Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Zusammenfassung

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Zusammenfassung

Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet eine Pyramidenspitze auf einem Ausleger angebracht ist, um die Kraftantwort der Oberfläche zu untersuchen. Die Auslenkungen der Spitze kann durch einen Laser und Detektor in Sektoren, die Topographiebild umgerechnet werden können gemessen werden, um ~ 10 pN. Amplitudenmodulation oder "Tapping Mode" AFM umfasst die Sonde so intermittierenden Kontakt mit der Oberfläche beim Oszillieren bei seiner Resonanzfrequenz, um ein Bild zu erzeugen. In Verbindung mit einer Fluidzelle verwendet, Tapping-Mode-AFM ermöglicht die Abbildung von biologischen Makromolekülen, wie Proteinen in physiologisch relevanten Bedingungen. Tapping-Mode AFM erfordert manuelle Abstimmung der Sonde und häufige Anpassungen aus einer Vielzahl von Scan-Parameter, die schwierig sein kann für unerfahrene Anwender. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, sind diese Anpassungen die meiste Zeit.

Peakforce Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM) erzeugt ein Bild durch die Messung einer Kraft Verantse Kurve für jeden Berührungspunkt mit der Probe. Mit ScanAsyst Software können PF-QNM automatisiert werden. Diese Software passt den Sollwert, Antriebsfrequenz, Abtastrate, Gewinne und andere wichtige Scan-Parameter automatisch für eine bestimmte Probe. Nicht nur, dass dieses Verfahren zum Schutz sowohl zerbrechlich Sonden und Proben, es reduziert die erforderliche Zeit, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. PF-QNM ist für AFM in Flüssigkeit kompatibel; Daher war es umfangreiche Anwendung zur Abbildung biologisch relevanten Materialien.

Die in diesem Papier vorgestellte Methode beschreibt die Anwendung von PF-QNM, um Bilder von einer bakteriellen Rotlicht-Photorezeptor, RpBphP3 (P3) zu erhalten, aus photo R. palustris in seinem Licht-adaptierten Zustand. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden einzelne Protein Dimere von P3 und Aggregate von Dimeren auf einer Glimmer-Oberfläche in Gegenwart eines bildgebenden Puffer beobachtet. Mit entsprechenden Anpassungen an die Oberfläche und / oder der Konzentration der Lösung, wobei dieses Verfahrenkann allgemein auch für andere biologisch relevante Makromoleküle und weichen Materialien angewendet werden.

Einleitung

Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein sehr wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der strukturellen und mechanischen Eigenschaften von Oberflächen, dünne Filme und Einzelmoleküle seit seiner Erfindung im Jahr 1986 (Abbildung 1). ^1-3 Verwendung einer flüssigkeits Zelle hat das Verfahren werden in einem physiologisch relevanten Umwelt besonders nützlich in Studien von biologischen Makromolekülen und sogar lebende Zellen. ^4-10 Tapping-Mode-AFM ist traditionell für die Abbildung von weichen Materialien oder locker gebundenen Moleküle an die Oberfläche, da der Kontakt-Modus AFM verwendet worden ist in der Regel nicht geeignet aufgrund auf die Schäden, die durch die seitlichen Kräfte verursacht auf die Probe ausgeübt durch den Freischwinger. Tapping-Modus ¹¹ AFM wesentlich reduziert diese Kräfte, indem er die Spitze weise die Oberfläche berühren und nicht in ständigem Kontakt. In diesem Modus wird der Ausleger an oder nahe seiner Resonanzfrequenz normal zu der Oberfläche in Schwingungen versetzt. Ähnlich wie bei Kontaktmodus AFM ist Topographie analdurch Auftragen der Bewegung der Z-Piezo als eine Funktion der xy-(Abstand) yzed.

Die Ausleger Dynamik bei oder nahe der Resonanz sehr instabil; daher sind sie sehr schwierig, außerhalb eines "steady-state" Situation zu automatisieren. Genauer gesagt, diese Dynamik hängen sowohl von der Probeneigenschaften und Scan-Umgebung. Für eine weiche Molekül auf eine Fest (er) Oberfläche adsorbiert, kann eine gut abgestimmte Rückkopplungsschleife für das Molekül zu Rückkopplungsschwingung für die Oberfläche führen. Betrieb in Fluid erschwert die Abstimmung des Auslegers. Änderungen der Temperatur oder Flüssigkeitsstände erfordern ständige Nachjustierung der Sollwert, Gewinne und andere Bildparameter. Diese Anpassungen sind in der Regel sehr zeitaufwendig und anspruchsvoll für die Nutzer.

