Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) espectroscópica por imagem das secções de tecidos humanos para a melhoria da Patologia

Resumo

Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.

Resumo

Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) imagens espectroscópicas é uma abordagem emergente para obter imagens detalhadas que associou informação bioquímica. Imagiologia de FT-IR de tecido é baseado no princípio de que as diferentes regiões do infravermelho médio são absorvidos por ligações químicas diferentes (por exemplo, C = O, CH, NH) no interior das células ou tecidos, que pode então ser relacionados com a presença e composição de biomoléculas (por exemplo, lípidos, ADN, glicogénio, a proteína, o colagénio). Em uma imagem de FT-IR, cada pixel na imagem compreende todo um espectro de infravermelhos (IV) que pode dar informação sobre o estado bioquímico das células que podem então ser exploradas para o tipo de célula ou tipo-classificação da doença. Neste artigo, vamos mostrar: como obter imagens IR a partir de tecidos humanos, por meio de um sistema de FT-IR, como modificar a instrumentação existente para permitir capacidades de imagem de alta definição, e como visualizar imagens FT-IR. Em seguida, apresentamos algumas aplicações de FT-IRpara patologia usando o fígado e rim como exemplos. Imaging FT-IR detém aplicações interessantes em proporcionar uma nova rota para obter informações bioquímica das células e tecidos em uma rota não perturbando inteiramente livre-label no sentido de dar uma nova visão sobre mudanças biomoleculares como parte de processos de doença. Além disso, esta informação bioquímica pode potencialmente permitir a análise objectiva e automatizada de certos aspectos de diagnóstico da doença.

Introdução

Espectroscopia no infravermelho tem sido uma ferramenta analítica disponível de alguma forma desde a década de 1930; no entanto, é apenas sido na última década que a área da imagiologia tecido com FT-IR explodiu. Os avanços na FT-IR para imagens de tecidos têm sido impulsionado em grande parte por três desenvolvimentos principais: 1) aumento da velocidade de aquisição de dados, devido à disponibilidade de grande matriz de plano focal (FPA) detectores que tipicamente têm milhares de detectores sensíveis IR ^{1 , 2,} 2) desenvolvimento de algoritmos de processamento avançados e poder computacional para lidar com grandes volumes de dados hiperespectrais define ^3, e 3) a modelagem de sistemas de imagens FT-IR para maximizar a resolução espacial ^{de 4,5.} Houve inúmeros alta qualidade e muito extensos artigos de revisão no campo da espectroscopia FT-IR recentemente ^6-16, além de um artigo da Nature Protocols que detalha as etapas para a obtenção de espectros de ponto ou mapas a partir de tecidos ^17. Neste artigo, vamos nos concentrar no protOCOL a obtenção de imagens de tecidos, utilizando um detector de 128 x 128 FPA num sistema de FT-IR modificado com capacidades de alta definição.

Imagiologia de FT-IV tem sido sugerida como um instrumento potencialmente desejável para a célula e imagiologia do tecido devido à capacidade de obtenção de imagens, em que cada pixel tem uma riqueza de informação bioquímica. FT-IR de imagem baseia-se no princípio de que em diferentes biomoléculas de uma amostra irá absorver quantitativamente diferentes regiões do infravermelho médio; isto permite a derivação de uma "impressão digital bioquímica '. Esta impressão digital tinha sido demonstrado em vários estudos para alterar entre diferentes tipos de células e estados de doença. Ao contrário da prática convencional, em que a patologia manchas de imuno-histoquímica e marcadores necessitam de ser utilizada para visualizar e identificar os tipos de células e estruturas de tecidos que são utilizados para guiar as possibilidades de diagnóstico e tratamento, as imagens de FT-IR são formados com base na bioquímica inerente do tecido. O techniq atualue de tecido de coloração para o diagnóstico é demorado, destrutivo, trabalhoso e requer experiência subjetiva do patologista, enquanto FT-IR oferece o potencial para tornar esse processo rápido, não destrutivo, altamente automatizado, e mais objetiva. Além disso, FT-IR proporciona uma nova via para a obtenção de informação bioquímica adicional que pode não estar prontamente acessíveis usando técnicas de coloração convencionais.

