1,200 grit (15 μm) SiC paper	Struers	40400012
4,000 grit (6 μm) SiC paper	Struers	40400014
50 nm colloidal silica	Buehler	40-10075
Chemomet polishing pad for 50 nm suspension	Buehler	40-7918
Nanoindenter	MTS	G200
FTIR continuum microscope	Thermo Nicollet	6700
X-ray computed tomography	Skyscan	Skyscan 1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Bruker	AXS Xflash detector 4010
Sputter coater	Denton	Desk II