Thymectomy מלא בחולדות מבוגרות עם לא פולשני endotracheal אינטובציה

Summary

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Abstract

Thymectomy במכרסמים בילוד הוא נוהל שקבע ואמין ללימודים חיסוניים. עם זאת, בחולדות מבוגרות, סיבוכים של דימום וחזה אוויר מהפרעת pleural יכולים לגרום לתמותה משמעותית. פרוטוקול זה הוא שיטה פשוטה של ​​thymectomy העכברוש שמנצל אינטובציה מיני sternotomy וendotracheal. אינטובציה מושגת באמצעות שיטה לא פולשנית ושחזור בקלות ומאפשרת אוורור חיובי לחץ כדי למנוע pneumothorax ודרכי נשימה מבוקרת המאפשרת מספיק זמן לנתיחה התימוס זהיר כדי למזער את ההפרעה pleural. חתך sternal 1.5 סנטימטר מקטין מגע עם כלי דם והצדר mediastinal, תוך מתן הדמיה מלאה של בלוטת התימוס. בעקבות חשיפה של חלל החזה, התימוס הוסר על ידי נתיחה בוטה תחת הגדלה. חלל pleural אטום לאחר מכן על ידי סגירת תפר של השרירים לפני ואחרי לקנה הנשימה על ידי היישום של דבק כירורגים.בית החזה סגור ולאחר מכן על ידי סגירת תפר של עצם החזה, ואחרי סגירת תפר של העור. כל thymectomies היו מלא כפי שמעידים immunohistochemical מכתים (IHC) של רקמת mediastinal, והעדר תאי T הנאיביים על ידי cytometry זרימה, והיה לי הליך שיעור הישרדות 96%. שיטה זו מתאימה כאשר thymectomy להשלים עם סיבוכים מינימאליים הוא רצויה ללימודים חיסוניים נוספים בחולדות מבוגרות athymic.

Introduction

מאז שנתי ה -1960 המוקדמות, התימוס הוכר על תפקידה החיוני בפיתוח של סובלנות חיסונית מרכזית. thymectomy מכרסמים הוכיח להיות הליך חיוני בהגדרת תפקידו של התימוס בבידול הלימפוציטים, סובלנות עצמית, וסבילות חיסונית בהגדרה של השתלת שתל וגרורות סרטנית. הסרת בלוטת התימוס העכברוש מאפשרת למחקרים שכלל דלדול T-cell או העברת המאמצת של אוכלוסיות תאי T מוגדרות ללא ההתעוררות המחודשת של תאי T נאיביים ילידים.

Thymectomies במכרסמים בילוד יכול להיות מושלם תוך שימוש בטכניקת יניקה עם תוצאות אמינות ^1. בחולדות מבוגרות, טכניקה זו קשורה עם שיעור תמותה של 20% בקירוב, ולעתים קרובות גורמת לthymectomy שלם ^2. כדי להשיג thymectomy מלא בחולדות מבוגרות באופן עקבי, נדרשת חשיפה פתוחה של חלל החזה באמצעות sternotomy חציון. עם זאת, זההליך קשור בסיבוכים הכוללים פגיעה לקנה הנשימה, דימום וחזה אוויר שמוביל לשיעורי תמותה כוללת החל 1.5-6% ^{2- 4.}

בשני העשורים האחרונים שיפורים בטכניקות thymectomy ירדו סיבוכים סביב ניתוח ושפרו את שיעורי הישרדות. אינטובציה endotracheal מאפשרת אוורור לחץ חיובי פחתה שיעורי pneumothorax ^5. שיטות של אינטובציה שתוארו קודם לכן מגוון מחשיפה פתוחה לקנה הנשימה לשיטות פחות פולשניות באמצעות הדמיה מייתרי קול ישירה. סיבוכים הקשורים בהליך אינטובציה כוללים פגיעה לקנה הנשימה, קרע מייתר קול, אינטובציה הוושט לא מכוונת, ודימום כתוצאה מדיקור או קריעה של הווריד הנבוב מעולה לב. בנוסף, בסמיכות של האונות הרתי הנמוכות לרירית פלאורלי יכולות לגרום לחזה אוויר.

