비 침습적 기관 내 삽관 성인 쥐에서 전체 흉선

요약

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

초록

신생아 쥐의 흉선은 면역 학적 연구를위한 설립하고 신뢰할 수있는 절차입니다. 그러나, 성인 쥐, 흉막 중단에서 출혈과 기흉의 합병증은 상당한 사망률이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 미니 흉골 절개술과 기관 내 삽관을 이용하여 쥐의 흉선의 간단한 방법이다. 삽관은 비 침습적 쉽게 재현 방법으로 달성 및 기흉을 방지하기 위해 양압 환기 및 흉막 혼란을 최소화하기 위해주의 흉선 절제술을위한 충분한 시간을 허용하는 제어기도를 허용한다. 여전히 흉선의 전체 시각화를 제공하면서 1.5 cm 흉골 절개, 종격동 혈관 및 흉막과의 접촉을 감소시킨다. 종격동의 노출 후, 흉선 배율 하에서 박리 (blunt dissection)에 의해 제거된다. 흉막은 수술 후 접착제의인가 다음에 미리 기관 근육 봉합사에 의해 밀봉 폐쇄된다.흉부 후 피부의 봉합 폐쇄 다음에 흉골 봉합 폐쇄에 의해 폐쇄된다. 유세포 나이브 T 세포의 면역 조직 화학 (IHC) 종격동 조직 염색 및 부재에 의해 입증되는 바와 같이 모든 thymectomies 완료했고, 절차는 96 %의 생존율을 가졌다. 최소한의 합병증 완료 흉선은 흉선 성인 쥐에서 더 면역 학적 연구를 위해 요구되는 경우이 방법은 적합하다.

서문

1960 년대 초 이후, 흉선은 중앙 면역 관용의 개발에서의 중요한 역할을 인정하고있다. 쥐의 흉선은 동종 이식 및 종양 전이의 설정에서 림프구의 분화, 자기 관용, 그리고 immunotolerance에서 흉선의 역할을 정의하는 필수적인 절차로 입증되었습니다. 래트 흉선 제거는 T 세포 고갈 또는 네이티브 나이브 T 세포의 재 출현없이 정의 T 세포 개체군의 양자를 포함하는 연구 전송을 허용한다.

신생아 설치류 Thymectomies 안정적인 결과 ¹ 흡인 기술을 사용하여 달성 될 수있다. 성인 쥐에서,이 기술은 대략 20 %의 사망율과 연관되며, 종종 불완전 ^흉선이 초래한다. 지속적으로 성인 쥐의 완전한 흉선을 달성하기 위해, 중간 흉골 절개를 통해 종격동의 오픈 노출이 필요합니다. 그러나,이6 % ^{2 - 4} - 절차는 1.5에 이르기까지 전반적인 사망률을 선도하는 기관 손상, 출혈과 기흉 등의 합병증과 관련이 있습니다.

지난 20 년 동안 흉선 기술의 개선은 수술 후 합병증을 감소하고 생존율을 향상시켰다. 양압 환기를 허용 기관 내 삽관은 기흉 총 ⁵ 적어있다. 삽관하는 방법은 이전에 직접 성대 시각화를 사용하여 덜 침습적 방법으로 기관에 공개 노출 범위를 설명했다. 삽관 절차와 관련된 합병증은 심장에 구멍 상대 정맥의 열상으로 인한 기관 손상, 성대 파열, 의도하지 않은 식도 삽관, 출혈 등이 있습니다. 또한, 흉막 안감에 낮은 흉선 로브의 근접은 기흉이 발생할 수 있습니다.

여기에 우리의 기술을 설명무딘 엔드 angiocatheter 및 경피 기관 조명을 사용하여 기관 내 삽관의 간단한 방법에 따라 최소 침습 2cm의 피부 절개를 통해 흉선. 흉선은 1.5 cm의 흉골과 종격동을 봉인하고 출혈 및 호흡기 합병증의 발생을 최소화하기 위해 수술 접착제 응용 프로그램과 삼층 폐쇄를 포함한다. 흉선 및 IHC 염색에 흉선 조직의 유무 다음 CD4 ^+와 CD8 ⁺ 나이브 T 세포의 소실에 의해 입증되는 바와 같이이 방법은 확실하게 완료 흉선 초래한다. 수술 시간 및 근교 절차 사망률은 최소로 유지된다.

