פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) Spectroscopic הדמיה של סעיפים רקמה אנושיים לשיפור פתולוגיה

Summary

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Abstract

פורייה בהבחנה גבוהה להפוך אינפרא אדום (FT-IR) הדמיה ספקטרוסקופיות היא גישה המתעוררות כדי להשיג תמונות מפורטות שקשרו מידע ביוכימי. ההדמיה FT-IR של רקמה מבוססת על העיקרון כי אזורים שונים של אמצע אינפרא אדום נספגים על ידי קשרים כימיים שונים (לדוגמא, C = O, CH, NH) בתוך תאים או רקמות, כי אז יכול להיות קשורה לנוכחות והרכב של מולקולות ביולוגיות (למשל, שומנים, DNA, גליקוגן, חלבון, קולגן). בתמונת FT-IR, כל פיקסל בתמונה מורכב מספקטרום אינפרא אדום (IR) שלם שיכול לתת מידע על המצב ביוכימי של התאים כי אז יכול להיות מנוצלים לתא מסוג או סיווג מחלה מהסוג. במאמר זה, אנו מציגים: איך להשיג תמונות IR מרקמות אנושיות באמצעות מערכת FT-IR, כיצד לשנות מכשור הקיים, כדי לאפשר יכולות הדמיה בחדות גבוהה, ואיך לדמיין תמונות FT-IR. לאחר מכן, אנו מציגים כמה יישומים של FT-IRלפתולוגיה באמצעות הכבד וכליות כדוגמאות. ההדמיה FT-IR מחזיקה יישומים מרגשים במתן מסלול רומן כדי להשיג מידע ביוכימיים בתאים ורקמות במסלול הלא-perturbing לחלוטין ללא תווית כלפי נותן תובנה חדשה שינויי biomolecular כחלק מתהליכי המחלה. בנוסף, מידע ביוכימי זה עלול לאפשר לניתוח אובייקטיבי ואוטומטי של היבטים מסוימים של אבחון מחלה.

Introduction

ספקטרוסקופיה IR כבר כלי אנליטי זמין בצורה כלשהי מאז 1930; עם זאת, הוא היה רק ​​בתוך העשור האחרון כי השטח של הדמיה רקמות עם FT-IR התפוצץ. ההתקדמות בFT-IR עבור הדמיה רקמות היו מונעת בחלקו גדול על ידי שלוש התפתחויות מרכזיות: 1) מהירות מוגברת של רכישת נתונים בשל הזמינות של מערך מישור מיקוד גדול (FPA) גלאים אשר בדרך כלל יש אלפי גלאים רגישים IR ^{1 , 2} פיתוח, 2) של אלגוריתמים לעיבוד מתקדמים וכוח חישוב לטיפול בנתונים היפרספקטרלית גדולים קובע ^3, ו 3) מודלים של מערכות ההדמיה FT-IR על מנת למקסם את הרזולוציה מרחבית ^4,5. יש כבר רב באיכות גבוהה ומאמרים נרחבים מאוד סוקרים תחום ספקטרוסקופיה FT-IR לאחרונה ^6-16, בנוסף לנייר טבע פרוטוקולים המפרט את האמצעים לקבלת ספקטרום נקודה או מפות מרקמות ^17. במאמר זה, אנו נתמקד בprotocol כדי להשיג תמונות של רקמות באמצעות 128 x 128 גלאים FPA במערכת FT-IR שונה עם יכולות גבוהה הגדרה.

ההדמיה FT-IR הוצע ארוכה כדי להיות כלי פוטנציאלי רצוי לתא ורקמת הדמיה בשל היכולת להשיג תמונות שבו כל פיקסל יש שפע של מידע ביוכימי. ההדמיה FT-IR מבוססת על העיקרון שמולקולות ביולוגיים שונות במדגם כמותית לספוג אזורים שונים של אמצע אינפרא אדום-; זה מאפשר לגזירה של 'טביעת אצבע ביוכימי ". טביעת אצבע זה הוכחה במחקרים רבים לשנות בין סוגי תאים שונים ומצבי מחלה. שלא כמו בתרגול פתולוגיה הקונבנציונלי שבו כתמים וסמני immunohistochemical צריכים לשמש כדי לחזות ולזהות סוגי תאים ורקמות מבנים המשמשים כדי להנחות את אפשרויות אבחון וטיפול, התמונות מFT-IR נוצרות מבוססות על ביוכימיה הטבעית של הרקמה. Techniq הנוכחיue של רקמת צביעה לאבחון הוא זמן רב, הרסני, מייגע, ודורש מומחיות הסובייקטיבית של פתולוג, ואילו FT-IR מציע את הפוטנציאל להפוך את התהליך הזה מהיר, שאינו הרסני, מאוד אוטומטי, ואובייקטיבי יותר. בנוסף, FT-IR מציע מסלול חדשני לקבלת מידע ביוכימיים נוסף שעשויות לא להיות נגיש בקלות באמצעות טכניקות צביעה קונבנציונליות.

