מיקרוסקופית כוח האטומי של אורות אדומים קולטני אור שימוש במיפוי PeakForce כמותי nanomechanical נכס

Summary

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Abstract

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) משתמש בקצה פירמידה צמוד לשלוחה כדי לחקור את תגובת הכוח של פני השטח. הסטיות של הקצה ניתן למדוד ל~ 10 PN על ידי לייזר וגלאים סקטוריאלית, הניתן להמרה לטופוגרפית תמונה. אפנון משרעת או AFM "מצב קשה" כרוך הבדיקה ביצירת קשר רציפה עם פני השטח בעת נדנוד בתדר התהודה שלה כדי לייצר תמונה. הפועל בשיתוף עם תא נוזל, הקשה מצב AFM מאפשר ההדמיה של מקרומולקולות ביולוגיות כגון חלבונים בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. הקשה במצב AFM דורש כוונון ידני של הבדיקה והתאמות תכופות של מספר רב של פרמטרים סריקה שיכולה להיות מאתגר עבור משתמשים לא מנוסים. כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, התאמות אלה הן לצרוך הזמן ביותר.

PeakForce כמותי nanomechanical נכס המיפוי (PF-QNM) מייצר תמונה על ידי מדידת respon כוחעקומת se לכל נקודת מגע עם המדגם. עם תוכנת ScanAsyst, יכול להיות אוטומטי PF-QNM. תוכנה זו מתאימה את תדירות כונן הגדרת נקודה,, קצב סריקה, רווחים, ופרמטרי סריקה חשובים אחרים באופן אוטומטי למדגם נתון. לא רק שתהליך זה להגן על שני בדיקות ודגימות שבירות, זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהות. PF-QNM תואם להדמית AFM בנוזל; לכן, יש לה יישום נרחב הדמיה חומרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית.

השיטה המוצגת במאמר זה מתארת ​​את היישום של PF-QNM כדי להשיג תמונות של קולטי אור אורות אדומים בקטריאלי, RpBphP3 (P3), מר 'הפוטוסינתזה palustris במדינה מותאם האור שלה. באמצעות שיטה זו, הדימרים בודדים חלבון של P3 ואגרגטים של הדימרים נצפו על משטח נציץ בנוכחות חיץ הדמיה. עם התאמות מתאימות למשטח ו / או ריכוז פתרון, שיטה זועשוי בדרך כלל להיות מיושם על מקרומולקולות הרלוונטית מבחינה ביולוגית אחרת וחומרים רכים.

Introduction

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הפך לכלי חשוב מאוד עבור חוקר את התכונות המבניות ומכאניות של משטחים, דקים סרטים, ומולקולות בודדות מאז המצאתו בשנת 1986 (איור 1). ^1-3 שימוש בנוזל תא, יש לו את השיטה להיות שימושי במיוחד במחקרים של מקרומולקולות ביולוגיות ותאים גם חיים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. ^4-10 מצב הקשה AFM באופן מסורתי משמש להדמית חומרים רכים או מולקולות קשורות באופן רופף למשטח, מאז AFM קשר מצב הוא בדרך כלל לא מתאים בשל לנזק שנגרם על ידי הכוחות לרוחב המופעל על המדגם על ידי שלוחה. ¹¹ AFM טאפינג מצב מפחית באופן משמעותי את הכוחות האלה על ידי כך את הקצה לסירוגין לגעת במשטח ולא להיות בקשר הרציף. במצב זה, השלוחה נעה ליד או תדר התהודה שלה רגיל אל פני השטח. באופן דומה ליצור קשר עם מצב AFM, טופוגרפיה היא אנאליyzed על ידי התוויית התנועה של z-piezo כפונקציה של XY (מרחק).

דינמיקת שלוחה יכולה להיות די יציבה ליד או תהודה; לכן, הם מאוד מאתגרים כדי להפוך מחוץ למצב "מצב יציב". באופן ספציפי, דינמיקה אלה תלויים בשני מאפייני המדגם וסביבת סריקה. למולקולה רכה שנספחה למשטח קשה (ER), לולאת משוב מכוונת היטב למולקולה עשויה להוביל לתנודת משוב למשטח. מבצע בנוזל מסבך עוד יותר את הכוונון של שלוחה. שינויים ברמות טמפרטורה או הנוזל דורשים הסתגלות מתמדת של נקודת סט, רווחים, ופרמטרי הדמיה אחרים. התאמות אלו נוטות להיות זמן רב ומאתגר עבור משתמשים מאוד.