Um dos avanços mais excitantes nos últimos anos tem sido a disponibilidade de métodos de imagem de alta resolução que podem agora permitem a visualização e caracterização dos tipos de células e estruturas de tecidos que são críticos para o diagnóstico de doença global. Uma dessas técnicas é a reflectância total atenuada (ATR) FT-IR que incorpora uma lente de imersão em sólido (SIL) de um índice de refracção elevado, que permite a alta resolução de imagem ^18, com os diversos estudos muito interessantes mostrando as suas aplicações ^19-25. Além disso, wcomo recentemente demonstrado que o aumento da resolução espacial associado com ATR imagem pode permitir a visualização e classificação de células endoteliais e mioepiteliais no tecido mamário que formam um componente-chave do diagnóstico de câncer de mama ^26. Enquanto ATR imagem é muito útil, esta técnica requer o SIL para fazer contato com o tecido para formar imagens FT-IR; portanto, seu uso é um pouco limitado para a patologia do tecido onde grandes regiões de tecidos devem ser rapidamente trabalhada.

Uma segunda abordagem foi demonstrada por acoplamento de um objectivo de grande ampliação de um sistema de FT-IR existente que usa um sincrotrão como uma fonte luminosa de infravermelhos, é possível iluminar completamente FPA e uma imagem com um tamanho efectivo de pixels de 0,54 x 0,54 mm. Isto permitiu-nos visualizar estruturas-chave em tecidos da mama e da próstata que não foram resolvido utilizando sistemas de ⁴ FT-IR convencionais. Embora estes aumentos dramáticos na imagem IR resolutio espacialn foram emocionantes, a sua utilização permaneceu limitada devido à necessidade de um síncrotron. Posteriormente, um sistema ótimo foi projetado que poderia permitir também a capacidade de imagem de alta definição com um tamanho de pixel de 1,1 x 1,1 mm, sem a exigência de uma fonte síncrotron, mas sim através de uma fonte IR globar tradicional ^5. Neste artigo, vamos mostrar como modificar um sistema de imagem existente comercial FT-IR para permitir a difração de IR limitada imagem de tecidos com um sinal aceitável para ruído utilizando múltiplos objetivos IR (15X, 36X, e 74x). O tamanho efectivo de pixels com os três objectivos é de 5,5 x 5,5 mm (15X), 2.2 x 2.2 mm (36X) e 1,1 x 1,1 mm (74x). Nós, então, dar alguns exemplos da importância dos ganhos de resolução espacial para a detecção de doenças no fígado e rins ²⁷ biópsias.