אחד השיפורים המרגשים ביותר בשנים האחרונות היה הזמינות של גישות הדמיה ברזולוציה גבוהות שיכול כעת להרשות להדמיה והאפיון של סוגי תאים ורקמות מבנים שהם קריטיים לאבחון מחלה מקיף. אחת מן הטכניקות הללו הוא מוחלשות סה"כ ההחזרה (ATR) FT-IR אשר משלב עדשה מוצקה טבילה (SIL) של מקדם שבירה גבוהה המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה ^18, עם מחקרים רבים מראים מאוד מרגשים היישומים שלה ^19-25. בנוסף, זה wכפי שהודגם לאחרונה כי הרזולוציה מרחבית המוגברת הדמיה ATR יכולה לאפשר להדמיה והסיווג של אנדותל ותאי myoepithelial ברקמת שד אשר מהווים מרכיב מרכזי באבחון סרטן השד ^26. בעוד ההדמיה ATR היא מאוד שימושית, טכניקה זו דורשת SIL ליצור קשר עם הרקמה ליצירת תמונות FT-IR; לכן, השימוש בו מוגבל במידה מסוימת לפתולוגיה הרקמה שבו אזורים גדולים של רקמות חייבים להיות צילמו במהירות.

גישה שנייה הודגמה על ידי צימוד אובייקטיבי ההגדלה גבוהה למערכת FT-IR קיים המשתמשת בסינכרוטרון כמקור בהיר של IR, אפשר להאיר באופן מלא FPA ותמונה עם גודל פיקסל אפקטיבי של 0.54 x 0.54 מיקרומטר. זה אפשר לנו לחזות מבנים מרכזיים ברקמות שד וערמונית שאינם פתירה באמצעות מערכות FT-IR קונבנציונליים ^4. בעוד עליות הדרמטיות אלה בresolutio המרחבית תמונת IRn היה מרגשים, השימוש בו נותר מוגבל בשל צורך בסינכרוטרון. בהמשך לכך, מערכת אופטימלית תוכננה שיכול גם לאפשר ליכולות גבוהה הגדרת הדמיה עם גודל פיקסל של 1.1 x 1.1 מיקרומטר ללא הדרישה של מקור סינכרוטרון אלא באמצעות מקור IR globar מסורתי ^5. במאמר זה, אנו מראים כיצד לשנות מערכת הקיימת מסחרית FT-IR הדמיה כדי לאפשר הדמיה IR המוגבל עקיפה של רקמות עם אות מקובלת על יחס רעש באמצעות יעדים מרובים IR (15X, 36x, ו74X). גודל פיקסל האפקטיבי עם שלוש המטרות הוא 5.5 x 5.5 מיקרומטר (15X), 2.2 x 2.2 מיקרומטר (36x) ו -1.1 x 1.1 מיקרומטר (74X). לאחר מכן, אנו נותנים כמה דוגמאות לחשיבות של הרווחים ברזולוציה מרחבית לגילוי מחלה בביופסיות של כבד וכליות ^27.