Spitzenkraft Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM), wie Tapping Mode AFM, vermeidet lateralen Wechselwirkungen von intermittierend Kontaktieren der Probe (Abbildung 2). ^{12-15 <}/ Sup>, arbeitet jedoch PF-QNM in nicht-resonanten Modus und Frequenzen viel niedriger als Tapping-Mode-AFM. Dadurch entfällt die Abstimmung Herausforderungen Tapping-Mode-AFM, insbesondere durch das Vorhandensein der Flüssigkeit verstärkt. Mit PF-QNM werden Bilder, indem sie eine Kraft-Antwort-Kurve an jedem Kontaktpunkt gesammelt. Mit dem Zusatz von ScanAsyst Software können ¹⁵ Einstellung der Scan-Parameter automatisiert werden und ein hochauflösendes Bild in einer Angelegenheit von Minuten mit dem auch unerfahrene Benutzer erhalten. Sobald der Benutzer mehr mit dem AFM wird, können einige oder alle der automatisierten Parameter zu jeder Zeit, die die Bildqualität der Experimentator manuell ermöglicht die Feineinstellung deaktiviert. Seit seiner Gründung PF-QNM wurde angewandt, um Bakteriorhodopsin, ein Membranprotein und andere native Proteine ​​auf der submolekularen Ebene abzubilden. ^16-18 Für Bakteriorhodopsin, gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinflexibilität und Röntgenkristallstrukturen. PF ¹² -QNM ist verwendet worden, lebende Zellen mit einer hohen Auflösung zu untersuchen. ^19,20 Darüber hinaus hat PF-QNM Daten aufgeklärt wichtige Verbindungen zwischen Struktur und Mechanik in der Erythrozytenmembran, die für die Zellintegrität und Funktion sind. ^21.

Wir haben Rastersondenmikroskopie (SPM) Verfahren eingesetzt, darunter ²² AFM, ^23, um die Struktur der Rotlicht-Photorezeptoren genannt Bakteriophytochrome (BphPs) zu studieren. ^24,25 Sie bestehen aus einer Lichtsensormodul kovalent an eine Signal-Effektor-Modul verlinkten Histidin-Kinase (HK). ²⁶ Die Lichterfassungsmodul enthält typischerweise einen Bilin-Chromophor, der bei der Absorption eines Photons strukturelle Umwandlung erfährt, mit einer Reihe von strukturellen Veränderungen Erreichen der Signal-Effektor-Modul und die zu einer globalen Transformation des gesamten Proteins . ^24,27-29 Basierend auf dieser Transformation gibt es zwei unterschiedliche Lichtabsorptions sTates von BphPs, einem roten und dunkelrotem Licht absorbierenden Zustand, als Pr und Pfr bezeichnet. Pr ist thermisch stabil, dunkeladaptierten Zustand für die meisten BphPs. ^28. Die molekularen Grundlagen der Pr / Pfr-Photo nicht vollständig aufgrund der begrenzten Strukturwissen dieser Proteine ​​zu verstehen. Mit Ausnahme einer Struktur von D. durans, sind ³⁰ alle veröffentlichten Röntgenkristallstrukturen dieser Proteine ​​in der dunkeladaptierten Zustand und Effektor-Domäne fehlt. Die intakten BphPs sind zu groß, um wirksam durch Kernspinresonanz (NMR) untersucht werden und sind notorisch schwierig in ihrer intakten Form kristallisieren (insbesondere in der Licht adaptierten Zustand) für Röntgen-Kristallographie. BphPs wurden vor kurzem als Infrarot-Fluoreszenzproteinmarker entwickelt worden (IFP). ^31. Strukturelle Charakterisierung dieser Proteine ​​kann Hilfe in effektive IFP Design zu fördern. ^32-36

Der Schwerpunkt dieses Artikels ist es, ein Verfahren für präsentierenAbbildung BphPs mit Flüssig-Zelle über AFM PF-QNM. Das Verfahren wird durch Untersuchungen der licht adaptierten Zustand des Bakteriophytochrom RpBphP3 (P3) aus dem Photosynthesebakterium R. nachgewiesen palustris. Das hier vorgestellte Verfahren AFM ist bequem und einfacher Ansatz zur Darstellung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen. Mit diesem Verfahren können strukturelle Einzelheiten der einzelnen Moleküle in einem kurzen Zeitraum, ähnlich einer oberen Ebene Wissenschaft natürlich Laborsitzung gesammelt werden. Über Messquerschnitte und Erfüllen weiteren eindimensionalen Analysen können experimentelle Daten, um nützliche Rechenmodelle verglichen werden. ^37-42