Protocolo

1. Criação de um FT-IR Microscópio e Aquisição de Tecidos Images

1. Seção de um bloco fixado em formol tecido embebido em parafina em 4 mm de espessura para um slide de IR compatível usando um micrótomo. Como alternativa, uma seção de nitrogênio tecido congelado líquido a 4 mm de espessura para um diapositivo compatível IR usando um criostato.
   NOTA: Normalmente, uma seção de série também será adquirido em uma lâmina de vidro e corados com uma especial (como Hematoxilina e Eosina (H & E)) ou coloração imuno-histoquímica. Além disso, as linhas de células em cultura pode ser crescida em lâminas compatíveis IR. Lâminas compatíveis IR pode ser lâminas reflexivas IR para modo de imagem reflexão (por exemplo, MirrIR slide, ouro) ou IR lâminas transparentes para o modo de transmissão de imagem (por exemplo, BaF _2, CaF _2).
2. Purga-se o microscópio de FT-IR utilizando um espectrómetro e ar seco ou azoto seco para remover a água da atmosfera a partir do sistema. Espere pelo menos 45 minutos antes de imagem para garantir uma completa Purge.
3. Arrefecer tanto o detector FPA (a 79 K) e o detector de TMC interno no microscópio de FT-IR utilizando azoto líquido. Arrefecer os detectores de aproximadamente a cada 6 horas.
   CUIDADO! O nitrogênio líquido é um fluido criogênico e pode causar queimaduras de frio, queimaduras e em espaços fechados asfixia.
4. Montar a lâmina amostra na platina do microscópio para a imagiologia de FT-IR.
5. Garantir a luz visível é "ON" e em seguida, usando os binóculos ou o programa de captura de amostra (que fornece uma imagem em tempo real visível do tecido), concentrar-se na amostra.
6. Abra o pacote de software pacote, tais como resoluções pró e clique em "Collect", depois clique em "Diagnóstico" e, em seguida, selecione "Align Spectrometer". Certifique-se de que o caminho do feixe ao detector interno espectrômetro não está obstruído.
7. Clique em "Configuração de Imagem '.
8. Na aba 'Eletrônica', selecione a opção 'Speed' adequado, 'Under SaRácio mpling (UDR) 'e' configurações 'Filtros, dependendo do sistema.
   NOTA: Neste exemplo, o cenário é Velocidade = 2,5 KHz, UDR = 4 e Filtros = None.
9. Na aba 'Optics' garantir que «fonte Mid-IR ',' Open abertura" e "100% atenuador feixe 'são selecionados.
10. Para calibrar o sistema, no separador "Optics", selecione "Detector 'como' terra ',' Microscópio Detector 'como' Esquerda ', e, em seguida, selecione' Transmitância 'ou' Reflectance" em "modo de Óptica", dependendo do tipo de deslizar a ser utilizado.
11. Clique em Configurar, que vai abrir a janela "Controle Lancer '.
    NOTA: Para o modo de reflexão seguir as instruções em 1,12 e 1,13 e para o modo de transmissão de seguir as instruções em 1,14-1,16. Continue de 1,17 tanto para reflexão e transmissão.
12. Para o modo de reflexão, no &# 8216; 'clique em' Control Lancer Raw '. Usando o joystick de controle palco e assistir a exibição ao vivo da imagem interferogram FT-IR (imagem à direita), se deslocar para uma área limpa no slide.
13. Ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens. Em seguida, a fase de mover-se para encontrar um pedaço de tecido com estrutura, de preferência, a borda de um tecido, e aperfeiçoar a focagem da imagem. Opções 'Contraste' para ajudar a formar uma imagem para melhorar focando Change 'calor' e, este não terá nenhum efeito sobre os dados IR. Continue a partir de 1,18.
14. Para o modo de transmissão, clique 'Control Lancer' on 'Raw'. Usando o joystick de controle palco e assistir a exibição ao vivo da imagem interferogram FT-IR (imagem à direita), se deslocar para uma área limpa do slide.
15. Ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens.
16. Ajustar o objectivo de focagem inferior / condensador para aumentar o número de contagens para a sua maximum. Assista a forma da imagem inferior direito no controle Lancer para garantir que ele é Gaussian na aparência e relativamente uniforme. Ajuste o tempo de integração novamente para aproximadamente 8.000 contagens.
    NOTA: Se algum dos pixels na imagem interferogram o FT-IR virar branco, reduzir o tempo de integração.
17. Mover a etapa de encontrar uma peça de tecido com estrutura, de preferência, a borda de um tecido e aperfeiçoar a focagem da imagem. Opcionalmente, altere as opções de calor e de contraste para ajudar a formar uma imagem para melhorar a focalização, mas não terá nenhum efeito sobre os dados IR.
18. Usando o joystick de controle fase, passar para uma área limpa do slide. Pressione o botão "Calibrar". Verifique se o 'Out Of Range (OOR)' valor é inferior a 50 e a diferença entre o 'High Flux' e conta 'Low Flux "é, no mínimo, 4.000 contagens.
19. Selecione "OK" duas vezes. Nos guias óptica selecionar; 'MCT' 'detector' = 'Microslidar Detector '=' direita 'e, em seguida, clique em "Setup". Neste ponto, haverá uma interferogram FT-IR na tela. Clique em "Localizar Centerburst '. Clique em "Ok".
20. Na aba "Optics", selecione novamente 'detector' = 'Ground', 'Microscópio Detector' = "Esquerda" e selecione "Setup".
21. In Control Lancer - garantir que a imagem ainda está em uma área limpa e clicar em 'Calibrar' novamente. Clique em "Ok".
22. Em seguida, recolher imagem de FT-IR um fundo para corrigir a absorvância a partir da atmosfera, e sistema de corrediça. Vá até a aba 'Eletrônica' e selecione uma resolução espectral adequado, tipicamente de 4 ^cm-1 ou 8 centímetros ^-1 para tecido.
23. Vá para a aba "fundo" e digite 128 em 'Scans para co-adicionar'. Selecione a opção "New File ..." botão e coloque o arquivo de fundo em dobra apropriadoer. Confira a página 'Imagem' para garantir mosaicing é um por 1. Clique em "fundo", aguarde a verificação para terminar e confirmar o local para salvar o arquivo. Clique em uma região na imagem FT-IR de fundo e verificar o espectro.
24. Para ter uma imagem grande mosaico da amostra, selecione a guia 'Imagem' e insira o número de quadros X e Y para o tamanho do mosaico você deseja adquirir.
25. Clique em "Setup" e no controle Lancer usar a exibição de IR ao vivo para encontrar a área de interesse. Se tomar um mosaico, centralizar a transmissão ao vivo no meio da área de interesse. Clique em "Ok". Vá até a aba 'Eletrônica' e digite o número de scans para co-add (normalmente um valor entre 2 e 16 scans para o tecido). Clique em 'Scan'.
26. Verifique a imagem FT-IR recolhido na tela para garantir que parece focada. Clique na imagem para abrir um espectro de IR a partir desse local e verificar que ele parece ter um sinal aceitável ao ruído. Acquire uma imagem visível da amostra.
27. Salve a imagem e exportá-lo para o formato exigido, como ENVI-IDL.