Protocol

1. הגדרת FT-IR מיקרוסקופים ורכישת תמונות רקמות

1. סעיף בלוק קבוע פורמלין המוטבע פרפין רקמה ב 4 מיקרומטר עובי לשקופית תואמת IR באמצעות microtome. לחלופין, סעיף רקמת נוזל חנקן קפוא ב 4 מיקרומטר עובי על שקופית תואמת IR באמצעות cryostat.
   הערה: בדרך כלל, סעיף סדרתי יהיה גם רכש בשקופית זכוכית ומוכתמת במיוחד (כגון Haematoxylin וEosin (H & E)) או כתם immunohistochemical. בנוסף, ניתן לגדל שורות תאים בתרבית בשקופיות תואמות IR. שקופיות תואמות IR יכולות להיות שקופיות רעיוני IR עבור הדמיה השתקפות מצב (לדוגמא, שקופיות MirrIR, זהב) או שקופיות שקופות IR עבור הדמיה מצב שידור (למשל, BAF _2, CAF _2).
2. טהר את המיקרוסקופ FT-IR וספקטרומטר או באמצעות אוויר יבש או גז חנקן יבש כדי להסיר מים באטמוספרה מהמערכת. חכה לפחות 45 דקות לפני ההדמיה כדי להבטיח purg יסודידואר.
3. שני הגלאים מגניבים FPA (79 K) וגלאי MCT הפנימי במיקרוסקופ FT-IR באמצעות חנקן נוזלי. לקרר את הגלאים בערך כל שעה 6.
   זהירות! חנקן נוזלי הוא נוזל קירור ועלול לגרום לכוויות קור, כוויות קור ובמחנק חללים סגורים.
4. הר שקופיות מדגם על הבמה מיקרוסקופ הדמיה FT-IR.
5. ודא האור הנראה הוא "ON" ולאחר מכן גם באמצעות המשקפת או תכנית לכידת מדגם (המספק בזמן אמת תמונה נראית לעין של הרקמה), תתמקד במדגם.
6. פתח את חבילת תוכנת חבילה כגון החלטות פרו ולחץ על 'אסוף', לאחר מכן 'אבחון' ולאחר מכן בחר 'יישור ספקטרומטר "לחץ. ודא שנתיב הקרן לגלאים הפנימיים ספקטרומטר אינו חסום.
7. לחץ על "התקנת הדמיה '.
8. בכרטיסייה "האלקטרוניקה", בחר 'המהירות' המתאימה ', תחת Saיחס mpling (UDR) 'ו' הגדרות 'מסננים בהתאם למערכת.
   הערה: בדוגמא זו, ההגדרה היא המהירות = 2.5 KHz, UDR = 4 ומסננים = אין.
9. בכרטיסייה "אופטיקה" להבטיח כי "מקור Mid-IR ',' צמצם פתוח 'ו' מחליש קרן 100% 'נבחרו.
10. כדי לכייל את המערכת, בכרטיסייה 'אופטיקה', 'הגלאי' בחר בשם "קרקע", "מיקרוסקופ גלאי 'כ'שמאל', ולאחר מכן בחרו באפשרות" העברה "או" החזרה 'תחת' מצב אופטיקה 'בהתאם לסוג של להחליק בשימוש.
11. לחץ על הגדרה, שיפתח את החלון "לנסר הבקרה '.
    הערה: למצב השתקפות לעקוב אחר הוראות ב1.12 1.13 ולמצב שידור לעקוב אחר הוראות ב1.14-1.16. המשך מ1.17 עבור שתי השתקפות והולכה.
12. למצב השתקפות, וב# 8216; "לחץ על 'לנסר בקרת גלם". באמצעות ג'ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לאזור נקי בשקופית.
13. התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. בשלב הבא, להזיז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה, ולשכלל את המיקוד של התמונה. "החום" השינוי והאפשרויות 'ניגודיות' כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את ההתמקדות, זה לא יהיו כל השפעה על נתוני IR. המשך מ1.18.
14. למצב שידור, בלחיצה "לנסר הבקרה 'על' גלם '. באמצעות ג'ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לאזור נקי של השקופית.
15. התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה.
16. התאם את תחתית התמקדות / אובייקטיבי הקבל להגדיל את מספר הספירות לmaximuמ '. צפה בצורה של התמונה הימנית התחתונה בלנסר בקרה כדי להבטיח שזה גאוס במראה ואחיד יחסית. התאם את זמן האינטגרציה שוב לכ -8,000 ספירה.
    הערה: אם כל הפיקסלים בתמונה interferogram FT-IR להלבין, להפחית את זמן האינטגרציה.
17. הזז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה ולשכלל את המיקוד של התמונה. לחלופין, לשנות את אפשרויות חום ולעומת זאת כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את המיקוד, אבל לא תהיה כל השפעה על נתוני IR.
18. באמצעות ג'ויסטיק שליטת שלב, לעבור לאזור נקי של השקופית. לחץ על הכפתור 'כייל ". ודא 'מחוץ לתחום (Oor)' הערך הוא פחות מ 50 ואת ההבדל בין 'הגבוה השטף' והספירות 'נמוך Flux "הוא לפחות 4,000 ספירה.
19. לחץ על 'אישור' פעמיים. בכרטיסיות אופטיקה לבחור; "MCT '=' הגלאי ',' Microsלהתמודד ימני '=' הגלאי 'ולאחר מכן לחץ על' הגדרות '. בשלב זה לא יהיה interferogram FT-IR על המסך. לחץ על "מצא את Centerburst '. לחץ על 'אוקיי'.
20. בכרטיסייה 'אופטיקה', בחר שוב 'קרקע' = 'הגלאי', 'מיקרוסקופים גלאי' = 'שמאל' ובחר 'הגדרות'.
21. בלנסר בקרה - להבטיח התמונה עדיין על אזור נקי ו'כיול 'לחץ שוב. לחץ על 'אוקיי'.
22. בשלב הבא, לאסוף תמונת FT-IR רקע לתיקון לספיגה מהאווירה, המערכת והשקופיות. עבור לכרטיסייה 'האלקטרוניקה' ובחר ברזולוציה הספקטרלית מתאימה, בדרך כלל של 4 סנטימטר ^-1 או 8 סנטימטר ^-1 לרקמות.
23. עבור לכרטיסיית 'הרקע' והקלד 128 ב'סריקות לשתף להוסיף ". בחר 'הקובץ החדש ... "כפתור ולמקם את קובץ הרקע בקיפול מתאיםאה. בדוק כרטיסייה 'ההדמיה' כדי להבטיח mosaicing היא 1 על ידי 'רקע' 1. לחץ, לחכות לסריקה לסיים ולאשר היכן לשמור את הקובץ. לחץ על אזור תמונת FT-IR רקע ולבדוק את הספקטרום.
24. לקחת תמונת פסיפס גדולה של המדגם, בחר בכרטיסייה 'ההדמיה' ולהכניס את מספר מסגרות X ו- Y לגודל הפסיפס שברצונך לרכוש.
25. לחץ על 'הגדרות' ובלנסר בקרה להשתמש בתצוגה חי IR כדי למצוא את השטח של עניין. אם לוקח בפסיפס, במרכז בשידור החי באמצע השטח של עניין. לחץ על 'אוקיי'. עבור לכרטיסייה 'האלקטרוניקה' והקלד את מספר הסריקות לשתף להוסיף (בדרך כלל ערך בין 2 ל 16 סריקות לרקמות). לחץ על "סרוק".
26. בדוק את תמונת FT-IR שנאסף על המסך כדי להבטיח שזה נראה ממוקד. לחץ על התמונה כדי להעלות את ספקטרום IR ממיקום זה ולבדוק שזה נראה לי אות מקובלת על רעש. אקימחדש תמונה נראית לעין של המדגם.
27. שמור את התמונה ולייצא אותו לפורמט הנדרש, כגון ENVI-IDL.