프로토콜

참고 : 쥐의 사용을 포함하는 모든 실험 절차는 듀크 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.

기관 흡인 삽관 정맥 1. 준비

1. 펜치와 2 인치 14 G의 angiocathether 바늘의 바늘 끝을 잘라.
2. 바늘의 루멘 바늘 코 펜치 폐쇄 핀치.
3. 절단 집게 오픈 루멘의 가장자리 부까지 조여진 부분을 절단하고, 나머지 30 단부 양쪽 가장자리를 컷 - 니들 에지에 45 ° 각도.
4. 바로 슬립 조인트 플라이어의 개방 영역으로 캐 뉼러의 4mm와 약간 위쪽으로 곡선 끝에서 형성 될 때까지 위쪽으로 당겨 - 아래 3 놓습니다.
   참고 :이 기관 (그림 1)에 카테터를 연출 촉진 할 것이다.
5. 캐 뉼러의 끝 가장자리를 부드럽게 미세 사포를 사용한다.
6. angiocatheter 튜브에 무딘 악기를 돌려줍니다. 튜브가 무딘 바늘보다 약간 짧은 있는지 확인하십시오.

2. 사전 외과 적 치료

1. 조작 영역 위에 10X 배율로 설정 운영 현미경을 배치하여 절차 사이트를 설정.
2. 운영 지역에 온난화 패드를 놓고 깨끗한 흡수 패드 커버.
3. 수술 부위 근처의 심장 박동과 혈액 산소 모니터를 설정합니다.
4. 무게 기반 약물 투여 (예를 들면, 수술 후 진통제, 항생제, 또는 림프구 고갈 항체)에 대한 쥐의 무게를.
   참고 : - 450 g의 일반적인 성인 쥐 (350) 사이의 무게.
5. 유도 챔버를 사용하여 기화 3 % 이소 플루 란 _O-2 (3 L / 분)와, 진정 쥐 활성탄을 함유하는 폐 마취제 가스 소기 배기 시스템. 마취 유도 5 분 기관 내 삽관에 필요한 깊은 마취를 제공 할 수 있습니다.
6. 피하 쥐 이전에 삽관 및 수술을 진행하기로 카프로 펜 또는 Meloxicane (4.4 ㎎ / ㎏)을 관리합니다.
7. 삽관 전에 마취 쥐의 목과 가슴을 면도 전기 면도기를 사용합니다.

