הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

Summary

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Abstract

ההדמיה של תחזיות עצביות באורך מלא בעוברים היא חיונית כדי לזכות בהבנה של איך יונקים רשתות עצביות לפתח. כאן אנו מתארים שיטה לתייג באתר משנה של גנגליון שורש הגבי תחזיות האקסון (DRG) כדי להעריך את המאפיינים פנוטיפי שלהם באמצעות כמה שורות עכבר מניפולציות גנטית. נוירונים TrkA חיובי נוירונים קולטן אזעקה, שהוקדשו להעברת אותות כאב. אנו מנצלים קו עכבר TrkA ^taulacZ לתייג המסלולים של כל האקסונים ההיקפיים TrkA החיובי בעובר העכבר ללא פגע. בנוסף, אנו להתרבות קו TrkA ^taulacZ על רקע null Bax, אשר למעשה מבטל אפופטוזיס העצבי, על מנת להעריך את השאלות הקשורות לצמיחה באופן עצמאי מהשפעות אפשריות של מניפולציות גנטיות על הישרדות עצבית. בהמשך לכך, עכברים מהונדסים גנטי של עניין הם התרבו עם ^taul TrkAקו וnull acZ / Bax אז הם מוכנים למחקר באמצעות הטכניקות המתוארות במסמך זה. מצגת זו כוללת מידע מפורט על תוכניות רבייה עכבר, genotyping בזמן הנתיחה, הכנת רקמה, צביעה וסליקה, כדי לאפשר ויזואליזציה של מסלולי axonal באורך מלא בהכנה כל הר.

Introduction

הקמת רשתות עצביות מדויקות היא תהליך התפתחותי מורכב חיוני לפעולה התקינה של מערכת העצבים. הפרעה בתהליך זה מובילה לבעיות בתפקוד עצביים שהיה מעורב במחלות נוירולוגיות אנושיות ^1-3. כדי לחקור את המנגנונים מולקולריים שבבסיס של צמיחת האקסון ועצבוב היעד ביונקים, שפיתחנו פרוטוקול לדמיין מסלולי axonal של TrkA להביע עצב סנסורי באמצעות שילוב של שני קווי עכבר מהונדסים גנטי.

TrkA הוא קולטן לגורם גדילה עצבית NGF ומהווה סמן תפקודי של עצב סנסורי nociceptive ^4. TrkA מתבטא מאוד בתאי עצב nociceptive במהלך התפתחות מוקדמת ומתווך הישרדות NGF תלוי נוירון, צמיחת האקסון, arborization ויעד עצבוב ^5-9. בעכברי TrkA ^taulacZ, גן TrkA הסוג בר הוא הוחלף על ידי ג ביטוי taulacZ¹⁰ assette, כך שמורפולוגיה axonal של נוירונים TrkA החיובי משוערים ניתן דמיינה ידי β-gal (X-gal) מכתים ^11. באמצעות קו TrkA ^{taulacZ / WT} הטרוזיגוטיים, אנו יכולים לבחון גורמים שעשויים לווסת או להפריע להתפתחות של תחזיות מביא חושיות in vivo.

יתר על כן, ביטוי TrkA נעדר בעכברי TrkA ^{taulacZ / taulacZ} הומוזיגוטים, אשר על כן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את צמיחת האקסון קידום מנגנונים בהעדר איתות NGF / TrkA. מאז הנוירונים nociceptive תלויים בNGF / TrkA איתות לא רק לצמיחת האקסון, אלא גם להישרדות, אנו מעסיקים קו עכבר אחר, חסר את גן Bax פרו-אפופטוטיים, לעכב אפופטוזיס בתאי עצב DRG עוברי, מציל אותם ממוות של תאים שהוא אחרת נצפה בהעדר איתות TrkA. Bax ^{- / -} הרקע ¹² וכך מאפשר לmolecuנתיחת lar של מסלולי איתות שדווקא משפיעים ^7-9,13-15 צמיחת האקסון. בTrkA ^{- / -:} Bax ^{- / -} עכברים, תאי עצב DRG לשרוד, אבל עצבוב מביא חושי בעור הוא בוטל לחלוטין ^14,15. אנחנו באופן סלקטיבי יכולים להפעיל מסלולי איתות כדי לקבוע התרומות שלהם לפיתוח תחזיות האקסון. השירות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ההערכה של שינויים בפנוטיפים צמיחת axonal כאשר שינויים גנטיים שונים הם התרבו על TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} או TrkA ^{taulacZ / WT:} Bax ^{- / -} רקע.