2. התאמת מיקרוסקופ FT-IR ליכולות גבוהה הגדרה

הערה: רוב מערכות FT-IR מצוידות במטרה כ הגדלה 15X ו 0.5 צמצם מספרי (NA). לתמונה במצב בהבחנה גבוהה, IR אובייקטיבי 36x או 74X תואם ניתן להשתמש כדי לתת עקיפת יכולות הדמיה מוגבלות.

1. הסר אובייקטיבי 15X של המערכת על-ידי שחרור נגד כיוון השעון.
2. בורג באו אובייקטיבי 36x או 74X במקומו. יישר את המטרה לפני השימוש. השתמש בצינורות ארכה העדשה להביא את המטרה קרובה מספיק למדגם.
3. הנח רקמה תחת המטרה החדשה ולהתמקד באמצעות אור נראה או באמצעות המשקפת או תכנית לכידת לדוגמא.
   הערה: הדמיה גבוהה הגדרה חייב להיעשות במצב שידור. מרחק העבודה קרוב מאוד שליעדי se (1-2 מ"מ) ועומק רדוד מאוד של מוקד דורשים התמקדות לאט ובזהירות, לוקחים זמן להוריד את המטרה בלי לגעת במדגם.
4. עקוב אחר הוראות 1.6-1.11.
   הערה: בשל היותו באופן משמעותי קשה יותר להתמקד והרבה פחות אור מגיע לגלאי, הפרוטוקול הבא מותאם המבוסס על 1.14.
5. במצב שידור, לחץ על 'גלם'. באמצעות ג'ויסטיק שליטת במה וצופה בתצוגה החיה של תמונת FT-IR interferogram (תמונה עליונה מימין), לעבור לרקמות ולהתמקד (באופן אידיאלי על קצה).
   הערה: זה עלול להיות קשה, ולכן להתאים את "החום" ואפשרויות 'ניגודיות' כדי לעזור ליצור תמונה כדי לשפר את המיקוד (האפשרויות הללו לא ישפיעו על נתוני IR).
6. ברגע שהתמקד, באמצעות ג'ויסטיק שליטת השלב ומהלך תצוגת IR החי לאזור נקי של השקופית. התאם את זמן אינטגרציה לכ -8,000 ספירה. התאם את תחתית התמקדות אובייקטיבית ללהגדיל את מספר הספירות למקסימום שלה. התאם את זמן האינטגרציה שוב לכ -8,000 ספירה.
7. הזז את הבמה כדי למצוא פיסת הרקמה עם מבנה, רצוי קצה רקמה, ולשכלל את המיקוד של התמונה.
8. אם mosaicking תמונה ברזולוציה גבוהה, להתאים את הבמה כדי לאפשר תנועה נכונה הנדרשת על פני מרחקים לmosaicing מדויקת. כדי לשנות את הגדרות מרחק הבמה, ללכת "שלב התקנה 'בלנסר בקרה ולהתאים את הגדרות יישור אופקית ואנכיות כדי לאפשר mosaicking הנכון.
9. באמצעות מהלך ג'ויסטיק שליטת שלב לאזור נקי של השקופית. לחץ על הכפתור 'כייל ". ודאו מטווח ערך (Oor) ​​הוא פחות מ -50 בשני 36x ו74X יעדים. להבטיח את ההבדל בין השטף הגבוה והערכים נמוכים שטף הוא לפחות 1,000 ספירה למטרת 74X ו2,000 ספירה למטרת 36x.
10. המשך 1.19-1.27. מספר הסריקות ב1.23 ו1.25 יצטרכו להיות מותאמים בשל אות מופחתת בכ -256 סריקות לתמונת הרקע ו16-128 סריקות לתמונת הרקמה.

