Whole-monter imagerie de l'embryon de souris projections sensorielles Axon

Résumé

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Résumé

La visualisation de pleine longueur projections neuronales dans les embryons est essentiel d'acquérir une compréhension de la façon dont les mammifères réseaux neuronaux se développent. Nous décrivons ici un procédé pour marquer in situ un sous-ensemble de ganglion de la racine dorsale (DRG) de projections axonales à évaluer leurs caractéristiques phénotypiques utilisant plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Les neurones TrkA-positif sont des neurones nocicepteurs, dédiées à la transmission des signaux de douleur. Nous utilisons une lignée de souris TrkA ^taulacZ d'étiqueter les trajectoires de tous les axones périphériques TrkA-positif dans l'embryon de souris intactes. Nous élevons en outre la ligne TrkA ^taulacZ sur un fond nul Bax, qui abolit essentiellement apoptose neuronale, afin d'évaluer les questions indépendamment de possibles effets de manipulations génétiques sur la survie neuronale liés à la croissance. Par la suite, les souris génétiquement modifiées d'intérêt sont élevés avec le TrkA ^TaullacZ / Bax ligne nulle et sont alors prêts pour l'étude en utilisant les techniques décrites ici. Cette présentation contient des informations détaillées sur les plans d'élevage de souris, le génotypage au moment de la dissection, la préparation des tissus, la coloration et la compensation pour permettre la visualisation de pleine longueur trajectoires axonales dans l'ensemble du montage préparation.

Introduction

Mise en place des réseaux neuronaux précis est un processus complexe du développement essentiel pour le fonctionnement du système nerveux. La perturbation de ce processus conduit à un dysfonctionnement neuronal qui a été impliquée dans des maladies neurologiques humaines ^3.1. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la croissance axonale et la cible innervation chez les mammifères, nous avons développé un protocole de visualiser les trajectoires axonales de TrkA exprimant neurones sensoriels utilisant une combinaison de deux lignées de souris génétiquement modifiées.

TrkA est un récepteur pour le facteur NGF de croissance des nerfs et est un marqueur fonctionnel des neurones sensoriels nociceptifs ^4. TrkA est fortement exprimé dans les neurones nociceptifs au cours du développement précoce et la médiation de la survie des neurones dépendant du NGF, la croissance des axones, arborisation cible innervation et ^9.5. Chez les souris TrkA ^taulacZ, le gène de type sauvage TrkA est remplacé par une expression de c taulacZassette ^10, de telle sorte que la morphologie axonale des neurones positifs putatifs TrkA peut être visualisée par β-gal (X-gal) ¹¹ coloration. Utilisation d'une ligne TrkA ^{taulacZ / WT} hétérozygote, nous pouvons examiner les facteurs qui peuvent réglementer ou interférer avec le développement de projections sensorielles afférentes in vivo.

En outre, l'expression TrkA est absent chez les souris homozygotes TrkA ^{taulacZ / taulacZ,} qui peuvent donc être utilisés pour évaluer la croissance de l'axone promouvoir des mécanismes en l'absence de signalisation du NGF / TrkA. Etant donné que les neurones nociceptifs dépendent de NGF / TrkA signalisation non seulement pour la croissance des axones, mais aussi pour la survie, on emploie une autre lignée de souris, dépourvu du gène Bax pro-apoptotique, pour inhiber l'apoptose dans les neurones de DRG embryonnaires, les sauver de la mort cellulaire qui est par ailleurs observé en l'absence de signalisation TrkA. Le Bax ^{- / -} fond ¹² permet ainsi pour la molécudissection lar des voies qui affectent spécifiquement ^7-9,13-15 de croissance axone signalisation. Dans TrkA ^{- / -: -} Bax ^{/ -} souris, les neurones DRG survivre, mais sensorielle innervation afférente dans la peau est complètement abolies ^14,15. Nous pouvons activer sélectivement les voies de signalisation pour déterminer leurs contributions respectives à l'élaboration de projections axonales. L'utilité de cette méthode est qu'elle permet à l'évaluation des changements de phénotypes de croissance axonale lorsque différentes modifications génétiques sont élevés sur le TrkA ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} ou TrkA ^{taulacZ / WT:} Bax ^{- / -} milieux.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures sont conformes à la NIH Guide pour l'entretien et utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole d'animal a été approuvé par le IACUC au Weill Cornell Medical College.