שיא הכוח כמותי nanomechanical נכס מיפוי (PF-QNM), כמו ההקשה AFM מצב, נמנע מאינטראקציות לרוחב על ידי לסירוגין פנייה המדגם (איור 2). ^{12-15 <}/ Sup> עם זאת, PF-QNM פועל במצב ותדרים נמוכים בהרבה מAFM הקשה במצב שאינו מהדהדים. זו מבטלת את אתגרי הכוונון של הקשה במצב AFM, במיוחד אלה החריפו על ידי הנוכחות של נוזל. עם PF-QNM, תמונות נאספות על ידי לקיחת עקומת כוח תגובה בכל נקודת המגע. עם התוספת של תוכנת ScanAsyst, ¹⁵ התאמה של הפרמטרים הסריקה יכולה להיות אוטומטית ותמונה ברזולוציה גבוהה שהושגה בעניין של דקות על ידי אפילו משתמשים לא מנוסים. ברגע שהמשתמש הופך להיות מוכר יותר עם AFM, את כל הפרמטרים האוטומטיים או כל עשוי להתבטל בכל עת שמתירה בניסויים כדי לכוונן את איכות התמונה באופן ידני. מאז הקמתה, PF-QNM הוחל על מפת bacteriorhodopsin, חלבון קרום, וחלבוני ילידים אחרים ברמת submolecular. ^16-18 לbacteriorhodopsin, קיים מתאם ישיר בין גמישות החלבון ורנטגן מבנים קריסטלוגרפיים. PF ¹² -QNM נוצל כדי לחקור תאי חיים עם רזולוציה גבוהה. ^19,20 קשרים חשובים יתר על כן, נתוני PF-QNM יש הובהרו בין המבנה ומכניקה בתוך הקרום כדורית אדומה שהם קריטיים לשלמות תא ותפקודו. ²¹

יש לנו עובדי מיקרוסקופיית שיטות (SPM), ²² כוללים AFM, ²³ כדי לחקור את המבנה של האורות האדום קולטני אור הנקרא bacteriophytochromes (BphPs). ^24,25 הם מורכבים של מודול חישת אור קוולנטית קשור למודול איתות-מפעיל כזה כקינאז היסטידין (HK). ²⁶ מודול אור החישה בדרך כלל מכיל chromophore בלעין, שעובר שינוי מבני על קליטה של פוטון, עם שורה של שינויים מבניים שהגיעו למודול איתות-מפעיל ומוביל לשינוי גלובלי של כל החלבון . ^24,27-29 בהתבסס על השינוי הזה, יש שני של אור מובחן קליטהtates של BphPs, מדינת אור קליטה אדומה ומרחיקה אדומה, מסומן כPr וPFR. Pr הוא מדינה יציבה תרמית, כהה מותאם עבור רוב BphPs. ²⁸ הבסיס המולקולרי של photoconversion Pr / PFR אינו מובן לחלוטין בשל ידע מבני מוגבל של החלבונים האלה. למעט מבנה אחד מד radiodurans, ³⁰ כל המבנים קריסטלוגרפיים רנטגן שפורסם של חלבונים אלה נמצאים במצב הכהה מותאמת וחסרי תחום מפעיל. BphPs שלם הם גדול מדי כדי להיחקר ביעילות על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וקשה לשמצה להתגבש בצורה שלמה שלהם (במיוחד במדינה מותאמת האור) לקריסטלוגרפיה רנטגן. לאחרונה BphPs כבר מהונדס כסמני חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום (של IFP). ^{ביום 31 באפיון} מבני של חלבונים אלה יכול לקדם את הסיוע בעיצוב IFP יעיל. ^32-36

המוקד של מאמר זה הוא להציג הליךהדמיה של BphPs באמצעות AFM נוזל תאים באמצעות PF-QNM. השיטה באה לידי ביטוי במחקרים של המדינה מותאמת אור RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) מחיידק הפוטוסינתזה ר ' palustris. הליך AFM מוצג כאן הוא גישה נוחה וישירה להדמיה של חלבונים, כמו גם מקרומולקולות ביולוגיות אחרות. בשיטה זו, פרטים מבניים של מולקולות בודדות יכולים להיות שנאספו בפרק זמן קצר, בדומה למפגש מעבדה קורס במדע ברמה עליונה. דרך מדידת חתכים והשלמת ניתוחים ממדיים נוספים, ניתן להשוות נתונים ניסיוניים למודלים חישוביים שימושיים. ^37-42

