עכבר דגם ריאה של פיצוי ריאות צמיחה

Summary

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Abstract

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Introduction

תפקידו העיקרי של הריאות הוא לספק לחמצן ופחמן דו-חמצני חילופי בין האורגניזם והאווירה. בבני אדם, שורה של תנאים מולדים ונרכשים להוביל לשטח ריאות מופחת וכתוצאה מכך תפקוד ריאות לקוי. למרות שורה של טיפולים כגון סטרואידים בשאיפה, מרחיבי סימפונות, חמצן, אוויר ואוורור מכאני כרוני משמשות כדי למתן את ההשלכות של תפקוד ריאות לקוי ^1-3, הטיפול האידיאלי לתנאים אלה יקדם צמיחה מחודשת של רקמה תפקודית ריאות - כלומר, ריאות התחדשות.

התחדשות רקמות של יונקים תועדה היטב. קוצני העכבר האפריקאי יכול להתחדש שטחים גדולים של עור ללא היווצרות צלקת ^4. גדוד דיסטלי בבני אדם יכול להתחדש בעקבות פציעה או קטיעה ^5-7. הריאה הבאה (PNX), צמיחת ריאות מפצה מתרחשת בעכברים ^{8, 9} חולדות, לעשותGS ^10, ובני האדם ^11. על פי הגדרה, צמיחת ריאות פיצוי כרוכה הרחבה לא רק של airspaces הקיים, אך מחדש septation של airspaces המוגדל אלה עם הרחבת זרימת הדם קשור ^12. ניתוח ביטוי גנים הוכיח כי מודל זה משחזר רב של אירועי האיתות של התפתחות ריאות ^13. ארבעה שבועות לאחר העכבר PNX, שטח פן alveolar הוא שווה ערך לזה של בעלי חיים דמה מופעלים ^14. בכתב היד הזה, אנו מתארים את PNX העכבר ונהלי PNX דמה.

Protocol

הצהרת שימוש בבעלי חיים:: הערה כל הנהלים במחקר זה נערכו באישור וביצוע ההנחיות של בעלי החיים המוסדיים השימוש וטיפול הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים בסינסינטי. עכברי זכרים שמונה שבועות בן C57BL / 6J התקבלו מג'קסון מעבדות (Bar Harbor, ME) ואפשרו להסתגל לשבוע לפני שימוש אחד. עד ניתוח, בעלי חיים שוכנו במתקן מחסום הפתוגן ללא וסיפקו אוכל autoclaved וlibdium מודעת מים מסונן. כל כלוב עכבר סופק עם אוויר ומים ייעודיים, וחדרים נשמרו במחזור היום-לילה 12 שעות. בעקבות התאוששות מניתוח, עכברים נשמרו בכלובים עם צמרות מסוננות, ובלבד libidum מודעת אוכל autoclaved, ובלבד שמים מסוננים מבקבוק מים.

1. הכנה של מכשירים

1. הפוך 6 מפשקי עור באמצעות אטבי נייר וסיכות. טוויסט יישר מהדקי נייר באנקס של סיכות נייר, leave תיל פלדה ישר 5 סנטימטר בקצה אחד ולעשות 0.5 סנטימטר בודד וו "U" בצורה בסוף החוט.
2. הפוך וילונות כירורגי מרובעים כ -15 x 15 סנטימטר באמצעות ניילון נצמד. הכן רוטב אחד לכל עכבר. שים מגדל נייר בין כל לעטוף.
3. לעקר את כל הכלים כירורגיים יחד עם ערימה של אריחי 12 x 12 אינץ 'פקק, גזה, וספוגיות כותנה שקצה.

2. עכבר הכנה

1. לגרום להרדמה עם isoflurane 2%. לשקול בעלי חיים.
2. באזור הכנה כירורגית ייעודי לגלח בית חזה שמאלי ואזור צוואר עם מכונת גילוח חשמלי.
3. החל ירידה של המשחה הדמעה המלאכותית לעיניו של העכבר.
4. לטהר צוואר ובית חזה שמאלי עם chlorhexidine ואלכוהול איזופרופיל. חזור פעמיים יותר.

