Maus Pneumonektomie Modell der Ausgleichs Lung Wachstum

Zusammenfassung

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Zusammenfassung

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Einleitung

Die Hauptfunktion der Lunge ist für Sauerstoff und Kohlendioxid Austausch zwischen einem Organismus und der Atmosphäre bereitzustellen. Beim Menschen eine Vielzahl von angeborenen und erworbenen Bedingungen führen zu verminderter Lungenfläche, die zu einer Beeinträchtigung der Lungenfunktion führt. Dh Lungen - Obwohl eine Vielzahl von Therapien wie inhalativen Kortikosteroiden, Bronchodilatatoren, zusätzlichen Sauerstoff und chronische mechanische Belüftung verwendet werden, um die Folgen der Beeinträchtigung der Lungenfunktion ^1-3 abzuschwächen, wäre die ideale Therapie für diesen Bedingungen Nachwachsen der funktionellen Lungengewebe zu fördern Regeneration.

Säugetiergeweberegeneration ist gut dokumentiert worden. Die Afrikanische Stachelmaus können große Bereiche der Haut ohne Narbenbildung ⁴ zu regenerieren. Die Phalanx beim Menschen nach einer Verletzung oder Amputation ^5-7 regenerieren. Nach Pneumonektomie (PNX) tritt Ausgleichslungenwachstum bei Mäusen, ^{8, 9} Ratten, zu tungs ¹⁰ und ¹¹ Menschen. Per Definition beinhaltet Ausgleichslungenwachstum nicht nur Ausbau der bestehenden Lufträume, aber erneut Septierung dieser vergrößerten Lufträume mit der Expansion des zugehörigen Mikrozirkulation ^12. Genexpressionsanalyse hat gezeigt, dass dieses Modell rekapituliert viele der Signalwege der Lungenentwicklung ^13. Vier Wochen nach der Maus PNX ist Alveolaroberfläche äquivalent zu der scheinoperierten Tieren ^14. In diesem Manuskript beschreiben wir die Maus PNX und Schein PNX Verfahren.

Protokoll

HINWEIS: Tier Verwendung Aussage: Alle Verfahren in dieser Studie wurden mit Genehmigung und nach den Richtlinien der Institutional Animal Benutzung und Pflege Committee (IACUC) in Cincinnati Kinderklinik durchgeführt. Acht Wochen alte C57BL / 6J männliche Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erhalten und man ließ sie für eine Woche vor dem Gebrauch akklimatisieren. Bis der Operation wurden die Tiere in einem pathogenfreien Barriere Anlage untergebracht und zur Verfügung gestellt autoklaviert Chow und gefiltertes Wasser ad libdium. Jede Maus Käfig wurde mit einer dedizierten Luft und Wasser versorgt, und die Zimmer wurden auf einem 12 Stunden Tag-Nacht-Zyklus gehalten. Nach Erholung von der Operation wurden die Mäuse in Käfigen mit gefiltertem Spitzen aufrechterhalten, sofern autoklaviert Futter ad libidum und sofern aus einer Wasserflasche gefiltertes Wasser.

1. Herstellung des Instruments

1. Stellen Sie 6 Haut Wundhaken mit Büroklammern und Pins. Twist bogene Büroklammern auf den Schäften der Papier-Pins, lTraufe eine 5 cm gerader Stahldraht an einem Ende und machen eine einzige 0,5 cm "U" förmigen Haken am Ende des Drahtes.
2. Stellen ca. 15 x 15 cm im Quadrat-OP-Abdeckungen mit Plastikfolie. Bereiten Sie eine Umkleide pro Maus. Setzen Sie ein Papierturm zwischen den einzelnen Wickel.
3. Sterilisieren Sie alle chirurgische Instrumente zusammen mit einem Stapel von 12 x 12 Zoll Korkplatten, Gaze, und Wattestäbchen.

2. Maus Vorbereitung

1. Induzieren Anästhesie mit 2% Isofluran. Wiegen Tier.
2. In einem speziellen Operationsvorbereitungsbereich rasieren linken Brust und Nackenbereich mit elektrischen Rasierer.
3. Geben Sie einen Tropfen der künstliche Tränen Salbe die Augen die Maus.
4. Dekontaminieren Hals und linken Brust mit Chlorhexidin und Isopropylalkohol. Wiederholen Sie zweimal.