Protocol

.1 מחשב ומיקרוסקופ הגדרה

1. פתח את השסתום של גליל N ₂ ולהתאים את הידיות על מנת להבטיח את שולחן האוויר הוא צף ורמה.
2. הפעל את המחשב, בקר, ואור סיבים האופטי בצו זה.
3. הגדר את הסורק למצב / LFM AFM ולמרכז את המצלמה על ראש AFM.
4. תוכנה פתוחה. קטגוריה בחר ניסוי "nanomechanical מאפיינים", "כמותי nanomechanical מיפוי" תחת קבוצת ניסוי, ו" PeakForce QNM בנוזל "תחת ניסוי. לחץ ניסוי טען ולאחר מכן התקנה.
5. מקד את המצלמה באמצעות אובייקטיבי Z כדי לראות את פני השטח של השלב. Piezos בשימוש הגס למעלה / למטה לעבור השלב כ 1 מ"מ מתחת לפני השטח של צמצם ראש AFM.

2 הכנת משטח נציץ

1. לחץ מדבקה הדבקה על הפנים של דיסק נקי תמיכת מדגם (קוטר 15 מ"מ, 0.8 מ"מ עובי). לדחוף V-4 נציץדיסק כיתה (25 x 25 x 26 מ"מ) על גבי הדבק עד מחובר היטב.
2. לשפשף את חתיכת סרט ברור על נציץ להבטיח שהוא דבק באופן מלא עם אין בועות אוויר. משוך את הקלטת מיציץ מצד אחד וללהעיף אותו באופן שווה. חזור במידת צורך כדי להבטיח נציץ הוא שטוח.
3. גריפ דיסק התמיכה, צד נקי נציץ למעלה, עם פינצטה העגולה (grippers דיסק), ואת המקום על גבי הסורק. נציץ צריך להיות מתחת לרמה של צמצם ראש AFM.