3. מערכי נתוני Spectral לדמיין סיווג IR

הערה: בסעיף זה, נדון כיצד לחזות ולחלץ נתונים מתמונות רפאים באמצעות עיבוד תמונת גיאו-מרחבים וניתוח תוכנה כגון ENVI + IDL, אולם התהליך דומה מאוד לכל תוכנה חלופית כגון MATLAB, תוכנה חופשית כגון CytoSpec , או תוכנה של מפתחי המכשיר. יש כמה טכניקות עיבוד רפאים שונות שניתן לבצע על נתוני IR.

1. עיבוד תמונת גיאו-מרחבים פתוח ותוכנה לניתוח ולטעון את קובץ נתוני IR.
2. החל אלגוריתם תיקון בסיס לנתונים IR על ידי בחירה "כלים Spectral" ולגלול למטה ולחץ על "ספקטרום ספיג". שים לב בתפריט מוקפץ ובחר "קור Baselinection "
   הערה: תיקון Baseline יסיר מדרון לקזז בסיס מנתונים בשל פיזור
3. לבצע נורמליזציה Spectral, על ידי ratioing נתונים לשיא מסוים רפאים (בדרך כלל אמיד אני (1,650 ^-1 סנטימטר) או אמיד השני (1,550 ^-1 סנטימטר)) או באזור תחת אזור מוגדר של הספקטרום. עושה זאת על ידי בחירה באפשרות "רגיל ספקטרום" תחת אפשרויות תפריט "הספיגה ספקטרה".
   הערה: הנורמליזציה Spectral מבוצעת כך שהבדלים בספקטרום הבדלים אמיתיים ביוכימי ולא בשל עובי או הבדלי צפיפות בין דגימות.
4. השתמש באלגוריתם הפחתת רעש להסיר רעש מהספקטרום אם ²⁸ דרושים.
   הערה: ישנן גישות זמינות מרובות שבו ניתן להשיג תיקון בסיס, נורמליזציה רפאים והפחתת רעש, עם רוב התוכנות שיש אלגוריתמים אוטומטיים שנבנו בכמו כן, יש מספר עולה של גישות שתתקנה ל.סטיות רפאים, אשר נדונו בפירוט ^29-42; עם זאת, הקהילה עדיין אינה מסכימה על איזה מאלה יש צורך.
5. שים לב רשימה של כל תדרי IR שנאספו בתוך התמונה (בדרך כלל של טווח ספקטרום 900 ל -4,000 ^-1 סנטימטר). לחץ על התדרים שמתאימים למולקולות ביולוגיות ספציפיות להתבונן תמונה של הרקמה בתדר שנבחר.
   1. לדוגמא, לחץ על להקת 1,650 ^-1 סנטימטר להתבונן ההפצה של חלבונים במדגם. לחלופין, לחץ על להקת 1,080 ^-1 סנטימטר להתבונן ההפצה של חומצות גרעין במדגם. השתמש wavenumber 1,650 ^-1 סנטימטר.
6. ליצור תמונות נוספות על ידי חישוב יחס רפאים שיא גובה, יחסי שיא שטח וכו 'שיאפשר להדמיה של רכיבי biomolecular שונים. לחץ על "כלים Spectral 'ולאחר מכן בחר' יחסי גובה שיא" או "חישוב שטח תמונה 'כדי ליצור תמונות.
7. סרוק את סעיף הרקמות הסמוך המקביל שמוכתם באמצעות מערכת תרמי שקופיות שלמה נפרדת שלוכדת תמונות brightfield. לצד תמונת IR, להציג את התמונה הדיגיטלית של הרקמה הצבעונית עם תכנית תמונה גלויה.
8. לחץ לחיצה ימנית על התמונה באזור של עניין ובחר פרופיל Z ". זה ייתן לי המידע ספקטרלי בפיקסל נבחר.
9. תסתכל על ספקטרום IR של פיקסלים מרובים מכיתות מרובות, כגון השוואה בין סוגי תאים, מצבי מחלה. פיקסלים מארק ספציפיים בתמונה באמצעות כלי 'האזורים של עניין "(ROI). כדי לבצע את זה, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר 'כלי ROI ". צור כיתות הלהיות מתויגות, למשל נורמלים, דיספלזיה, ושיעורי סרטן. לאחר מכן, בחר, "סוג ROI '-' נקודה '. לאחר מכן בחר את הכיתה כדי לבחור פיקסלים וללצייר על פיקסלים המתאימים בתמונת IR. לגזור את f הספקטרום הממוצעאו כל אחת מכיתות השימוש באפשרות 'ROI הממוצע ".
10. שקלו את הספקטרום נגזר על ידי התוויית בתוכנת גרפים.