Protocol

הערה: כל הנהלים עומדים במדריך NIH לשימוש וטיפול בחי מעבדה. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי IACUC במכללה רפואית ווייל קורנל.

1. רקמות הכנה

1. להרדים נקבות מתוזמן-הריון על ידי צוואר רחם עקירה ^15. לנתח E16 עובריים - עוברי E18 מנקבות מתוזמן-הריון ועוברי מקום בנפרד בבארות של צלחת 6-גם, מלאות מלוח פוספט הקר שנאגרו (PBS).
2. יש לשטוף את העוברים בקור PBS.
3. הסר חלק קטן של הקרום מי השפיר של העובר והמקום בפתרון K proteinase מוכן מראש עבור genotyping שלאחר מכן. לחלופין, אם הקרום מי השפיר הולך לאיבוד, להסיר חלק קטן מקצה זנב העובר ולמקם אותו בפתרון K proteinase
4. חורים לתוך העור בכל רחבי העובר באמצעות סיכות חרקים (לפחות 100 לכל צד).
5. הסר PBS ולאט לאט להוסיף paraformaldehyde 2% טריים (PFA),pH 7.4, ול.
6. נער בעדינות לשעה 2 ב 4 ° C.
7. יש לשטוף את עוברי פעמים PBS ולאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס עד צביעה.

2. Genotyping

1. לטבול את הקרומים מי שפיר או זנבות עובר בתערובת K proteinase לפי הוראות היצרן.
2. לדגור על 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. לחלץ DNA באמצעות ערכת טיהור DNA זמינה מסחרי.
4. קח 0.5 μl של 200 μl הכולל מטוהר פתרון הדנ"א הגנומי, לשלב את זה עם 0.5 μl של כל אחד מצבעי יסוד הגן ספציפי תחושה וantisense (10 מיקרומטר), 2 μl dNTP Mix (2.5 מ"מ של dATP, dCTP, dGTP וdTTP) , 0.2 פולימראז μl תקי (5 U / μl) וחיץ 2 μl PCR (10x), להוסיף H ₂ O כדי בהיקף כולל של 20 μl.
   הערה: רצפי פריימר הם כדלקמן (טבלה 1):
   TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; frag PCRאורך ment: 400 basepairs (נ"ב).
   Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; אורכי PCR בר: סוג בר, 304 נ"ב; null Bax, 507 נ"ב.
   TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; אורך PCR בר: 360 נ"ב.
5. הפעל PCR עם התכנית לTrkA הבאה: שלב 1: 1 דקות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 2: 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 3: 20 שניות על 68 מעלות צלזיוס, שלב 4: 30 שניות על 72 מעלות צלזיוס. חזור על שלבים 2-4 במשך 40 מחזורים.
   1. לLacZ וBax, לרוץ PCR עם התכנית הבאה: צעד 1: 1 דקות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 2: 10 שניות על 95 מעלות צלזיוס, שלב 3: 1 דקות על 54 ° C, שלב 4: 1 דקות ב 72 מעלות צלזיוס, חזור על השלבים 2-4 במשך 35 מחזורים.
6. דגימות הפעלת PCR על ג'ל 2% agarose ב 100 V במאגר 1x טריס-אצטט-EDTA במשך 20 דקות עם נתיב של סולם DNA להעריך אורכי בר.
7. לנתח עובר לנוכחות של הסוג בר TrkA, TrkA-tauLacZ וBax אללים null. גנוטיפים של עוברים ניסיוניים הם TrkA ^{taulacZ / WT:} Bax ^{- / -} וTrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -,} בהתאם לשאלות הניסיוניות. העוברים חסרי כתב tauLacZ יהיו שליליים עבור מכתים axonal ולכן יכולים לשמש בקרות שליליות לכייל את תהליך הצביעה.