3. 삽관

1. 삽관 정맥의 끝 부분에 윤활 소량 (예를 들어, KY 젤)을 마찰하여 삽관 설치를 준비합니다. 커넥터 튜브를 통해 이소 플루 란 가스의 흐름을 시작하기 위해 인공 호흡기를 켭니다.
2. 삽관 장치에 쥐를 전송하고 그 상부 앞니 (그림 2A)에 의해 금속 막대에 쥐를 일시 중지합니다.
   주 : 특정 삽관 장치가 온라인으로 구입하실 수 있습니다. 여기에 표시된 모델은 부탄 토치를 사용하여 2 × 4 인치 허리 부분의 섹션 주위에 성형 아크릴 시트를 사용하여 만든되며, 보강을 클로로포름으로 연결됩니다. 바 (또는 금속 와이어) (S) 상에 배치 된 마스킹 테이프 위에 천공 홀에 의해 부착되고아크릴의 IDE는 분열 또는 갈라짐을 방지합니다.
3. 목 (그림 2B)의 복부 표면에서 2cm - 유연한 고휘도 광원 1을 배치하여 쥐의 목을 횡단는-조명.
4. 부드럽게 위쪽과 아래쪽 치아의 측면에 혀를 당겨 학생 표준 패턴 집게 한 쌍을 사용합니다. 파지 한 손의 엄지 손가락과 집게 손가락의 혀의 하단부에 대해 포셉 일측의 평평한 내측 표면 사이에 배치하는 동안 혀. 눌러 복부 후두 (그림 2C)의 후두개와 조리개를 노출한다.
5. 성대를 시각화하고 angiocatheter의 허브가 앞니에 닿을 때까지기도로 열린 성문을 통해 전방 삽관 정맥의 위로 향하게 한, 무딘 끝을 안내합니다.
6. 금속 탐침을 제거하고, 이소 플루 란과 환기를 시작 angiocatheter 개방에 마취 튜브를 연결합니다.
   참고 : 일반적인 산소 플로인공 호흡기 w 비율은 3 % 이소 플루 란 3 L / 분이다.
   1. 14 mmHg로 - ~ (12)의 압력을 달성 볼륨 조절 환기 모드 60 호흡 / 분의 속도로 인공 호흡기를 설정한다. 3cm의 H ₂ O의 기말 양압 (PEEP)을 사용하여
7. 기관 내 튜브의 적절한 배치를 보장하기 위해 인공 호흡기와 동기화 양측 흉벽 확장을 관찰합니다.
8. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 권장 눈 연고를 적용합니다.
9. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
10. 천 테이프의 스트립 쥐의 머리에 기관 내 튜브를 고정합니다. 기관 내 튜브와 마취 유입 튜브 사이의 확고한 연결을 확인합니다.
11. 쥐의 발에 혈액 산소와 심장 박동 모니터를 연결하고 모니터링을 시작합니다. 아무 반응에에 존재하지 확인하여 적절한 마취를 확인전자 핀치.