1. Préparation des tissus

1. Euthanasier femelles chronométré-grossesse par dislocation cervicale ^15. Disséquer embryonnaires E16 - E18 embryons de femelles chronométré-grossesse et placer des embryons individuellement dans les puits d'une plaque à 6 puits, remplis de solution saline tamponnée phosphate froide (PBS).
2. Rincer embryons dans du PBS froid.
3. Retirer une petite partie de la membrane amniotique de l'embryon et le placer dans une solution pré-préparés protéinase K pour le génotypage ultérieure. Alternativement, si la membrane amniotique est perdu, enlever une petite partie de la pointe de la queue de l'embryon et le placer dans une solution de proteinase K
4. Percez des trous dans la peau tout autour de l'embryon en utilisant des épingles insectes (au moins 100 par côté).
5. Retirer du PBS et ajouter lentement frais 2% de paraformaldéhyde (PFA),pH 7,4, au puits.
6. Agitez doucement pendant 2 h à 4 ° C.
7. Rincer les embryons à deux reprises dans du PBS et les stocker dans du PBS à 4 ° C jusqu'à ce que la coloration.

2. génotypage

1. Plongez membranes amniotiques ou queues d'embryons dans la protéinase K mélange selon les instructions du fabricant.
2. Incuber à 56 ° C pendant 10 min.
3. Extraire l'ADN en utilisant un kit de purification d'ADN disponible dans le commerce.
4. Prendre 0,5 ul du total 200 ul purifiés solution d'ADN génomique, le combiner avec 0,5 pl de chacune des amorces sens et antisens spécifiques d'un gène (10 uM), 2 ul de mélange dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP) , 0,2 ul de polymerase de Taq (5 U / ul) et du tampon de PCR 2 pi (10x), ajoutez H ₂ O à un volume total de 20 ul.
   NOTE: Les séquences des amorces sont les suivantes (tableau 1):
   TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Frag PCRlongueur ment: 400 paires de bases (pb).
   Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NéoR: GCC CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragments longueurs: type sauvage, 304 pb; Bax null, 507 pb.
   TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR de longueur des fragments: 360 pb.
5. Exécuter une PCR avec le programme suivant pour TrkA: étape 1: 1 min à 95 ° C, étape 2: 10 sec à 95 ° C, étape 3: 20 sec à 68 ° C, étape 4: 30 sec à 72 ° C. Répétez les étapes 2 à 4 pour 40 cycles.
   1. Pour LacZ et Bax, exécutez une PCR avec le programme suivant: étape 1: 1 min à 95 ° C, étape 2: 10 sec à 95 ° C, l'étape 3: 1 min à 54 ° C, étape 4: 1 min à 72 ° C, répétez les étapes 2 à 4 pour 35 cycles.
6. Exécuter les échantillons de PCR sur un gel d'agarose à 2% à 100 V dans un tampon Tris-acétate 1x-EDTA pendant 20 min avec une voie de échelle d'ADN pour évaluer la longueur des fragments.
7. Analyser embryons pour la présence de type sauvage TrkA, TRKA-tauLacZ et Bax allèles nuls. Les génotypes des embryons expérimentaux sont TrkA ^{taulacZ / WT:} Bax ^{- / -} TrkA et ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -,} en fonction des questions expérimentales. Les embryons qui ne ont pas le journaliste tauLacZ seront négatifs pour axonale coloration et peuvent donc servir de témoins négatifs pour calibrer le processus de coloration.

3. embryon coloration

1. Utilisez un kit commercial pour lacZ coloration avec quelques modifications telles que décrites ci-dessous dans les sections 3.2 à 3.8. Ici, utiliser le kit Millipore.
2. Plongez embryons dans le tampon A pendant au moins 1 h, secouant doucement à la température ambiante.
3. Immerger directement embryons dans le tampon B pendant au moins 15 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
4. Lorsque des embryons sont dans le tampon A / B, solution de pré-base chaude de tissus à 37 ° C. Utilisation 5 ml de solution de base de tissu par embryon.
5. Lorsque des embryons sont dans le tampon A / B, préparer une nouvelle 5-bromo- 4- chloro- 3- indolyle α-D-galactopyranoside (X-gal) à une concentration de 40 mg / ml dans 100% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
6. Diluer X-gal dans la solution préchauffée base de tissu à une concentration de 1 mg / ml et ajouter 5 ml de X-gal / le mélange de base de tissu à un flacon à scintillation en verre.
7. Transfert d'embryons dans un flacon à scintillation en verre contenant le mélange de base X-gal / tissus. Sceller le couvercle avec du Parafilm et incuber à 37 ° C pendant la nuit, la vérification de présence de bleuissement.
8. Embryons de Postfix avec frais PFA 4%, pH 7,4. Agitez doucement pendant 4 heures à 4 ° C.
9. Rincer embryons deux fois dans PBS froid.