Protokoll

1. Computer und Mikroskop Set Up

1. Öffnen Sie das Ventil der N _2-Zylinder, und stellen Sie die Regler, um sicherzustellen, dass die Lufttisch schwimmt und Niveau.
2. Schalten Sie den Computer, Controller und Faseroptik-Licht in dieser Reihenfolge.
3. Stellen Sie den Scanner an AFM / LFM-Modus und in der Mitte der Kamera über der AFM Kopf.
4. Offene Software. Wählen Experiment Kategorie "Nanomechanische Eigenschaften", "Quantitative Nano Mapping" unter Experiment-Gruppe und "Peakforce QNM in Fluid" unter Experiment. Klicken Sie auf Laden Experiment und dann einrichten.
5. Fokussieren Sie die Kamera mit dem Ziel, den Z Oberfläche der Bühne zu sehen. Verwendung des groben oben / unten bewegen Piezos die Bühne etwa 1 mm unter der Oberfläche des AFM Kopföffnung.

2. Herstellung von Glimmer-Oberfläche

1. Drücken eines Aufklebers auf das Gesicht eines sauberen Probenträgerplatte (15 mm Durchmesser, 0,8 mm dick). Schieben Sie einen Glimmer V-4Grade Platte (25 x 25 x 26 mm) auf die Klebe bis fest angeschlossen ist.
2. Reiben ein Stück Tesafilm auf das Glimmer gewährleisten sie vollständig ohne Luftblasen eingehalten werden. Ziehen Sie das Band vor der Glimmer von einer Seite zur gleichmäßig spalten. Bei Bedarf wiederholen, um sicherzustellen, der Glimmer ist flach.
3. Fassen Sie die Stützscheibe, sauber Glimmer Seite nach oben, mit einem Paar von Kreis Pinzette (Plattengreifer) und legen Sie den Scanner ein. Der Glimmer sollte unter dem Niveau des AFM Kopföffnung sein.