4. 개흉술과 흉선

1. 프로 시저의 전체 표준 무균 기술을 따르십시오.
   1. 작업 영역과 운영 테이블을 청소하고 70 % 에탄올 용액으로 소독.
   2. 절차를 수행하는 동안 멸균 수술 장갑을 사용하고, 절차를 수행하는 동안 사용되는 모든 장비와 자료를 압력솥.
   3. 전체 가슴 부분에 프로 비돈 요오드를 적용하고 건조 할 수 있습니다. 그 후 거즈에 70 % 에탄올로 피부의 표면을 세정. 멸균 운영 필드를 표시하도록 구멍을 절단 투명한 플라스틱 포장으로 쥐를 커버.
2. 상부 흉부 지역에서 흉골 노치를 확인합니다. 흉골 노치 위 3mm와 무딘 팁 시어 가위를 사용하여 흉골을 따라 말단 중간 선 연장 - 2를 시작하는 피부를 통해 2cm의 중간 선 절개를합니다.
3. 다시 무딘 팁 시어 가위를 사용하여 흉골 노치에서 1.5 cm 중간 흉골 절개를 수행합니다. 케이그냥 천천히 흉골 미리 아래에있는 가위의 아래쪽 가장자리를 EEP​​.
4. 사전 기관 스트랩 근육 (sternohyoid 및 sternothyroid 근육)을 나타 내기 위해 단지 분리 된 흉골 및 오픈 아래에 작은 셨기 견인기를 삽입합니다. 무딘 Graefe 씨의 집게를 사용하여 이전 기관 스트랩 근육을 분리합니다. 주 :이 시점에서, 기관지를 볼 수 있고, 삽관 튜브는 기관 내부 가시화되어야한다.
5. 분리 된 스트랩 근육과 흉골 아래에있는 작은 셨기 트랙터의 접지 단자를 배치합니다. 흉선의 우수한 측면을 노출 트랙터를 엽니 다.
6. 낮은 흉선 로브를 흉선 조직의 측면 가장자리를 해제하고 노출 미세 뒤몽 집게를 사용합니다.
7. 상대 정맥, 쇄골과 경동맥 혈관과 접촉을 피하도록주의하면서 오픈 절개 부위에 부드럽게 우량 흉선을 당기고 흉선과 폐 사이의 섬세한 흉막 안감의 중단을 최소화 할 수 있습니다.
8. t으로그는 혈관 해부 및 공개됩니다 흉선을 분할하는 마이크로 가위를 사용합니다. 필요한 경우 지혈을 위해 혈관에 압력을 유지하기 위해 면봉을 사용합니다.
9. 절개로 낮은 흉선 로브를 제공하고 급격히 후방 첨부 파일을 용해. 그대로 흉선을 제거하고 조심스럽게 누락 부분에 대한 제거 흉선을 검사합니다.
   참고 : 작은 흉부 림프절은 흉선을 둘러싼 시각 종종 흉선 조직에서 구별하기 어려운 할 수있다. 이들은 흉선 조직과 유사한 외관 이산 라운드 노드되지만 흉선과 연속성되지 않습니다.
10. 셨기 견인기를 제거하고 두 5-0 맥슨 중단 봉합과 sternohyoid과 sternothyoid 근육을 닫습니다.
11. 양압 환기에서 종격동를 밀봉 봉합에 걸쳐 수술 학년 시아 노 아크릴 레이트 조직 접착제 2 방울을 적용합니다.
    참고 :이 기흉과 혈종의 발생을 감소합니다.
12. 성을 닫습니다두와 ernum는 절단 바늘에 4-0 실크 봉합사를 중단. 기본 근육층을 피하기 위해 바로 흉골 아래 바늘을 안내하는주의하면서 갈비뼈 사이의 틈을 통해 바늘을 삽입합니다.
13. 실행 4-0 나일론 봉합사로 피부 층을 닫습니다. 수술 마취 회복 기간을 단축하는 것이이 시점에서 이소 플루 란을 중지.
14. 생리 식염수에 적신 거즈로 절개 부위와 주변의 피부를 청소합니다.
15. 절개를 밀봉 절개를 통해 시아 노 아크릴 레이트 접착제 2 방울 - 1 다음 국소 마취에 대한 Bupivicaine (0.25 %)의 몇 방울을 적용합니다.
16. 쥐가 독립적 인 호흡 노력의 흔적을 보여줍니다과 사지를 움직이기 시작 때까지 환기를 계속합니다. 쥐를 튜브를 빼내하고 온난화 패드에 배치 새장에 가까운 관찰에서 복구 할 수 있습니다.
17. 프레 놀핀를 관리 (0.01-0.05 ㎎ / ㎏) 피하 쥐에 즉시 수술 후 48 시간 포마다 8 ~ 12 시간을 반복세인트 작동 가능 (일반적으로 5 총 용량). 24 및 48 시간에서 수술 후, 카프로 펜 또는 Meloxicane (4.4 ㎎ / ㎏) 피하 (수술 전 투여 량을 포함, 3 곳의 총 투여 량)을 관리 할 수​​ 있습니다.
18. 쥐가 새장 주위를 이동 될 때까지 지속적으로 모니터링. 호흡 곤란의 흔적에서, 재 삽관과 가슴의 재 탐사를 수행합니다.
    1. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
    2. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
19. 스킨 층 봉합 일주 수술 후 제거합니다.

결과

이 절차는 성인 루이스 래트 (N = 26)에서 수행 하였다. 평균 수술 시간은 15 ± 3 분이었다. 어떤 수술 사망률은 없었다. 평균 삽관 시간 - 환기의 설립에 삽관 장치에 쥐의 배치에서이 - 45 ± 5 초였다. 24 쥐 수술 후 일 (POD) POD 4 14. 한 쥐 개발 호흡 곤란을 통해 호흡 곤란 또는 출혈의 증거와 함께 작업에서 완전히 회복했고, 종격동을 탐구 재수술을 시행 하였다. 래트 폐 붕괴 로브를 갖는 것으로 밝혀?...

토론

전체 흉선에 대한 본 프로토콜은 합병증을 최소화 할 수 있도록 설계 수술 접착제 응용 프로그램과 3 층 절개 폐쇄와 최소 침습 접근 방식을 제공합니다. 흉선의 완전한 제거는 나이브 T 세포의 손실에 의해 및 종격동 아세포의 림프계 조직 IHC 염색으로 증명되었다.

20 % 인해 늑막, 심장과 함께 흉선의 하엽의 친밀한 관계에 기인 대부분의 사망시 합병증에 - 성인 쥐의 흉선의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
2" 14-gauge angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator)and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity Fiber-Optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35