כאן אנו מתארים טכניקה שלthymectomy דרך חתך בעור 2 סנטימטר פולשנית הבאים בשיטה פשוטה של ​​אינטובציה endotracheal באמצעות angiocatheter הקהה-סוף ותאורה לקנה הנשימה transcutaneous. Thymectomy כרוך sternotomy 1.5 סנטימטר וסגירת שלוש שכבה עם יישום דבק כירורגים לאטום את חלל החזה ולמזער את השכיחות של דימום וסיבוכים בדרכי הנשימה. שיטה זו באופן מהימן תוצאות בthymectomy מלא כפי שמעידה היעלמותו של CD4 ⁺ CD8 ⁺ ותאי T הנאיביים הבאים thymectomy והעדר רקמת הרתי על צביעת IHC. פעמים אופרטיביות ותמותת פרי פרוצדורליים נשמרות למינימום.

Protocol

הערה: כל הליכי הניסוי בתחום השימוש בחולדות נעשו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דיוק.

1. הכנת קנה נשימת אינטובציה הצינורית

1. לחתוך את קצה המחט של מחט angiocathether 14 G 2 אינץ 'עם מלקחות חיתוך.
2. לצבוט את לומן של המחט סגורה עם צבת מחט חוטם.
3. חותך את הקטע צבט עד קצה החלק הפתוח לומן עם צבת חיתוך, ואז לחתוך את הקצוות בשני הצדדים של הסוף שנותר ב30-45 מעלות זווית לקצה המחט.
4. מניחים את 3 התחתון - 4 מ"מ של הצינורית לתוך השטח הפתוח של צבת תלוש-משותף ישר ומושך כלפי מעלה, עד עיקול קל כלפי מעלה כבר נוצר בסוף.
   הערה: זה יקל בימוי קטטר לתוך קנה הנשימה (איור 1).
5. השתמש בנייר זכוכית עדינה כדי להחליק את הקצוות בסוף הצינורית.
6. חזור מכשיר הקהה לתוך צינורות angiocatheter. ודא שהצינור הוא מעט קצר יותר מאשר המחט הקהה.

נהלים 2. טרום ניתוחיים

1. הקים את האתר להליך על ידי הצבת מיקרוסקופ מוגדר 10X ההגדלה מעל אזור ההפעלה.
2. הנח כרית חימום על אזור ההפעלה ולכסות עם כרית הקליטה נקייה.
3. הגדר את קצב לב ולפקח חמצון דם ליד שדה הניתוח.
4. לשקול את העכברוש למינון המבוסס על משקל תרופות (למשל, שיכוך כאבים לאחר ניתוח, אנטיביוטיקה, או נוגדן הלימפוציטים מדלדלים).
   הערה: חולדות מבוגרות טיפוסית שוקלות בין 350-450 g.
5. שקט ורגוע העכברוש עם מתאדה 3% isoflurane-O ₂ (3 L / min) באמצעות תא אינדוקציה פרק למערכת הדחה גז הרדמה פסולת המכילה פחם פעיל. לאפשר 5 דקות לזירוז הרדמה לספק הרדמה עמוקה הכרחית לאינטובציה endotracheal.
6. לנהל carprofen או Meloxicane (4.4 מ"ג / קילוגרם) תת עורי לעכברוש לפני שתמשיך עם אינטובציה וניתוח.
7. השתמש קוצץ חשמלי לגלח את הצוואר וחזה של העכברוש הרדים לפני אינטובציה.