אינטובציה 3. העכבר Oro-קנה הנשימה ואוורור מכאני

1. יש מקום טכנאי כירורגית שאינו סטרילי פרקדן העכבר באזור הניתוח המחומם מראש.
2. לאשר עומק ההרדמה על ידי תיעוד חוסר תגובה לקמצוץ כפה.
3. לאחר שטיפת ידיים ועוטים לבוש כירורגית, מסיכה, וכובע, דון כפפות מנתחים סטרילית.
4. לאחר כורך ובאמצעות טכניקה האספטי, לעשות חתך אנכי 1 סנטימטר מעל אמצע הצוואר-הקדמי כדי לחשוף את הגרון. קל לחזור שרירי הרצועה עם משוננים מלקחיים מעוקלים סנטימטר, 10 ולחשוף את הגרון וקנה נשימה על ידי הפצת שרירי הרצועה עם הקצה של מספריים ישר.
5. דרך הפה להכניס angiocatheter בוטה, קצה 22 G לאמצע קנה הנשימה (איור 1 א) וחזותי לאשר מיקום (איור 1). לשמור על ההרדמה ולאוורר באמצעות isoflurane 1-3% באמצעות מכונת הנשמה מכרסם (225 μl לשבץ; 200 סטוקס לדקה). להעסיק מגבלת לחץ של 15 סנטימטרים H ₂ O.

4. עכבר ריאה

1. הנח את העכבר בעמדת פַּחֶסֶת רוחב תקין עם מול האחורי של העכברהמפעיל (בצד שמאל למעלה). השתמש בניילון נצמד איטום עצמי כוילון סטרילי. חיתוך דרך הווילון, להשתמש במספריים מעוגלים היטה בוטים לעשות מקביל ארוך קיצוץ של 2 סנטימטר לצלעות בחלל צלע 4 ^{th וה} -5. הכנס את המספריים קצה מעוקל בוטים ולנתח את העור מצלעות הבסיס ושרירים הבין-.
2. לחזור בו העור עם ארבעה מפשקים לחשוף מרובע 1.5 x 1.5 סנטימטר חלון כירורגית (איור 2 א). אבטח את המפשקים ללוח השעם.
3. לנתח את הצלעות באמצעות מלקחיים מעוקלים, ולהשתמש בקצה אחד של המלקחיים המעוקלים להיכנס לחלל בית החזה.
4. שימוש במייקרו-המספריים קצה הקהה, השתמש בלהב התחתון להיכנס לחלל בית החזה. ביצוע חתך 0.5 סנטימטר בין הצלעות וחזור על הפעולה בכיוון ההפוך.
5. באמצעות שני הכולים הכתיבה שנותרו, לפתוח את בית החזה בציר הקדמי-אחורית והמפשקים מאובטחים ללוח השעם (איור 2).
6. שימוש שבקצו מלקחיים בוטים מעוקלים ביד השמאל, לתפוס את הריאה השמאלית ולעקור את החלק העליון של הריאה השמאלית רוחבי וinferiorly באמצעות פתיחת בית החזה עד עורק הריאה השמאלי והסמפונות נחשפים (איור 3 א ', ב').
7. מחזיק המוליך microclip כלי הדם טיטניום הטעון ביד ימין עם הגוף של המוליך בכף וקצה מעוגל פונה אל כף היד (איור 3 ג), חלק את קצה המוליך לבית החזה לאורך העקמומיות של חלק האחורי של השמאל ריאות וקליפ הסמפונות עזבה ועורק ריאה (איור 3D).
8. הסר את המוליך אבל לשמור הריאה השמאלית חזר בו. אחוז במייקרו המספריים קצה הקהה ​​עם יד ימין וחתכתי את הסמפונות ודיסטלי עורק הריאה לקליפ ולהסיר ריאה שמאלית (איור 3E).
9. הסר את מפשקי צלעות.
10. השתמש במלקחיים בוטים המעוקלים לצבוט את 1 סנטימטר של עור נחות incisiבאבל מעל לרמה של הסרעפת והכנס angiocatheter G 24 דרך העור ולתוך חלל בית החזה השמאלי (איור 4 א ', ב').
11. השתמש 5-0 prolene תפר למקום שני תפרים שהופסקו סביב ^ה 4 ו -5 צלעות ^ה לסגור את חלל בית החזה.
12. הסר את מפשקי העור. השתמש בשני סטים של מלקחיים כדי להתקרב לעור לאורך החתך ומדביק את העור סגור.
13. חבר מזרק luer נעילת 3 מיליליטר לangiocatheter ולהסיר אוויר שייר על ידי יישום שאיבה עדינה ונסיגת angiocatheter.
14. מדביק את החתך בצוואר נסגר באמצעות שני סטים של מלקחיים כמו קודם.