2. Adaptar um Microscópio FT-IR para capacidades de alta definição

NOTA: A maioria dos sistemas FT-IR são equipados com uma ampliação de 15x objetivo aproximadamente 0,5 e abertura numérica (NA). Para a imagem no modo de alta definição, uma IR compatível 36X ou 74x objectivo pode ser usado para dar difração capacidades de imagem limitadas.

1. Retirar objetivo 15X do sistema, desapertando sentido anti-horário.
2. Aparafusar a objectiva 36X ou 74x em seu lugar. Alinhar o objectivo antes da utilização. Utilize tubos de extensão da lente para trazer o suficiente o objectivo perto da amostra.
3. Coloque o tecido sob o novo objetivo e foco usando a luz visível usando as binóculos ou programa Capture Sample.
   NOTA: Imagens de alta definição deve ser feita em modo de transmissão. A distância de trabalho muito próximo doobjetivos SE (1-2 mm) e muito pouca profundidade de foco requer focando devagar e com cuidado, tendo tempo para diminuir o objetivo sem tocar na amostra.
4. Siga as instruções de 1,6-1,11.
   NOTA: Devido a ser significativamente mais difícil de se concentrar e muito menos luz que atinge o detector, o protocolo seguinte é ajustada com base em 1,14.
5. No modo de transmissão, clique em 'Raw'. Usando o joystick de controle palco e assistir a exibição ao vivo da imagem interferogram FT-IR (imagem à direita), passar para o tecido e foco (de preferência em uma borda).
   NOTA: Isso pode ser difícil, por ajustar o 'calor' e opções 'Contraste' para ajudar a formar uma imagem para melhorar a focalização (essas opções não afetam os dados IR).
6. Uma vez que o foco, usando o joystick controle do estágio ea vista IR movimento ao vivo para uma área limpa do slide. Ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens. Ajuste o fundo com foco objetivoaumentar o número de contagens para o seu máximo. Ajuste o tempo de integração novamente para aproximadamente 8.000 contagens.
7. Mover a etapa de encontrar uma peça de tecido com estrutura, de preferência, a borda de um tecido, e aperfeiçoar a focagem da imagem.
8. Se mosaicagem uma imagem em alta resolução, ajustar o estágio para permitir o movimento correto necessário através de distâncias para mosaicing preciso. Para alterar as configurações de distância do palco, ir a 'fase Setup' em Controle Lancer e ajustar as configurações de alinhamento horizontal e vertical para permitir mosaicking correta.
9. Usando o movimento joystick controle palco para uma área limpa do slide. Pressione o botão "Calibrar". Verifique se o valor fora do intervalo (OOR) é inferior a 50, tanto para 36X e 74x objetivos. Garantir a diferença entre o alto fluxo e baixos valores de fluxo é, pelo menos, 1.000 contagens para o objetivo 74x e 2.000 contagens para o objetivo 36X.
10. Continue 1,19-1,27. O número de scans em 1,23 e1.25 terá de ser ajustado em função de sinal reduzido para aproximadamente 256 varreduras para a imagem de fundo e 16-128 scans imagem do tecido para.