3. אינטובציה

1. הכן את התקנת אינטובציה על ידי שפשוף כמות קטנה של שימון (לדוגמא, ג'ל KY) בסופו של צינורית אינטובציה. הפעל את המאוורר כדי להתחיל את זרימת גז isoflurane דרך צינורות המחבר.
2. העבר את העכבר למנגנון אינטובציה ולהשעות את העכברוש בסרגל המתכת על ידי השיניים החותכות העליונות (איור 2 א).
   הערה: מנגנוני אינטובציה מסוימים ניתן לרכוש באינטרנט. המודל המוצג כאן הוא תוצרת הבית באמצעות גיליון אקריליק היצוק של חלקי חתיכה המותני אינץ '2 x 4 באמצעות לפיד בוטאן, ותגבורת מחוברות עם כלורופורם. בר (או חוט המתכת) מצורף על ידי חורי קידוח מעל קלטת מסוך דגש על יםIDE של אקריליק על מנת למנוע פיצול או פיצוח.
3. Trans-להאיר את צווארה של החולדה על ידי הצבת מקור אור בעוצמה גבוהה גמיש 1 - 2 סנטימטר מפני שטח הגחון של הצוואר (איור 2).
4. השתמש זוג מלקחיים דפוס סטנדרטיים תלמיד למשוך את הלשון בעדינות כלפי מעלה ולצדו השני של השיניים התחתונה. גריפ הלשון בין האגודל לאצבע המורה של יד אחת תוך שימת המשטח הפנימי השטוח של צד אחד של המלקחיים נגד הקצה התחתון של הלשון. לחץ ventrally לחשוף את מכסה הקנה וצמצם של הגרון (איור 2 ג).
5. דמיין את מיתרי קול ולהנחות הסוף ההפוך, הקהה של צינורית אינטובציה anteriorly דרך מייתרי הקול הפתוחים לתוך קנה הנשימה עד הרכזת של angiocatheter נוגעת חותכות.
6. הסר את stylet המתכת, ולצרף את צינורות הרדמה לפתיחת angiocatheter להתחיל אוורור עם isoflurane.
   הערה: פלו החמצן הטיפוסישיעור w למכונת הנשמה הוא 3 L / min עם 3% isoflurane.
   1. הגדר את מכונת ההנשמה בשיעור של 60 נשימות / דקה במצב הנשמה נפח מבוקרת שמשיג לחץ של ~ 12 - 14 מ"מ כספית. השתמש בלחץ חיובי הסוף-נשיפה (PEEP) של 3 סנטימטר H ₂ O.
7. שים לב קיר התרחבות חזה דו-צדדית בסנכרון עם המאוורר כדי להבטיח מיקום נכון של הטובוס.
8. החל משחה עיניים מומלצת וטרינר לעיניו של העכברוש כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
9. החל משחה וטרינר בעיניים של העכברוש כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
10. לאבטח את צינור endotracheal לראש של החולדה עם פס של סרט בד. להבטיח קשר הדוק בין הטובוס וצינורות זרימת חומר ההרדמה.
11. צרף את חמצון הדם ולפקח על קצב לב לכף הרגל של החולדה ולהתחיל מעקב. לאשר הרדמה תקינה על ידי המאשר שאין תגובה לדואר קמצוץ.