5. עכבר שאם ריאה

1. לחשוף את הריאה השמאלית כפי שצוין בפרוטוקול "עכבר ריאה". הרם את כלוב צלעות עם מלקחיים בוטים מעוקלים כדי לאפשר לאוויר לתוך חלל החזה השמאלי (איור 5 א ', ב').
2. הנח angiocatheter G 24 לאף השמאלחלל racic כאמור לעיל נזהר שלא לפגוע הריאה השמאלית.
3. באמצעות 5-0 תפר prolene ונזהר שלא לנקב את הריאות (איור 5 ג), למקם את שני אורכים של חומר תפר לתוך 3 ^rd / 4 ^{th וה} -5 / 6 interspaces צלע ^ה (איור 5D). הנח את שני האורכים של חומר תפר לפני הקשירה כדי להפחית את הסיכונים של פריצת ריאה השמאלית. לקשור את חומר התפר לעשות שני תפרים שהופסקו (איור 5E).
4. מדביק את העור על החתך בבית החזה, להסיר אוויר שייר עם angiocatheter, ולהדביק את החתך בצוואר כאמור לעיל.

6. החייאה, שיכוך כאבים, ושחזור

1. כבה את isoflurane, ולנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של עצירות ו0.5 מיליליטר של תת-עורית מלח הרגילה.
2. כאשר נשימה ספונטנית לחדש, להסיר את הטובוס.
3. שים לב עכבר עד שהוא שוב אמבולטורי. הליכה בדרך כלל resumes כמה דקות לאחר הסרת הטובוס.
4. מניחים את העכבר ב-27 מעלות צלזיוס חממה (חמצן humidified, 25%) כדי לשחזר O / N.
   הערה: אנו שמים כמה כדורים של האוכל רטוב עם מים על רצפת הכלוב ל24 שעות הראשונות שלאחר ניתוח.
5. לנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של עצירות בזריקת intraperitoneal פעמיים ביום למשך שלושה ימים לאחר ניתוח. הקפד לא לפתוח את האתר כירורגית בעת טיפול בבעלי חיים.

7. ניטור עכבר

1. לשקול עכברים בבית 1, 3, 5, ו -7 ימים לאחר ניתוח.

תוצאות

. חלקה של PNX ומשקולות עכבר מזויף פעל מסופקת באיור 6 בידיים שלנו, הישרדות היא באופן עקבי 95-100% עבור שתי pneumonectomy PNX והעמדת פן. לתיאורים של איך הריאה הימנית מחדש גדל במודל זה וכמובן הזמן הצפוי, אנחנו מפנים את הקורא לכתבי יד של גיבן et al. ¹⁵ וet al וואנג. ^1...

Discussion

סיפקנו תיאור מפורט ביותר של נהלי PNX PNX העכבר ועכבר דמה שדווחו עד כה. אנחנו עשינו את הקורא מודע לכמה מהמכשולים הנפוצים שחוקרים לומדים ההליך נפוץ להיתקל, ויש לנו התווינו כמה טכניקות שפותחו על ידי המעבדה שלנו כדי להקטין נגד המלכודות הללו. מעבדות אחרות ניצול מודל זה עשויו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 inch Vascular clip applicator	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon small titanium red clip	Teleflex Medical (WECK)	1201
Narrow pattern 12 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Curved serrated 10 cm Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Castroviejo needle holder	Fine Science Tools	12565-14
Straight 9 cm Strabismus scissors (blunt tip)	Fine Science Tools	14075-09
Straight 8.5 cm hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Straight, blunt tip Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-12
Skin glue	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Luer lock syringe
4 Short retractors
2 Long retractors
5-0 Prolene on curved cutting needle	Ethicon	8698G
0.5 ml Syringe on 27 G needle
Normal saline
Buprenorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 inch Cork board stack	Office Depot
70% Ethanol
Betadine
Mouse ventilator	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Isoflurane vaporizer	OHMEDA	Excel 210 SE
Artificial tear ointment	Puralube	NDC: 17033-211-38