3. visualizar e Classificando IR espectrais conjuntos de dados

NOTA: Nesta seção, vamos discutir a forma de visualizar e extrair dados de imagens espectrais usando processamento de imagens geoespaciais e análise de software, tais como ENVI + IDL, no entanto, o processo é muito semelhante para qualquer software alternativo, como MATLAB, software livre, como CytoSpec ou o próprio software do desenvolvedor instrumento. Existem algumas técnicas de processamento espectral diferentes que podem ser realizados sobre os dados de IV.

1. Abrir o processamento de imagens geoespaciais e software de análise e carregar o arquivo de dados IR.
2. Aplicar um algoritmo de correção de linha de base para os dados do IR, selecionando "Ferramentas espectral" e role a página e clique em "espectros Absorbance". Observar um menu pop-up e selecione "linha de base correcção "
   NOTA: correção de linha de base irá remover uma inclinação deslocamento da linha de base a partir dos dados devido à dispersão
3. Realizar normalização espectral, por ratioing os dados para uma determinada pico espectral (tipicamente de Amida I (1,650 centímetros ^-1) ou Amida II (1550 centímetros ^-1)) ou área sob uma região definida dos espectros. Faça isso selecionando "espectros Normal" sob o título "Absorbance Spectra" opções de menu.
   NOTA: Spectral normalização é realizada para que as eventuais diferenças de espectros são verdadeiras diferenças bioquímicas e não devido à espessura ou diferenças de densidade entre as amostras.
4. Use um algoritmo de redução de ruído para remover o ruído a partir dos espectros se necessário ^28.
   NOTA: Existem várias formas de tratamento disponíveis, através da qual a correção de linha de base, a normalização espectral e redução de ruído pode ser alcançado, com a maioria dos softwares de ter algoritmos automáticos construídos em Além disso, há um número emergente de abordagens que irão corrigir para.aberrações espectrais, que foram discutidas em detalhe ^29-42; No entanto, a comunidade ainda não concordam em que estes elementos são necessários.
5. Observar uma lista de todas as frequências RI recolhidos no interior da imagem (tipicamente de um intervalo espectral de 900 a 4.000 ^cm-1). Clique sobre as frequências que correspondem a biomoléculas específicas para observar uma imagem do tecido para a frequência seleccionada.
   1. Por exemplo, clique na banda de 1650 centímetros ^-1 para observar a distribuição de proteínas na amostra. Alternativamente clique na banda de 1080 centímetros ^-1 para observar a distribuição de ácidos nucleicos na amostra. Use wavenumber 1650 centímetros ^-1.
6. Criar imagens adicionais por computação rácios espectral de pico altura, proporções de áreas de pico, etc., que permitam a visualização dos diferentes componentes biomoleculares. Clique em 'Ferramentas' e espectrais em seguida, selecione "Rácios altura do pico" ou "calcular a área de Imagem 'para criar imagens.
7. Digitalizar o corte de tecido adjacente correspondente que está manchado usando um sistema de slides imager todo separado que captura imagens de campo claro. A imagem IR Ao lado, trazer a imagem digital do tecido manchado com um programa de imagem visível.
8. Botão direito do mouse sobre a imagem em uma região de interesse e selecione o perfil Z '. Isso dará a informação espectral no pixel selecionado.
9. Veja o espectros IR de vários pixels de várias classes, tais como comparando os tipos de células, estados de doença. Marcar pixels específicas sobre a imagem usando o 'regiões de interesse' (ROI) da ferramenta. Para realizar isso, clique direito sobre a imagem e selecione "ferramenta ROI". Criar as classes que devem ser rotulados, por exemplo normal, displasia, e aulas de câncer. Em seguida, selecione "Tipo de ROI '-' Point '. Em seguida, selecione a classe para selecionar pixels para e desenhar sobre os pixels adequadas a imagem IR diante. Derivar a média espectros fou cada uma das classes que usam a ferramenta 'ROI médio'.
10. Compare espectros obtidos por plotagem em software gráfico.