3. העובר מכתים

1. השתמש בערכה מסחרית מכתים lacZ עם כמה שינויים כמפורט להלן בסעיפי 3.2-3.8. כאן, השתמש בערכת Millipore.
2. לטבול את העוברים במאגר לשעה לפחות 1, רועדים בעדינות בטמפרטורת חדר.
3. ישירות לטבול עוברים במאגר B לפחות 15 דקות, רועד בעדינות בטמפרטורת חדר.
4. בעוד עוברים נמצאים במאגר A / B, פתרון Base רקמות טרום חם על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5 מיליליטר של תמיסת בסיס רקמות לעובר.
5. בעוד עוברים נמצאים במאגר A / B, להכין 5-br הטריomo- 4 כלורופורם 3 indolyl α-D-galactopyranoside (X-gal) בריכוז של 40 מ"ג / מיליליטר ב 100 sulfoxide דימתיל% (DMSO).
6. לדלל X-gal לפתרון בסיס רקמות המחומם מראש בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ​​ולהוסיף 5 מיליליטר של X-gal / תערובת בסיס רקמות לבקבוקון נצנץ זכוכית.
7. העבר את העוברים לבקבוקון נצנץ זכוכית המכיל תערובת Base X-gal / רקמות. לאטום את המכסה עם Parafilm ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בדיקה לנוכחות של כתם כחול.
8. עוברי Postfix עם 4% טריים PFA, pH 7.4. נער בעדינות במשך 4 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
9. יש לשטוף את העוברים פעמים PBS הקר.

4. רקמות התייבשות וסליקה

1. עוברי מקום ב -50% מתנול / 50% תערובת PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועדות בבקבוקוני הזכוכית.
2. המשך ליבש במתנול 75% / 25% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועד בבקבוקוני זכוכית.
3. המשך ליבש ב -90% מתנול / 10% PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, רועדות בבקבוקוני זכוכית.
4. המשך ליבש במתנול 100% למשך 30 דקות (2x) בטמפרטורת חדר, רועד בבקבוקוני זכוכית.
5. בעוד עוברים להתייבשות, להכין 1: 1 (v: v) תערובת של אלכוהול ונזואיל נזואיל בנזואט.
   הערה: בנזואט האלכוהול בנזואיל ונזואיל הוא רעיל.
6. לטבול את העוברים ב1: 1 (v: v) תערובת של מתנול 100%: 100% באב במשך 15 דקות. השתמש אך ורק משום שזכוכית באב יתמוסס פלסטיק.
7. לטבול את העוברים ב100% באב לברור לחלוטין הרקמה ולדמיין צביעת X-gal בעובר פינה.
   הערה: תמונה בהקדם האפשרי משום שכתם X-gal יימוג לאורך זמן.

5. הר שלם הדמיה

1. לייצב את העובר, שקוע ב100% באב, בזוויות המתאימות למלקחי מתכת צילום באמצעות. להאיר באמצעות שילוב של מקורות עד-אור ותחת אור אור.
2. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ לנתחמצויד במצלמה דיגיטלית. קח חשיפות שדה בהירות מרובות בחמישה מטוסי מוקד רצופים 0.5 מ"מ זה מזה לאורך ציר Z. זמני חשיפה וF- מפסיק עשויות להשתנות בהתאם למפרט תאורה ומצלמה וצריכים להיות מותאמים לכל התקנה.
3. השתמש בתוכנת עיבוד תמונה סטנדרטית לעיבוד תמונות כיסוי וליצור photomontages.

תוצאות

גנוטיפים של TrkA ^{WT / taulacZ:} Bax ^{- / -} וTrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} עוברים ניתן לקבוע באופן חד משמעי על ידי genotyping PCR הסטנדרטי (איור 1). מציגה צביעת X-gal מפורט סוכות axonal היקפיים תת עורי בעוברים מוכתמים קונבנציונלי (איורים 2, 3 א), ובכל רחבי העובר לאחר ?...

Discussion

ההליך מכתים X-gal-שתואר לעיל של עכברי TrkA ^taulacZ עובריים מאפשר ההדמיה המהירה ומפורטת של תחזיות האקסון למרחקים ארוכים בעובר הקבוע בשלמותה. בגלל רקע null Bax עכברים אלה מאפשרים לחיטוט של איתות מנגנונים שעשויות לתרום לצמיחת שני האקסון והישרדות עצבית. הזדווגות עם...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
Tissue Rinse Solution A	Millipore	BG-6-B
Tissue Rinse Solution B	Millipore	BG-7-B
Tissue Stain Base Solution	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Glass scintiallation vial	Kimble Chase	74500-20
Incubator	Labline	Model 120
Insect pins	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
6-well dish	USA Scientific	CC7672-7506
Primers	IDT	custom DNA primers
Takara dNTP mixture	Takara	4030
Takara LA buffer	Takara	RR002A
Takara LA Taq	Takara	RR002A
PCR machine	Bio-Rad	DNA Engine Dyad
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	B-1042
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B-6630
Dissecting microscope	Leica	M205A
Camera	Leica	DFC310FX
Ring light	Leica	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0