3. Flüssigkeitszelle Versammlung und Imaging von Glimmeroberfläche

1. Spülen der Fluidzelle, O-Ring, Spritzenadapter, Schlauch-Adapter, und die Ausstoßschlauch in 100% Ethanol. Spülen Sie die Flüssigkeitszelle in DI-Wasser. Lassen Sie alle Teile Luft vollständig trocknen.
2. Schieben Sie den Schlauchadapter in den Anschluss auf der sauberen Flüssigkeitszelle. O-Ring drücken Sie vorsichtig in die Mitte der Vertiefung Fluidzelle mit Flachkopf Pinzette.
3. Drücken Sie die Feder leicht auf die Sonde Halteclip und drehen Sie es weg von der Groove für den Tipp.
4. Fassen Sie die Sonde am langen Ende von der Spitze mit Flachkopf Pinzette. Die Sonde in die Nut mit der Spitze zur Mitte der Zelle. Schieben Sie den Frühling in und stellen Sie die Halteklammer über die Sonde, um sie (Abbildung 1B) zu sichern.
5. Überprüfen Sie die Klemme an der AFM, um sicherzustellen, es ist vollständig eingefahren (Abbildung 1c).
6. Legen Sie die Flüssigkeitszelle, O-Ring und die Sonde nach unten, oben auf dem Glimmer Probe. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle, um auf die Bolzen des AFM Ruhe. Senken Sie die Klammer zur Stabilisierung der Zellflüssigkeit auf der Bühne. Drücken Sie die Down-Schalter auf dem Mikroskop, bis eine visuelle Inspektion zeigt die O-Ring fest zwischen der Trägerscheibe und der Fluidzelle zusammengedrückt.
7. Während Sie den Monitor, konzentrieren sich die Grobtrieb, um die Spitze der Fluidzelle auf dem Bildschirm sichtbar zu machen.
8. Bewegen Sie den Mikroskop, bis es ein klares Bild von der Spitze über die X / Y-Stellknöpfe und die Z-Ziel. Die Spitze wird AppOhr wie eine metallische, goldene Dreieck. Bewegen der Spitze näher an die Probenoberfläche unter Verwendung der unten piezoHebel am Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf die Reflexion der Spitze. Verfolgen Sie die aktuellen Freischwinger in Beziehung zu seinen Überlegungen. In diesem Stadium sollten sie aneinander ausgerichtet werden, jedoch nicht vollständig überlappen.
9. Befestigen Sie den Spritzenadapter in eine sterile 1 ml Spritze. Ein Ende des Ausstoßschlauch mit dem Spritzenadapter und das andere Ende des Schlauchs in den Behälter der Pufferlösung. Ziehen Sie die Kolben der Spritze.
10. Befestigen Sie den Schlauch an den Schlauchadapter an der Fluidzelle. Drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit die mittlere Kammer vollständig ausfüllt. Prüfen Sie die Zelle, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen. Überprüfen, um zu sehen, gibt es keine Flüssigkeit auslaufen aus der Fluidzelle auf das Mikroskop. Legen Sie die Spritze auf einem festen Träger angehoben.
11. Verwenden Sie die Kamera-Feed und die X / Y-Knöpfe Übersetzung, um den Laser auf dem Bildschirm (ein diffuser roter Punkt) zu lokalisieren. Mit dem Laser movement Bedienknöpfe, bewegen Sie den Laser auf die Spitze.
12. Feineinstellung der Laser und Spiegel kontrolliert, bis das Summensignal auf dem Mikroskop angezeigt wird maximiert (Wert = 4 - 6).
13. Stellen Sie den Winkel des Quadranten-Diode mit den Knöpfen an der linken hinteren Seite und der linken oberen Seite der Scankopf an die vertikalen und horizontalen Auslenkungen am Mikroskop so nahe wie möglich bei Null (± 0,1) angezeigt senken.
14. In der Software, wählen Akquisitionsmöglichkeiten. Auf ein Minimum, wählen Höhe (Spur und Rück), Spitzenkraft Fehler und Deformation. Die anderen Optionen sind benutzerabhängig und kann auf der Grundlage der von der Experimentator gewünschten spezifischen Informationen angepasst werden.
15. Wählen Sie "Linie" für RT Flugzeug Fit in jedem Aufnahmefenster. Wählen Sie "None" für die OT Flugzeug Fit in den hohen Fenstern. Stellen Sie die X und Y-Offset und Scanwinkel auf Null, wenn nicht bereits geschehen.
16. Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz, der Probe pro Zeile bis 256, die ScanAsyst Selbststeuerungeinzelne, und ScanAsyst Auto Z Grenze ab. Ändere die Z Grenze bis 500 nm aufweist. Stellen Sie Scangröße bis 1 um.
17. Klicken einrasten. An diesem Punkt ist die Spitze der Oberfläche nähert. Während die Spitze nähern, beobachten Z Piezo Spannungsänderung in der unteren linken Ecke des Bildschirms. Wenn die Spitze außerhalb des Bereichs liegt, ziehen Sie die Spitze und Re-Ansatz. Wenn dies nicht erfolgreich ist, muss die Spitze, um einen erfolgreichen Ansatz umgestellt werden. Sobald die Spitze eingeschaltet ist, werden die Linien beginnen, sich auf jede der Erwerb Fenster, die ein Bild zu komponieren erscheint.
18. Nehmen Sie Bilder von Glimmer mit 1 x 1 um und vergrößern sich langsam, um zu gewährleisten, dass die Glimmeroberfläche eben und sauber ist. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme das Speichern von Bildern, wie sie erscheinen. Vergrößern und bewegen sich um die Oberfläche nach Wunsch.

4. Proteinablagerung und Herstellung der Probe für Imaging

1. Erhalten gereinigtes Protein Probe ³⁸ und auf Eis zu halten. Wenn in einem Gefrierschrank gelagert, aufgetaut Probe aufEis für 5 min.
2. Verdünnen das Protein zu 0,0010 mg / ml unter Verwendung von Kühl Bildgebung Pufferlösung. Die Abbildungspuffer verwendet hier 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl und 15 mM MgCl _2.
3. Füllen Sie ein 4-Kammer (100 x 15 mm) Petrischale mit Kühl Bildgebung Pufferlösung. Füllen Sie jede Kammer mit mindestens 5 ml Lösung. Vorsichtig mischen die verdünnte Proteinlösung mit der Spitze auf Mikropipette befestigt.
4. Anwenden 200 ul der verdünnten Proteinlösung auf der Oberfläche von Glimmer bereits vorbereitet. Nach 30 sec, holen die Protein / Glimmer-Oberfläche mit den kreisförmigen Pinzette (Plattengreifer). Halten Sie die Probe parallel zu dem Labortisch.
5. Während die Probe hält, tauchen sofort die Probe in der im ersten Quadranten der Petrischale (Schritt 4.2) enthaltenen Pufferlösung, während sichergestellt wird, dass die Probe parallel zum Becken der Petrischale ist. Nach 1 sec, entfernen Sie die Probe.
6. Weiter, um die Probe parallel zum Becken haltender Petrischale, wiederholen Sie Schritt 4.5 für die restlichen drei Quadranten.
7. Legen Sie die Festplatte auf einem trockenen staubfreien Tuch zu tanken überschüssige Feuchtigkeit und übertragen Sie die Festplatte auf die Bühne des Mikroskops. Die eigentliche Oberfläche nicht berühren mit dem Tuch. Erlauben nicht die Probe zu trocknen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,16.