עצרת תא .3 נוזלים והדמיה של משטח נציץ

1. יש לשטוף את תא הנוזל, O-טבעת, מתאם מזרק, מתאם צינור, ואת צינור הפליטה ב100% אתנול. יש לשטוף את תא הנוזל במים די. בואו כל אוויר החלקים להתייבש לחלוטין.
2. דחוף את מתאם הצינור ליציאה בתא הנוזל הנקי. לחץ בעדינות על O-הטבעת לתוך מגרעת מרכז תא הנוזל באמצעות פינצטה בראשות שטוחה.
3. לחץ על האביב בקלילות על קליפ המקדמה בדיקה ולהפוך אותה מgroovדואר על הטיפ.
4. לתפוס את החללית בסוף הארוך מהקצה עם פינצטה בראשות שטוחה. מניחים את החללית לתוך החריץ עם הקצה מול מרכז התא. לדחוף את האביב ובלהתאים את סרטון המקדמה על הבדיקה כדי לאבטח אותו (איור 1).
5. בדוק את המהדק על AFM כדי לוודא שהוא חזר בו באופן מלא (איור 1 ג).
6. הנח את תא נוזל, O-הטבעת ולחקור פונה כלפי מטה, על גבי המדגם נציץ. לאפשר תא הנוזל לנוח על החתיכים של AFM. מנמיכים את המהדק כדי לייצב את תא הנוזל על הבמה. לחץ למטה המתג על המיקרוסקופ עד בדיקה ויזואלית מציגה את O-הטבעת הדחוסה בחוזקה בין דיסק התמיכה ותא הנוזל.
7. בעת הצפייה בצג, להתמקד כפתור הכוונון הגס כדי להמחיש את חלקו העליון של תא הנוזל על המסך.
8. הזז את מיקרוסקופ עד שיהיו תמונה ברורה של הקצה באמצעות X / כפתורי התאמת Y ואובייקטיבי Z. טיפ יהיה appאוזן כמו משולש מתכתי, זהב. להזיז את הקצה קרוב יותר אל פני השטח המדגם באמצעות מנוף piezo על מיקרוסקופ. להתמקד בהשתקפות של הקצה. עקוב אחר שלוחה בפועל ביחס להשתקפות שלה. בשלב זה, הם צריכים להיות מתואמים באופן הדוק, אך לא חופף לחלוטין.
9. חבר את מתאם המזרק למזרק 1 מ"ל סטרילי. חבר קצה אחד של צינור הפליטה למתאם המזרק ומניח את הקצה השני של הצינור במכל של תמיסת חיץ. באופן מלא להאריך את הבוכנה של המזרק.
10. צרף את הצינור למתאם הצינור בתא הנוזל. לחץ בעדינות את הבוכנה עד נוזל ממלא את התא במרכז באופן מלא. בדוק את התא על מנת להבטיח שאין בועות אוויר. בדוק שאין נוזל נשפך החוצה מתא הנוזל על מיקרוסקופ. הנח את המזרק על תמיכה מוצקה שהועלתה.
11. השתמש בהזנת המצלמה וX / ידיות תרגום Y כדי לאתר את הלייזר על המסך (נקודה אדומה מפוזרת). שימוש בmovem הלייזרכפתורי בקרת ent, להעביר את הלייזר על הקצה.
12. דק להתאים את בקרות לייזר ומראה עד אות הסכום מוצג במיקרוסקופ מוגדלת (ערך = 4 - 6).
13. התאם את הזווית של דיודה רבע באמצעות הכפתורים בצד האחורי השמאלי והצד השמאלי העליון של ראש הסריקה כדי להוריד את הסטיות אנכיות ואופקיות המוצגות במיקרוסקופ הקרוב לאפס ככל האפשר (± 0.1).
14. בתוכנה, לבחור אפשרויות רכישה. לכל הפחות, גובה בחר (בוחן הלוך ושוב), שגיאת שיא כוח, ועיוות. אפשרויות האחרות הן שימוש תלוי ויכולות להיות מותאמות אישית המבוססות על המידע הספציפי הרצוי על ידי בניסויים.
15. בחר באפשרות "קו" לRT מטוס Fit בכל חלון רכישה. בחר באפשרות "אף אחד" לOT מטוס Fit בחלונות הגובה. הגדר את X ו Y לקזז וזווית סריקה לאפס, אם לא עשו.
16. הגדר את קצב הסריקה להרץ 1, המדגם בכל שורה ל256, השליטה האוטומטית ScanAsystלאדם, וגבול Z האוטומטי ScanAsyst לכבוי. לשנות את גבול Z 500 ננומטר. הגדר את גודל סריקה עד 1 מיקרומטר.
17. לחץ לעסוק. בשלב זה, את הקצה מתקרב למשטח. בעוד הקצה מתקרב, להתבונן שינוי מתח piezo Z בפינה השמאלית התחתונה של המסך. אם הקצה הולך מחוץ לטווח, למשוך את הקצה ומחדש את הגישה. אם זה לא מוצלח, טיפ ייתכן שיהיה הצורך לשנות כדי שתהיה לי גישה מוצלחת. ברגע שהקצה עוסק, הקווים יתחילו להופיע בכל אחד מחלונות הרכישה שמרכיבים תמונה.
18. קח את התמונות של נציץ ב1 x 1 מיקרומטר ולהתקרב לאט כדי להבטיח שהמשטח נציץ נקי ושטוח. לחץ לכידה רציפה כדי לשמור תמונות כפי שהם מופיעים. להתקרב ולנוע על פני השטח כרצונכם.

.4 חלבון הפקדת והכנת הדוגמה להדמיה

1. להשיג מדגם חלבון מטוהר ³⁸ ולשמור על קרח. אם מאוחסן במקפיא, להפשיר מדגם עלקרח למשך 5 דקות.
2. לדלל את החלבון ל0.0010 מ"ג / פתרון חיץ ההדמיה מ"ל באמצעות קירור. חיץ ההדמיה המשמש כאן הוא 15 מ"מ טריס-HCl (pH = 8.0), 150 mM NaCl, ו15 מ"מ MgCl _2.
3. מלא קאמרי 4 (100 x 15 מ"מ) צלחת פטרי עם פתרון חיץ הדמיה בקירור. ממלא כל תא עם לפחות 5 מ"ל של תמיסה. בעדינות מערבב את פתרון חלבון המדולל בקצה המחובר לmicropipettor.
4. החל 200 μl של פתרון החלבון המדולל אל פני השטח של נציץ כבר מוכנים. לאחר 30 שניות, להרים את פני השטח חלבון / נציץ עם פינצטה העגולה (grippers דיסק). החזק מקביל מדגם לספסל המעבדה.
5. בעוד מחזיק את המדגם, לטבול מייד המדגם בפתרון החיץ כלול ברבע הראשון של צלחת פטרי (צעד 4.2), תוך הבטחה כי המדגם מקביל לאגן של צלחת פטרי. לאחר 1 שניות, להסיר את המדגם.
6. ממשיך להחזיק במקביל המדגם לאגןשל צלחת פטרי, חזור על שלב 4.5 במשך שלושת רבעים הנותרים.
7. מניחים את הדיסק על בד נטול אבק יבש כדי לספוג את הלחות עודפת ולהעביר את הדיסק על הבמה של מיקרוסקופ. אל תיגע במשטח בפועל עם המטלית. אל תאפשר המדגם לייבוש.
8. חזור על שלבים 3.6-3.16.