4. tissus déshydratation et de compensation

1. La place embryons dans 50% de méthanol / 50% d'un mélange PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans les flacons de verre.
2. Continuer à déshydrater dans 75% de méthanol / 25% de PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans des flacons en verre.
3. Continuer à se déshydrater dans 90% de méthanol / 10% PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans des flacons de verre.
4. Continuer à déshydrater dans 100% de methanol pendant 30 min (2x) à la température ambiante en agitant dans des flacons en verre.
5. Lorsque des embryons sont déshydratant, préparer un mélange 1: 1 (v: v) un mélange d'alcool de benzoyle et benzoyle benzoate.
   REMARQUE: l'alcool de benzoyle et benzoyle benzoate est toxique.
6. Immerger les embryons dans le complexe 1: 1 (v: v) mélange de methanol à 100%: 100% BABB pendant 15 min. Utilisez uniquement parce que le verre BABB va se dissoudre en plastique.
7. Plongez embryons dans 100% BABB effacer complètement le tissu et de visualiser coloration X-gal dans l'embryon effacé.
   REMARQUE: Image dès que possible parce que la tache X-gal va se estomper au fil du temps.

5. Mont entiers Imaging

1. Stabiliser l'embryon, immergé dans 100% BABB, aux angles appropriés pour la photographie utilisant des pinces métalliques. Illuminez utilisant une combinaison de sources jusqu'à la lumière et sous-lumière lumière.
2. Acquérir des images avec un microscope disséquantéquipé d'un appareil photo numérique. Prenez plusieurs expositions aux champs lumineux à cinq plans focaux successives 0,5 mm d'intervalle le long de l'axe Z. Les temps d'exposition et diaphragmes peuvent varier en fonction de l'éclairage et de la caméra spécifications et doivent être optimisés pour chaque configuration.
3. Utilisez un logiciel de traitement d'image pour traiter des images de superposition et de générer des photomontages.

Résultats

Les génotypes de TrkA ^{WT / taulacZ:} Bax ^{- / -} TrkA et ^{taulacZ / taulacZ:} Bax ^{- / -} embryons peuvent être déterminées sans ambiguïté par génotypage PCR standard (figure 1). Coloration X-Gal affiche des informations détaillées tonnelles axonales périphériques sous-cutanée chez les embryons classiquement colorées (figures 2, 3a), et dans tout l'embryon après compensation de tissu (figures 3b, 4).

Discussion

Le X-gal procédure de souris embryonnaires TrkA ^taulacZ coloration décrite ci-dessus permet la visualisation rapide et détaillée des projections axonales longue distance dans l'embryon fixe intacte. En raison de la Bax fond nul ces souris permettent de sonder des mécanismes qui peuvent contribuer à la croissance de l'axone et la survie neuronale de signalisation. Accouplement avec transgéniques ou knock-out souris d'intérêt permet une évaluation globale des phénotypes ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
Tissue Rinse Solution A	Millipore	BG-6-B
Tissue Rinse Solution B	Millipore	BG-7-B
Tissue Stain Base Solution	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
Glass scintiallation vial	Kimble Chase	74500-20
Incubator	Labline	Model 120
Insect pins	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
6-well dish	USA Scientific	CC7672-7506
Primers	IDT	custom DNA primers
Takara dNTP mixture	Takara	4030
Takara LA buffer	Takara	RR002A
Takara LA Taq	Takara	RR002A
PCR machine	Bio-Rad	DNA Engine Dyad
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	B-1042
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B-6630
Dissecting microscope	Leica	M205A
Camera	Leica	DFC310FX
Ring light	Leica	MEB110
Photoshop	Adobe	Photoshop 4.0