Resultados

Imaging FT-IR permite a derivação de imagens IR de tecido que podem dar diferentes contrastes, dependendo da freqüência IR de interesse. Além disso, uma imagem em infravermelhos, a cada pixel compreende todo o espectro de IV, com diferentes picos correspondentes aos diferentes biomoléculas que pode dar informação sobre as propriedades bioquímicas dos tipos de células ou em estados de doença (Figura 1). Aqui, nós mostramos como comparar assinaturas espectrais entre as classes, classificação automática no entanto mais avançada é possível usando algoritmos adicionais ^3,43-50, como a classificação bayesiana, aleatórios Florestas, Redes Neurais Artificiais, e Hierarchal Análise Cluster pode ser realizada no dados. Abordagens de classificação supervisionada permitirá a construção de um classificador que pode ser formado para permitir o reconhecimento automático dos tipos de células ou em estados de doença. Abordagens classificação não-supervisionada pode ser usado para procurar dif que ocorre naturalmenteconferências em tecido ou células, devido à variação bioquímicos.

Instrumentação FT-IR tem evoluído ao longo das últimas décadas, a partir da medição de um modo único ponto / mapeamento usando IR aberturas opacas para o modo de imagem usando objetivos Cassegrain, usando um objetivo iluminando juntamente com um objetivo coletar em modo de transmissão ou de um único objetivo que tanto ilumina e recolhe-em modo de reflexão (Figura 2). Recentemente, foi demonstrado que o objetivo coletar em modo de transmissão poderia ser transferido para uma maior ampliação e objetiva de abertura numérica para permitir a difração limitada imagem IR, que leva a um aumento substancial na resolução espacial de imagens IR recolhidos ^4,5. Os avanços na resolução espacial para a imagem latente de tecidos têm sido de fundamental importância, pois agora podemos identificar tipos de células e estruturas de tecidos, por exemplo, as unidades funcionais do rim, os glomérulos, usando adaptado in-houseSistemas de FT-IR (Figura 3).

De alta definição de imagem FT-IR permite imagens detalhadas dos tecidos a serem examinados para identificar regiões anormais e identificar diferenças bioquímicas entre os diferentes tipos de células. Em um núcleo de tecido hepático, é possível visualizar os hepatócitos e as regiões de fibrose infiltrantes que divide duas áreas distintas de displasia e cirrose não-displásicas (Figura 4). Estamos trabalhando para explorar esta no sentido de tornar as ferramentas de diagnóstico automatizadas para uso em casos difíceis de doença hepática.

É importante ressaltar que o aumento da resolução espacial pode agora nos permitem isolar características estruturais específicas que podem ser modificados pela doença antes que as alterações histológicas são aparentes. Por exemplo, estamos focados em identificar alterações bioquímicas nas estruturas glomerular renal, como a cápsula de Bowman, mesangium, membrana basal glomerular e membrana basal tubular, antes alterações identificadas pelo patologista pode ser observado (Figura 5). Em particular, estamos interessados ​​na identificação de alterações associadas à progressão da nefropatia diabética e rejeição crônica em pacientes transplantados, onde as técnicas atuais não conseguem identificar as mudanças de uma forma bastante cedo para a intervenção bem-sucedida.