3. Maus-Oro-Intubation und Beatmung

1. Haben Sie ein nicht-sterilen OP-Techniker statt mit der Maus auf dem Rücken in der vorgewärmten OP-Bereich.
2. Narkosetiefe Bestätigen Dokumentation Fehlen einer Reaktion auf die Pfote Prise.
3. Nach dem Waschen der Hände und das Anziehen OP-Kleidung, Maske und Hut, don sterile Handschuhe.
4. Nach Drapierungen und unter aseptischen Bedingungen, machen Sie einen 1 cm vertikale Inzision über der vorderen Mitte Nacken, den Kehlkopf freizulegen. Leicht einfahren Halsmuskulatur mit gebogenen, gezackten 10 cm Pinzette und setzen den Kehlkopf und Luftröhre durch die Streuung der Halsmuskulatur mit der Spitze einer geraden Schere.
5. Oral legen Sie eine 22 G stumpfen Spitze Angiokatheter in die Mitte der Luftröhre (1A) und optisch Platzierung (1B) zu bestätigen. Pflegen Anästhesie und belüften mit 1-3% Isofluran durch Nagetierventilator (225 ul pro Hub; 200 Stokes pro min). Verwenden Sie ein Druckgrenze von 15 cm H ₂ O

4. Maus Pneumonektomie

1. Legen Sie die Maus in die richtige Seitenlage mit der Maus den Rücken vorder Betreiber (links oben). Verwenden Sie einen selbstdichtenden Plastikfolie als sterilen Tuch. Schneiden durch den Faltenwurf, verwenden stumpfer Spitze gebogene Schere, einen 2 cm langen Schnitt parallel zu den Rippen auf der ^4. und ^5. Zwischenrippenraum zu machen. Legen Sie die stumpfe Spitze gebogene Schere und sezieren die Haut von den zugrunde liegenden Rippen und Rippenmuskeln.
2. Ziehen Sie die Haut mit vier Wundhaken, um ein Quadrat aussetzen 1,5 x 1,5 cm Operationsfenster (Abbildung 2A). Sichern Sie die Wundhaken an den Kork Bord.
3. Präparieren Sie auf Rippen mit einer gebogenen Pinzette, und verwenden Sie eine Spitze der gebogenen Pinzette, um die Brusthöhle zu gelangen.
4. Mit Hilfe der stumpfen Spitze Mikroscheren, verwenden Sie die Untermesser, um die Brusthöhle zu gelangen. Machen Sie eine 0,5 cm Einschnitt zwischen den Rippen, und wiederholen Sie in die entgegengesetzte Richtung.
5. Mit den beiden verbleibenden Wundhaken, öffnen Sie den Brustkorb in der Vorwärts-Rückwärts-Achse und die sichere die Retraktoren mit dem Kork Bord (2B).
6. Mit gebogenen stumpfen Pinzette in der linken Hand das linke Lunge und verdrängen den oberen Teil der linken Lunge seitlich und unten durch die Thorakotomie, bis die linke Lungenarterie und Bronchien ausgesetzt sind (3A, B).
7. Halten Sie die geladenen Titan Gefäßmikroclip Applikator in die rechte Hand mit dem Körper des Applikators in der Handfläche und gebogene Spitze nach weg von der Handfläche (3C), schieben Sie die Applikatorspitze in den Brustkorb entlang der Krümmung der hinteren Seite des linken Lunge und Clip der linken Bronchus und Lungenschlagader (3D).
8. Entfernen Sie den Applikator aber halten Sie die linke Lunge eingefahren. Fassen Sie die stumpfe Spitze Mikro-Schere mit der rechten Hand und schneiden Sie die Bronchien und Lungenarterie distal der Clip und entfernen linken Lunge (3E).
9. Entfernen Sie die Rippenspreizer.
10. Mit den gebogenen stumpfen Pinzette zu kneifen bis 1 cm von der Haut schlechter als die incisiauf, sondern über dem Niveau der Membran und setzen Sie eine 24 G Angiokatheter durch die Haut und in die linke Brusthöhle (4A, B).
11. Verwenden Sie 5-0 Prolene Naht zu zwei Knopfnähten auf der ^4. und ^5. Rippen platzieren, um die Brusthöhle zu schließen.
12. Entfernen Sie die Haut Wundhaken. Verwenden Sie zwei Sätze von Pinzette, um die Haut entlang der Länge des Einschnitts nähern und kleben die Haut verschlossen.
13. Schließen Sie einen 3 ml Luer-Lock-Spritze mit dem Angiokatheter und entfernen Restluft durch leichten Ansaugen und Zurückziehen des Angiokatheter.
14. Kleben Sie den Halsschnitt geschlossen mit zwei Sätzen von Zangen wie zuvor.