.5 הדמיה חלבונים על מיכה

1. לחץ על תיבת סימון פרמטרים בצד שמאל של המסך. גודל באביב וברדיוס קצה צריכים להיות מוגדר המבוססים על שימוש הקצה.
2. לחץ לעסוק. באופן דומה לתהליך ההדמיה נציץ (שלב 3.17), לקיים את חלון z-piezo כגישות קצה.
3. לאפשר לסורק תמונה באותו האזור לפחות שני מעברים רצופים. לחץ לכידה רציפה כדי לשמור כל תמונה שנאסף.
4. הזז את הסורק לאזור חדש ו / או לשנות את גודל התמונה בהתאם לצורך.
5. לאחר שהתוכנה האוטומטית סיימה התאמהפרמטרים סריקה לגודל תמונה מסוים, להפוך את התוכנה משם.
6. באופן ידני להתאים את קצב סריקה, גבול z, מספר הקווים, ומתח על מנת לכוונן את המיקוד של התמונה. אם התמונה הופכת להיות יותר מדי מחוץ לפוקוס, פונה תוכנה שוב על להחזיר את המצב ההתחלתי המקורי. כדי להגדיל את הרזולוציה של תמונה, תוך התקרבות על חלבון, להקטין את קצב הסריקה ולהגדיל את מספר הקווים באופן יחסי.
7. לאחר הניסוי, לנקות את נוזל התא עם 100% אתנול ולשטוף עם DI H ₂ O. לאפשר נוזל התא לייבוש מלא.
8. פתח את תוכנת נתונים לעיבוד תמונות נתונים גולמיים. ראשית, לשטח את התמונה על ידי לחיצה על הסמל לשטח. בחר אפס ^ה סדר ולחץ על ביצוע. בהתאם לתמונה, מטוס בכושר עשוי להיות נחוץ כדי להשיג תמונה כראוי שטוחה. במקרה זה, בחר את הסמל בכושר מטוס ולצייר מטוס של אזור שטוח של התמונה באמצעות הסמן. לחץ לבצע. חזור על פי צורך
9. Select כרטיסיית החתך כדי למדוד את הממדים של החלבון. צייר קו עם הסמן להזיז אותו על פני המולקולה או האזור כדי להיות מנותח. חזור על פעולה עבור מספר אזורים והתוכנה תפיק כיסוי. לייצא את התמונה או את הנתונים המשמשים ליצירת תמונה בפורמט תואם לתוכניות תוכנה וציור אחרות.

תוצאות

תמונות AFM נציג של חלבון קולטי אור, P3, במצב מותאם האור שלה מוצגות בתרשימים 3 ו -4. מצע טרי ביקע נציץ (איור 3 א) הוא משטח מתאים, שטוח לחלבון ספיחה. איסוף תמונה של מיקה נקייה כביקורת שלילית הוא חשוב מכמה סיבות. ראשית, הוא מבטח את תא הנוזל נקי ולא חומר?...

Discussion

AFM הוא שיטת מיקרוסקופיית מסוגלת הדמיה חלבונים ומקרומולקולות ביולוגיות אחרות בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית באופן מלא. בהשוואה לקריסטלוגרפיה רנטגן וNMR, מגבלה אחת של AFM היא חוסר יכולתה כדי להשיג את אותה הרזולוציה, במיוחד ברזולוציה לרוחב. בעת השימוש בAFM לנתח מולקול...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Fisher Scientific	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
Multimode 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	equipped with Nanoscope V controller and J scanner
Probe	Bruker-Nano	SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tapping Mode Fluid Cell	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grade	SPI supplies	1150503	25 x 25 x .26 mm
Sample support disk	nanoSurf	BT02236
Petri dish	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
micropipettors	Denville Scientific	XL 3000i
RpBphP3			Prepared according to cited references
Nanoscope software	Bruker-Nano
Fiber Optic Light	Digital Instruments Inc.	F0-50
Pelco AFM Disc Gripper	Ted Pella Inc	1668	12 mm
1 ml syringe	McKesson	102-ST1C
Eppendorf tubes	Denville Scientific	C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1	Schrodinger, LLC