תוצאות

ההדמיה FT-IR מאפשרת הגזירה של תמונות IR של רקמה שיכול לתת לי ניגודים שונים בהתאם לתדר IR של עניין. בנוסף, בתמונת IR, כל פיקסל מורכב מכל קשת IR, עם פסגות שונות המתאימות למולקולות ביולוגיות שונות שיכול לתת מידע על התכונות הביוכימיות של סוגי תאים או מצבי מחלה (איור 1). הנה, יש לנו לראות איך להשוות חתימות רפאים בין מעמדות, סיווג אוטומטי זאת יותר מתקדם אפשרי באמצעות אלגוריתמים נוספים ^3,43-50, כגון סיווג בייס, אקראי יערות, ברשתות עצביות מלאכותיות, והיררכי Cluster ניתוח יכול להתבצע על נתונים. גישות סיווג בפיקוח תאפשר לבניית מסווג שניתן לאמן כדי לאפשר להכרה אוטומטית של סוגי תאים או מצבי מחלה. גישות סיווג ללא השגחה יכולות לשמש כדי לחפש באופן טבעי DIFferences ברקמה או תאים עקב שונות ביוכימיים.

מכשור FT-IR התפתח במהלך העשורים האחרונים, מהמדידה בנקודה / מצב מיפוי בודד באמצעות פתחים אטומים IR למצב הדמיה באמצעות יעדי Cassegrain, או באמצעות אובייקטיבי מאיר יחד עם מטרת איסוף בשידור-מצב או מטרה אחת כי הן נדלקת ואוסף בהשתקפות של מצב (איור 2). לאחרונה הודגם כי מטרת האיסוף במצב שידור יכולה להיות כיבתה להגדלה גבוהה יותר ואובייקטיבי צמצם מספרי כדי לאפשר הדמיה עקיפה מוגבלת IR, שמובילה לעלייה ניכר ברזולוציה מרחבית של תמונות IR שנאספו ^4,5. ההתקדמות ברזולוציה מרחבית להדמית רקמות הייתה חשיבות קריטית כפי שאנו יכולים כעת לזהות סוגי תאים ומבני רקמות, למשל היחידות פונקציונליות של הכליות, glomeruli, באמצעות מותאמת בביתמערכות FT-IR (איור 3).

ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה מאפשרת לתמונות מפורטות של רקמות לבדיקה כדי לזהות אזורים חריגים ולזהות הבדלים ביוכימיים בין סוגי תאים שונים. בליבת רקמת כבד, אפשר לדמיין hepatocytes ואזורים של הסתננות סיסטיק שחלק שני תחומים נפרדים של דיספלזיה ושחמת כבד שאינו dysplastic (איור 4). אנחנו עובדים כדי לנצל את זה לקראת ביצוע כלי אבחון אוטומטי לשימוש במקרים קשים של מחלת כבד.

חשוב לציין, ברזולוציה מרחבית המוגברת יכולה כעת מאפשרת לנו לבודד את התכונות מבניות ספציפיות שעשויים להיות שינוי כימי במחלה לפני שינויים היסטולוגית ניכרים. לדוגמא, אנו מתמקדים בזיהוי שינויים ביוכימיים במבני גלומרולרי הכליות כגון כמוסה של באומן, מזנגיום, קרום במרתף גלומרולרי וקרום במרתף צינורי, לפני שינויים שזוהו על ידי פתולוג ניתן לצפות (איור 5). בפרט, אנו מעוניינים בזיהוי שינויים הקשורים להתקדמות נפרופתיה סוכרתית ודחייה כרונית בחולים שעבר השתלה, שבו טכניקות הנוכחיות אינן מצליחות לזהות שינויים באופנה מספיק מוקדם להתערבות מוצלחת.