5. Maus Sham Pneumonektomie

1. Setzen Sie die linke Lunge wie in "Maus Pneumonektomie" Protokoll vermerkt. Heben Sie den Brustkorb mit gebogenen stumpfen Pinzette, um Luft in die linke Brusthöhle zu ermöglichen (5A, B).
2. Legen Sie eine 24 G Angiokatheter in die linke thoRacic Hohlraum wie oben darauf achten, daß die linke Lunge schädigen.
3. Mit 5-0 Prolene Nahtmaterial und darauf achten, daß die Lunge (5C) durchstoßen, indem Sie zwei Längen von Nahtmaterial in der ^3. / 4 und ^5. / ^6. Rippenzwischenräumen (5D). Gebe beide Längen von Nahtmaterial vor den Bund, um die Risiken der linken Lunge Herniation zu verringern. Binden Sie die Nahtmaterial zu zwei unterbrochenen Stichen (5E) zu machen.
4. Kleben Sie die Haut über der Brust-Schnitt, entfernen Sie Restluft mit dem Angiokatheter und kleben Sie den Halsschnitt wie oben.

6. Wiederbelebung, Analgesie und Wiederherstellung

1. Schalten Sie die Isofluran und Verwalten 0,1 mg / kg von Buprenorphin und 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan.
2. Wenn spontane Atmung wieder aufzunehmen, entfernen Sie den Endotrachealtubus.
3. Beachten Maus, bis es wieder ambulante ist. Wandern in der Regel Resum¯es mehrere Minuten nach der Entfernung des Endotrachealtubus.
4. Platzieren Sie die Maus in einem 27 ° C Inkubator (befeuchteten, Sauerstoff 25%) zu erholen O / N.
   HINWEIS: Legen Sie mehrere Pellets von Chow mit Wasser für die ersten 24 Stunden nach der Operation benetzt auf dem Käfigboden.
5. Verabreichen 0,1 mg / kg Buprenorphin durch intraperitoneale Injektion zweimal täglich für drei Tage nach der Operation. Darauf achten, dass die Operationsstelle beim Umgang mit Tieren zu öffnen.

7. Maus-Überwachung

1. Wiegen Mäusen nach 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Operation.

Ergebnisse

. Ein Grundstück von PNX und scheinoperierten Maus Gewichte ist in Abbildung 6 vorgesehen In unseren Händen, ist das Überleben konsequent 95-100% für beide PNX und Schein Pneumonektomie. Eine Beschreibung, wie die rechte Lunge wieder wächst in diesem Modell und dem erwarteten zeitlichen Verlauf, verweisen wir den Leser auf Manuskripte Gibney et al. ¹⁵ und Wang et al. ¹⁴

Einige häufige Fehler zu vermeiden, um die Maus PNX und Maus...

Diskussion

Wir haben die detaillierte Beschreibung der Maus PNX und Maus Schein PNX Verfahren bis heute berichtet vorgesehen. Wir haben die Leser bewusst einige der häufigsten Fallstricke, dass die Ermittler das Erlernen der häufigsten Verfahren stoßen gemacht, und wir haben verschiedene Techniken, die von unserem Labor entwickelt, um gegen diese Gefahren zu mildern skizziert. Andere Labors nutzen dieses Modell können andere Technik Modifikationen entwickelt haben, oder verwenden Sie verschiedene Instrumente. Bei der Bewertung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 inch Vascular clip applicator	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon small titanium red clip	Teleflex Medical (WECK)	1201
Narrow pattern 12 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Curved serrated 10 cm Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Castroviejo needle holder	Fine Science Tools	12565-14
Straight 9 cm Strabismus scissors (blunt tip)	Fine Science Tools	14075-09
Straight 8.5 cm hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Straight, blunt tip Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-12
Skin glue	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Luer lock syringe
4 Short retractors
2 Long retractors
5-0 Prolene on curved cutting needle	Ethicon	8698G
0.5 ml Syringe on 27 G needle
Normal saline
Buprenorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 inch Cork board stack	Office Depot
70% Ethanol
Betadine
Mouse ventilator	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Isoflurane vaporizer	OHMEDA	Excel 210 SE
Artificial tear ointment	Puralube	NDC: 17033-211-38