4. פתיחת בית החזה וThymectomy

1. בצע טכניקת ספטית סטנדרטית לשלמות של ההליך.
   1. נקה את שולחן האזור והפעלת העבודה ולחטא עם פתרון אתנול 70%.
   2. השתמש בכפפות מנתחים סטרילית במהלך ההליך, וחיטוי כל המכשירים וחומרים המשמשים במהלך ההליך.
   3. החל providone-יוד לאזור החזה כולו ולאפשר לו להתייבש. לאחר מכן לנקות את פני השטח של העור עם אתנול 70% על גזה. מכסה את העכברוש בניילון נצמד ברור חיתוך חור כדי לחשוף את שדה ניתוח סטרילי.
2. זהה את חריץ suprasternal באזור העליון של בית החזה. לעשות חתך קו האמצע של 2 סנטימטרים דרך העור מתחיל 2-3 מ"מ מעל חריץ suprasternal והארכת distally קו האמצע לאורך עצם החזה באמצעות מספריים שיאה קהים שקצהו.
3. בצע sternotomy 1.5 סנטימטרים חציון מחריץ suprasternal שוב באמצעות מספריים שיאה קהים שקצהו. Kיפ הקצה התחתון של המספריים רק מתחת לעצם החזה ומראש לאט.
4. הכנס מפשק Alm קטן רק מתחת לעצם החזה והפתוח המופרדים לחשוף מראש לקנה הנשימה שרירי רצועה (sternohyoid ושרירים sternothyroid). הפרד את שרירי רצועה מראש לקנה הנשימה באמצעות מלקחיים גרפו בוטים. הערה: בשלב זה, ניתן לראות את קנה הנשימה, וצינור ההנשמה צריכה להיות דמיין בתוך קנה הנשימה.
5. מניחים את השיניים של מפשק Alm הקטן מתחת לשרירי הרצועה המופרדים ועצם החזה. פתח את מפשק לחשוף את ההיבט מעולה של בלוטת התימוס.
6. שימוש במלקחי דומון קנס כדי לשחרר את הקצוות לרוחב של רקמת בלוטת התימוס ולחשוף את האונות הרתי נמוכות יותר.
7. משוך את התימוס בעדינות superiorly לאתר החתך הפתוח, מקפיד להימנע ממגע עם כלי וריד נבוב, subclavian ותרדמה מעולים, וכדי למזער את ההפרעה לבטנת pleural העדינה בין התימוס והריאות.
8. כtהוא הרתי כלי גזורים וגילו, בעזרת מיקרו-מספריים לחלק אותם. השתמש בצמר גפן כדי להחזיק את לחץ על כלי לעצירת דימום במידת הצורך.
9. לספק אונות הרתי הנמוכות לתוך החתך ולאחר מכן באופן חד lyse הקבצים המצורפים האחוריים. הסר את התימוס שלם ולבדוק בזהירות את התימוס מוסר מכל חלקים חסרים.
   הערה: בלוטות לימפה בבית חזה קטנות יכולות להיות דמיינו המקיפות את בלוטת התימוס ולעתים קרובות קשים להבחין בין רקמת הרתי. אלה יהיו צמתים עגולים דיסקרטיים עם מראה דומה לרקמת הרתי, אך לא יהיה בהמשכיות עם התימוס.
10. הסר את מפשק Alm ולסגור את שרירי sternohyoid וsternothyoid עם שני קטעו 5-0 תפרי מקסון.
11. החל 2 טיפות של דבק רקמות cyanoacrylate כיתה כירורגית על פני התפרים לאטום את חלל החזה מתחת לאוורור לחץ חיובי.
    הערה: זה יקטין את השכיחות של חזה אוויר ושטף דם.
12. סגור את sternum עם שתי קטע 4-0 תפרי משי על מחט חיתוך. הכנס את המחט דרך פערים בין הצלעות, מקפיד להנחות את המחט ממש מתחת לעצם החזה כדי למנוע את שכבת השריר הבסיסית.
13. סגור את שכבת העור עם תפר ניילון 4-0 ריצה. להפסיק את isoflurane בשלב זה כדי לקצר את תקופת ההחלמה הרדמה לאחר הניתוח.
14. נקה את אתר החתך ועור שמסביב עם גזה טבולה-מלוחה.
15. יישומם של מספר טיפות של Bupivicaine (0.25%) להרדמה מקומית, ואחריו 1 - 2 טיפות של דבק cyanoacrylate על החתך לאטום את החתך.
16. להמשיך לאוורר עד העכברוש מראה סימנים של מאמץ נשימה עצמאי ומתחיל להזיז הגפיים שלה. Extubate החולדה ולאפשר לו להתאושש תחת השגחה צמודה בכלוב מונח על כרית חימום.
17. לנהל עצירות (0.01-0.05 מ"ג / קילוגרם) תת עורי לעכברים מייד לאחר ניתוח ויחזרו כל שעות 8-12 במשך 48 שעות post-אופרטיבי (בדרך כלל 5 מנות בסך הכל). בגיל 24 ו -48 שעות לאחר ניתוח, לנהל carprofen או Meloxicane (4.4 מ"ג / קילוגרם) תת עורי (3 מינונים כולל כוללים המנה טרום הניתוחית).
18. תמשיך לעקוב עד החולדה נעה סביב הכלוב. בכל סימנים של מצוקה נשימתית, לבצע מחדש אינטובציה מחדש חקירה של החזה.
    1. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
    2. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין.
19. הסר את תפרי שכבת עור 1 שבוע לאחר הניתוח.

תוצאות

הליך זה בוצע על חולדות מבוגרות לואיס (n = 26). זמן הפעולה הממוצע היה 15 ± 3 דקות. לא הייתה תמותה במהלך ניתוח. הזמן הממוצע אינטובציה - ממיקום של חולדה על מכשיר אינטובציה להקמת אוורור - היה 45 ± 5 שניות. היו לי 24 חולדות החלמה מלאה מהניתוח ללא עדות לקשיים או דימום בדרכי הנשימה דרך ?...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי לthymectomy מלא מספק גישה פולשנית עם סגירת חתך שלוש שכבה עם יישום דבק כירורגים נועד למזער את הסיבוכים. הסרה מלאה של בלוטת התימוס הודגמה על ידי האובדן של תאי T נאיביים ועל ידי צביעת IHC של רקמת הלימפה mediastinal לcytokeratin.

ההליך...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2" 14-gauge angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator)and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity Fiber-Optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35