Figura 1. imagens FT-IR e espectro de um núcleo de fígado. Imagem de (A), coradas com H & E de núcleo a partir de biópsia e imagens de absorvância IR de secção em série do mesmo núcleo em fígado (B) 3,286 ^cm-1 e (C) 2603 cm ^-1, que destacou diferentes características estruturais. (D) o espectro IR típico de tecidos, com picos importantes marcados. Barra de escala = 100 pm."target =" _ fig1large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Optics detalhando modos esquemáticos operação microscópio FT-IR. (A) no modo de transmissão, a amostra é iluminada através do objectivo de fundo, e a luz que passa através da amostra é coletada pelo objectivo superior. (B) No modo de reflexão, o objectivo topo serve tanto para iluminar a amostra e para recolher a luz reflectida. O objetivo final não é usado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Comparação de diferent objectivos microscópio sobre imagens FT-IR de um glomérulo renal em 2925 centímetros ^-1. (A) 15X coleta objetivas com NA = 0,5 (tamanho 5,5 x 5,5 mm pixel). (B) O objectivo 36X coleta com NA = 0,5 (tamanho 2,2 x 2,2 mm pixel). (C) 74x coleta objetiva com NA = 0,65 (tamanho 1,1 x 1,1 mm pixel). Barra de escala = 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. diferenças espectrais entre fibrose e hepatócitos no fígado de um núcleo. (A) H & E manchado núcleo de biópsia hepática. (B) A imagem de um núcleo de seção de série digitalizado no FT-IR (36X configuração objetiva). (C) RepOs espectros tante de hepatócitos e fibrose, tomada a partir de regiões de tecido indicadas pelas setas em (A) e (B). Scale bar = 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Diferenciação das características de biópsia de tecido renal através da utilização de imagiologia de alta definição de FT-IR. (A) Secção ácido periódico de Schiff corados com as características para ser extraído marcado. (B) de alta definição de imagem de FT-IR de ₂ assimétrica região de estiramento CH (36X configuração objectivo) de uma secção em série do mesmo tecido. (C) Características rotulada em (A), extraiu-se usando a imagem de FT-IR em (B) para ser capaz de dif quimicamenteferentiate as quatro características do tecido. Barra de escala = 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

FT-IR é uma modalidade emergente de livre-label imaging bioquímica de cortes de tecidos, com o potencial de ter um papel importante na melhoria do padrão atual de diagnóstico em patologia. O padrão ouro atual para a patologia requer tecidos para a biópsia, fixados em formol, embebidos em parafina, seccionados várias vezes, e corados com várias manchas. Um patologista altamente treinados tem de avaliar subjetivamente visualmente a estrutura do tecido e morfologia celular, para determinar um diagnóstico. Aqui nós mostramos como coletar imagens de infravermelho de alta resolução a partir do mesmo tipo de seções e discutir algumas das abordagens computacionais para examinar as diferenças químicas entre os tipos de células e estados de doença.

Os passos críticos dentro deste protocolo são para garantir que os tecidos são muito cuidadosamente focado e que o sistema está bem calibrado para garantir que os dados espectroscópicos de qualidade muito elevada. O cuidado ao configurar o sistema é particularmente criti cal quando se trabalha com objetivos de alta ampliação. Para ajudar na solução de problemas, a seguinte lista abrange alguns dos potenciais dificuldades encontradas;

Problema: intensidade IR Low na obtenção de imagens em reflexão. Solução: Verifique IR orientação slide como o revestimento reflexivo pode estar no lado errado do slide.

Problema: Baixo sinal de aviso / Red em Controle Lancer. Solução: detectores de frescos com LN2. O nitrogênio líquido é necessário para os detectores FPA para funcionar e requer periodicamente sendo tampo.

Erros de erro / movimento Velocity: problema. Solução: Repor espectrômetro e reduzir as vibrações. Vibrations fará com que o espelho se movendo no interferômetro de ser perturbado.

Problema: spikes vapor de água na dados. Solução: Aumentar a purga no sistema e proteger amostra de ar.

Problema: centerburst inválido. Solução: Encontre centerburst novamente.

e_content "> Problema:. diferença Baixo fluxo de transmissão, embora focado. Solução: Ajuste condensador inferior Isso ocorrerá quando a luz IR não está sendo focado para um ponto na amostra.

Neste trabalho, temos nos concentrado em como adquirir imagens de alta definição de IR de tecidos em qualquer modo de transmissão ou de transflectância. A natureza das imagens de FT-IR, é que existem várias modificações que podem ser feitas para a aquisição de dados, tais como, o tipo de substrato, técnica de fixação, espessura da amostra, a resolução espectral, interferômetro velocidade espelho etc. O efeito desses parâmetros possui foi discutido em grande detalhe recentemente ^4,5,17,51.