5. Imaging Proteine ​​auf Glimmer-

1. Klicken Sie auf Prüfparameter-Box auf der linken Seite des Bildschirms. Frühling Größe und Spitzenradius sollte basierend auf der Spitze eingesetzt eingestellt werden.
2. Klicken einrasten. Ähnlich wie bei der bildgebenden Verfahren Glimmer (Schritt 3.17), beobachten die z-Piezo-Fenster, wie die Spitze Ansätze.
3. Lassen Sie den Scanner, um Bild die gleiche Fläche für mindestens zwei aufeinander folgenden Durchgängen. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme, jede gesammelt Bild zu speichern.
4. Bewegen Sie den Scanner an einen neuen Region und / oder ändern Sie die Bildgröße nach Wunsch.
5. Nach der automatisierten Software Einstellen des fertig istScan-Parameter für eine bestimmte Bildgröße, drehen Sie die Software aus.
6. Manuell einstellen Scanrate, Z-Limit, die Anzahl der Zeilen und die Spannung, um die Feineinstellung des Fokus des Bildes. Wenn das Bild wird zu weit aus dem Fokus, drehen Software zurück auf die ursprüngliche Ausgangsposition zurück. Um die Auflösung eines Bildes beim Zoomen auf einem Protein zu erhöhen, verringern Sie die Scan-Rate und erhöhen die Anzahl der Linien proportional.
7. Nach dem Versuch, reinigen Sie die Flüssigkeit-Zelle mit 100% Ethanol und spülen Sie mit DI H ₂ O. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle vollständig trocken.
8. Öffnen Sie die Daten Software, um Rohdaten-Bilder verarbeiten. Erste, glätten Sie das Bild durch Klicken auf die Flatten-Symbol. Wählen Sie ^Null-ter Ordnung und klicken Sie auf Ausführen. Je nach Bild kann eine Ebene passen notwendig sein, eine entsprechend flache Bild zu erhalten. In diesem Fall wählen Sie die Ebene fit Symbol und ziehen Sie eine Ebene einer flachen Bereich des Bildes mit dem Cursor. Klicken Sie auf Ausführen. Bei Bedarf wiederholen
9. Select die Registerkarte Querschnitt, um die Dimensionen des Proteins messen. Ziehen Sie eine Linie mit dem Cursor bewegen Sie ihn über das Molekül oder Bereich analysiert werden. Wiederholen für mehrere Bereiche und die Software wird eine Überlagerung zu erzeugen. Exportieren Sie das Bild oder die verwendet werden, um Bild in einem Format kompatibel zu anderen Software-und Zeichenprogrammen erzeugen Daten.

Ergebnisse

Vertreter AFM-Bilder von einem Photorezeptor-Protein, P3, in seinem Licht-adaptierten Zustand sind in den 3 und 4 dargestellt. Ein frisch geschnittenen Glimmer-Substrat (3A) ist eine geeignete, ebene Fläche für Protein-Adsorption. Sammeln eines Bildes saubere Glimmer als Negativkontrolle ist aus mehreren Gründen wichtig. Zunächst versichert es der Flüssigkeitszelle ist sauber und keine Reststoffe aus früheren Experimenten wird die Oberfläche verunreinigen. Zweite...

Diskussion

AFM ist ein Rastersondenmikroskopie Verfahren vollständig in der Lage Abbildung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen in physiologisch relevanten Bedingungen. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie und NMR, eine Begrenzung der AFM ist ihre Unfähigkeit, die gleiche Auflösung, insbesondere die laterale Auflösung zu erzielen. Bei der Verwendung von AFM, ein Molekül auf einer Oberfläche zu analysieren, müssen die Auswirkungen der Oberfläche und der Sonde auf dem Bild des Moleküls auch bei der Dat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Fisher Scientific	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
Multimode 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	equipped with Nanoscope V controller and J scanner
Probe	Bruker-Nano	SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tapping Mode Fluid Cell	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grade	SPI supplies	1150503	25 x 25 x .26 mm
Sample support disk	nanoSurf	BT02236
Petri dish	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
micropipettors	Denville Scientific	XL 3000i
RpBphP3			Prepared according to cited references
Nanoscope software	Bruker-Nano
Fiber Optic Light	Digital Instruments Inc.	F0-50
Pelco AFM Disc Gripper	Ted Pella Inc	1668	12 mm
1 ml syringe	McKesson	102-ST1C
Eppendorf tubes	Denville Scientific	C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1	Schrodinger, LLC