איור 1. תמונות FT-IR וקשת מליבה כבד. תמונה של (A) H & E מוכתמת ליבה מביופסיה של כבד ותמונות של ספיגת IR סעיף סדרתי של אותה הליבה ב( B) 3286 ^-1 סנטימטר ו- (ג) 2,603 ^-1 סנטימטר, אשר הדגיש תכונות מבניות שונות. ספקטרום IR אופייני של רקמה (ד '), עם פסגות חשובות שכותרת. בר סולם = 100 מיקרומטר."Target =" fig1large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור אופטיקה 2. מצבי פעולה סכמטית המפרטים מיקרוסקופ FT-IR. (א) במצב הולכה, המדגם מואר דרך האובייקטיבית התחתון, והאור עובר דרך הדגימה שנאסף על ידי המטרה העליונה. (ב) במצב השתקפות, המטרה העליונה משמשת גם כדי להאיר את המדגם ולאסוף את האור מוחזר. המטרה התחתונה היא לא בשימוש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. השוואה של בידוליעדי t מיקרוסקופ על תמונות FT-IR של glomerulus כליות ב2,925 ^-1 סנטימטר. מטרה () 15X איסוף עם NA = 0.5 (גודל 5.5 x 5.5 מיקרומטר פיקסל). אובייקטיבי (B) 36x איסוף עם NA = 0.5 (גודל 2.2 x 2.2 מיקרומטר פיקסל). (C) 74X איסוף אובייקטיבי עם NA = 0.65 (גודל 1.1 x 1.1 מיקרומטר פיקסל). בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הבדלים בין Spectral סיסטיק וhepatocytes בליבה כבד. (א) H & E מוכתמת ליבה מביופסיה של כבד. (ב) תמונה של ליבה סידורי סעיף הסרוק בFT-IR (הגדרה אובייקטיבית 36x). (ג) נציגספקטרום resentative של hepatocytes וסיסטיק, שנלקח מהאזורים של רקמה מסומנת בחצים ב (א) ו- (ב). סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בידול איור 5. תכונות ביופסית רקמת הכליה באמצעות ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה. סעיף (א) תקופתי חומצה שיף מוכתם בתכונות להיעקר שכותרת. High-Definition תמונת FT-IR של ₂ אזור CH סימטרי המתיחה (36x הגדרה אובייקטיבית) של סעיף סדרתי של אותה הרקמה (B). (C) תכונות שכותרתו ב() הופק באמצעות תמונת FT-IR ב( B) כדי להיות מסוגל כימי DIFferentiate ארבע התכונות של הרקמות. בר סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

FT-IR הוא שיטה המתעוררות להדמיה ביוכימיים ללא תווית של קטעי רקמה, עם הפוטנציאל יש תפקיד חשוב בשיפור הרמה הנוכחית של אבחון בפתולוגיה. תקן הזהב הנוכחי לפתולוגיה דורש רקמות לביופסיה, קבוע בפורמלין, משובץ בפרפין, מחולק מספר פעמים, ומוכתמות בכתמים מרובים. פתולוג מאומן יש להעריך באופן סובייקטיבי חזותי מבנה הרקמות ומורפולוגיה תאית כדי לקבוע אבחנה. כאן אנו מראים כיצד לאסוף תמונות IR ברזולוציה גבוהה מאותו הסוג של חלקים ודנו בכמה מהגישות חישוביות לבחינת הבדלים כימיים בין סוגי תאים ומצבי מחלה.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם על מנת להבטיח כי הרקמות מתמקדות מאוד בזהירות וכי המערכת מכוילת היטב כדי להבטיח נתונים ספקטרוסקופיות באיכות גבוהה מאוד. הטיפול בעת הגדרת המערכת במיוחד criti cal בעת עבודה עם יעדי ההגדלה גבוהים. כדי לסייע בפתרון בעיות, ברשימה שלהלן מכסה חלק מהקשיים הפוטנציאליים נתקלו;

בעיה: עוצמת IR נמוכה כאשר הדמיה בהשתקפות. פתרון: בדוק נטייה שקופיות IR כציפוי רעיוני עשוי להיות בצד הלא נכון של השקופית.

בעיה: אות נמוכה / תמרור אזהרה אדומה בלנסר בקרה. פתרון: גלאים מגניבים עם LN2. חנקן נוזלי דרוש לגלאי FPA לתפקד ודורש מעת לעת שעקף את.

שגיאות שגיאה / תנועת מהירות: בעיה. פתרון: איפוס ספקטרומטר ולצמצם את התנודות. תנודות יגרמו המראה נע בinterferometer שיפריעו.

בעיה: קוצים אדי מים בנתונים. פתרון: להגדיל את הטיהור במערכת ולהגן על מדגם מאוויר.

בעיה: centerburst לא חוקי. פתרון: מצא centerburst שוב.

e_content "> בעיה:. הבדל שטף נמוך בשידור, למרות שהתמקד פתרון:. התאם הקבל תחתון זה יתרחש כאור IR לא להיות ממוקד לנקודה במדגם.