Há uma série de modificações que podem ser feitas para o sistema de imagem, incluindo imagens no modo ATR ^10,24,26 e usando abordagens térmicas nanoescala ^52,53 para permitir imagens de alta resolução IR. A principal limitação com alta resolução de imagem IR é que a tissues deve ser cuidadosamente preparada e fino o suficiente para IR de passar por (tipicamente 4 espessura mm). Além disso, a transmissão e reflectância de imagem de FT-IR requer as amostras a ser seca, devido à absorção de IV, pela água. No entanto, a imagem de FT-IR tem vantagens significativas sobre outras técnicas, em que ele pode rapidamente grandes áreas de imagem de tecido, enquanto que derivam informação bioquímica rico e detalhado. Outras técnicas similares que derivam informação bioquímica de uma forma livre de marcador incluem a espectroscopia de Raman, no entanto, o tempo de aquisição de dados é muito mais lento para aquisição de imagens. Abordagens de imagem New Raman estão surgindo incluindo Stimulated Raman (SRS) e coerente Antistokes espalhamento Raman (CARS); no entanto, eles têm acesso à gama espectral limitada ou de imagem de uma única frequência.

Os avanços na velocidade de aquisição de dados, resolução espacial, e disponibilidade de abordagens computacionais têm sido de enorme valor na tomada de imag FT-IRing uma abordagem mais viável para a tradução como uma nova ferramenta de imagem na patologia. Os recentes avanços na resolução espacial têm sido particularmente importante para a patologia do tecido devido à tipos de células-chave não sendo resolvido usando sistemas de imagem FT-IR convencionais. O artigo recente de Reddy et al. mostrou como modelar um sistema ideal para obter a resolução espacial óptima de um sistema de imagem de FT-IR ^5. O exemplo de tecido renal apresentada neste artigo demonstra a importância de resoluções espaciais mais altas a fim de extrair informação bioquímica de estruturas glomerular (Figura 3 e Figura 5). No futuro, os novos avanços em Quantum Cascade Lasers fontes de luz IR como muito brilhantes ^54-57, 3D imagem espectral ^58, e avanços no campo das tecnologias em nanoescala IR ^52,53,59,60 realizar novos caminhos de pesquisa que podem ter grandes implicações para o futuro da imagem do tecido.

Nós apresentamos exemplos de aplicações em fígado e doença renal, onde há uma necessidade de informação bioquímica adicional que pode ser de valor diagnóstico. O Spectral Patologia Laboratório do Departamento de Patologia da Universidade de Illinois em Chicago é focada na tradução de tecnologias de imagem IR no sentido de melhorar o diagnóstico da doença e melhorou a previsão de evolução de pacientes. Imaging FT-IR pode superar algumas das limitações atuais na prática patologia onde a informação quantitativa e objetiva é necessária. Em particular, o trabalho futuro está focada na identificação de áreas em prática patologia atual em que as técnicas atuais não fornecem sensibilidade diagnóstica adequada ou fornecer informações limitadas. Existe uma clara necessidade em melhorar a prática atual de patologia e no sentido de dar mais informações para o patologista sobre o estado de doença de um paciente, que pode ser obtida através de alta definição de imagem FT-IR.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cary 600 Series FT-IR system	Agilent	Multiple configurations	Alternate FT-IR imaging systems exist
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65 NA IR	Edmund Optics	66-592
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5 NA IR	Edmund Optics	66-586
MirrIR slide	Kevley Technologies	CFR	For FT-IR reflection-mode measurements
Barium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Calcium Fluoride slides	International Crystal Laboratories	Multiple sizes	For FT-IR transmission-mode measurements
Dry Nitrogen/Dry Air gas	Multiple gas suppliers	Multiple sizes
Hexane	Sigma Aldrich	Multiple sizes	For deparafinizing tissue
Liquid Nitrogen	Multiple cryogenic liquid suppliers	Multiple sizes
ENVI-IDL software	Exelis-Vis		Other software packages available
Whole slide Imager	Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu)		To image stained slides