במאמר זה, יש לנו התמקד בשאלה כיצד לרכוש בחדות גבוהה תמונות IR של רקמות באו שידור או מצב transflectance. הטבע של ההדמיה FT-IR, הם שיש שינויים רבים שניתן לעשות לרכישת נתונים, כגון, סוג של מצע, טכניקת קיבוע, עובי מדגם, רזולוציה רפאים, מהירות מראה interferometer וכו 'השפעתם של פרמטרים אלה יש נדון בפירוט רב לאחרונה ^4,5,17,51.

ישנם מספר של שינויים שניתן לעשות במערכת ההדמיה כולל הדמיה במצב ^10,24,26 ATR ותוך שימוש בגישות תרמית בקנה מידה ננומטרי ^52,53 כדי לאפשר הדמיה IR ברזולוציה גבוהה. המגבלה העיקרית עם ההדמיה IR ברזולוציה גבוהה היא שtiחייב להיות מוכן ssues בזהירות ורזה מספיק IR לעבור (בדרך כלל עובי 4 מיקרומטר). בנוסף, הולכה והחזרת ההדמיה FT-IR דורשת דגימות להיות יבש בשל הספיגה של IR על ידי מים. עם זאת, יש הדמיה FT-IR יתרונות משמעותיים על פני שיטות אחרות, בכך שהוא יכול שטחים גדולים מאוד במהירות תמונה של רקמות תוך ביסוס מידע ביוכימי עשיר ומפורט. טכניקות דומות אחרות הנובעות מידע ביוכימיים באופנה ללא תווית כוללות ספקטרוסקופיית ראמאן, אולם בעת רכישת נתונים היא הרבה יותר איטית לרכוש תמונות. גישות הדמיה החדשה ראמאן הם מתעוררים כוללים פיזור ראמאן המאולץ (SRS) ופיזור קוהרנטית Antistokes ראמאן (CARS); עם זאת, יש להם טווח ספקטרום מוגבל גישה או הדמיה תדר אחד.

ההתקדמות במהירות של רכישת נתונים, ברזולוציה מרחבית, וזמינות של גישות חישוביות הייתה בעל ערך עצום בקבלת מתאר לעצמי FT-IR ing גישה ריאלי יותר לתרגום ככלי הדמיה חדש בפתולוגיה. ההתקדמות שחלה באחרונה ברזולוציה מרחבית הייתה חשובה במיוחד לפתולוגיה רקמה בשל סוגי תאים עיקריים שאינו פתיר באמצעות מערכות הדמיה FT-IR קונבנציונליות. המאמר האחרון על ידי אל Reddy et. הראה כיצד מודל מערכת אידיאלית להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של מערכת הדמיה FT-IR ^5. דוגמא רקמת הכליה שהוצגה במאמר זה מדגימה את החשיבות של החלטות מרחבית גבוהות יותר כדי לחלץ מידע ביוכימיים ממבני גלומרולריות (איור 3 ואיור 5). בעתיד, התקדמות חדשה במקורות אור IR כבהירים מאוד לייזרי אשד קוונטית ^54-57, הדמיה 3D רפאים ^58, ופריצות דרך בתחום טכנולוגיות ננו IR ^52,53,59,60 להחזיק אפיקים חדשים מרגשים של מחקר שעשויה להיות לי השלכות עצומות בעתיד של הדמיה רקמות.

התחת = "jove_content"> יש לנו הצגנו דוגמאות ליישומים בכבד ובמחלת כליות שבו יש צורך במידע ביוכימיים נוסף שיכול להיות בעל ערך לאבחון. המעבדה לפתולוגיה Spectral במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו מתמקדת בתרגום של טכנולוגיות ההדמיה IR לשיפור אבחון מחלה ושיפור חיזוי של תוצאת מטופל. ההדמיה FT-IR יכולה להתגבר על חלק מהמגבלות הנוכחיות בפועל פתולוגיה שבו מידע כמותי ואובייקטיבי נדרש. בפרט, עבודה בעתיד מתמקדת בזיהוי התחומים בפועל פתולוגיה הנוכחית שבו טכניקות הנוכחיות אינן מספקות רגישות אבחון נאותה או לספק מידע מוגבל. צורך ברור קיים בשיפור הפרקטיקה הנוכחית של פתולוגיה וכלפי נותן מידע נוסף לפתולוג על מצב המחלה של מטופל, שעשויה להיות בר השגה באמצעות ההדמיה FT-IR בחדות גבוהה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 600 Series FT-IR system	Agilent	Multiple configurations	Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR	Edmund Optics	66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR	Edmund Optics	66-586
MirrIR slide	Kevley Technologies	CFR	For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas	Multiple gas suppliers	Multiple sizes
Hexane	Sigma Aldrich	Multiple sizes	For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen	Multiple cryogenic liquid suppliers	Multiple sizes
ENVI-IDL software	Exelis-Vis		Other software packages available
Whole slide Imager	Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)		To image stained slides