<em&gt; באוב</emAssay&gt; אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma

Summary

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Abstract

קרום החומוס chorioallantoic (רמ"א) מתחיל לפתח על ידי יום 7 לאחר הפריה ומתבגר ביום 12. CAM הוא באופן טבעי immunodeficient וכלי דם מאוד, מה שהופך את מערכת אידיאלית להשתלת גידול. יתר על כן, CAM מכיל חלבונים תאיים מטריצה ​​כגון פיברונקטין, laminin, קולגן, אלפא integrin (נ) beta3, וMMP-2, מה שהופך את מודל אטרקטיבי ללמוד פלישת גידול וגרור. מדענים רבים ניצלו את הפיסיולוגיה של CAM על ידי שימוש בו כמודל של אנגיוגנזה. לאחרונה, assay CAM שונתה כדי לעבוד כמערכת in vivo xenograft מודל לסוגי סרטן שונים שמגשרת על הפער בין עבודה בסיסית במבחנה ודגמי סרטן בבעלי החיים מורכבים יותר. Assay CAM מאפשר לחקר צמיחת גידול, טיפולים אנטי-סרטניים, ומסלולים מולקולריים פרו-סרטניים במערכת רלוונטית מבחינה ביולוגית שהוא גם עלות וזמן יעיל. כאן, אנו מתארים את ההתפתחות של Xen CAMמודל ograft של קרצינומה hepatocellular (HCC) עם שיעורי הישרדות עובריים של עד 93% וגידול אמין לקחת מוביל לצמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם.

Introduction

קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם המוביל ³ בתמותה מהסרטן בעולם ^1. כיום רק 30% מחולי HCC זכאים לטיפולים כירורגיים פוטנציאל מרפא ^2, וכימותרפיה מערכתית אינה יעילה ^3. לכן, יש צורך דחוף שלא סופקו קליני לטיפולי HCC רומן, והפיתוח של מערכות מודל מתאימות לבדיקות יעילים של סוכנים חדשים. Assay חומוס chorioallantoic קרום (CAM) מספק שיטה לשחזור, חסכונית, מהירה ובינונית תפוקה של בדיקת תרופות אנטי-סרטניים פוטנציאליות in vivo.

Assay CAM כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד אנגיוגנזה ^4. כמו כן פיתח בהצלחה למודל xenograft גידול של סרטן, כולל גליובלסטומה ^5, סרטן לבלב ^6, מלנומה ^7-9, ואוסטאוסרקומה ^10-11. שני באובו ¹² ולשעבר אובו¹³ טכניקות כבר נוצלו בספרות, עם פרטים שונים מפרוטוקול לפרוטוקול. אחד אתגרים עיקריים למודל xenograft CAM הוא יחסית השכיחות הגבוהה של מוות עוברי לאחר המניפולציה של הביצה, עם שיעורי תמותה שפורסמו עובר אפרוח החל 25-50 אחוזים ^11-14.

במאמר זה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל באוב xenograft של HCC שמייצר באופן מהימן צמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם שהיסטולוגית דומה HCC מובחן. יש לנו מותאם פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Ossowski et al. ¹⁴ והשיגו שיעורי הישרדות חומוס עוברי של עד 93% בקליטתם גידול גבוה מאוד.

Protocol

דגירה 1. ביצה

1. להשיג ביצי 8 יום ישנים ספציפיות הפתוגן ללא embryonated.
2. מניחים את הביצים במגש מסתובב ביצה, קצות חותמת יפנו כלפי מעלה, ומניח את המגש מסתובב בתוך חממת ביצה. דגירה ביצים במשך 48 שעות ב 36 מעלות צלזיוס ולחות של 50%.

2. הפלת CAM ופתיחת הביצים

1. לאסוף ביצים מחממה. ביצי מקום במדף ביצה, חותמת הצד, ולהביא לזרימה למינרית.
2. כבה את האורות בחדר ומכסה מנוע.
3. החזק את הקצה חותם של ביצה קלה לקנדלר הביצה כדי לחשוף את כלי הדם של CAM, כמו גם את שק האוויר.
   הערה: קנדלר הביצה הוא מקור אור המציג את העובר המתפתח וצק האוויר קשור וכלי הדם.
4. מציב סימן עיפרון בין שני כלי דם גדולים.
5. להדליק את האורות ולהשתמש סיכה לדחוף סטרילי לעשות חור אחד בקצה הביצה מעל (סוף החותמת) שק האוויר וחור אחד בPEסימן ncil. לא לדחוף הסיכה לדחוף לאורך כל הדרך; חור בסביבות 3 מ"מ עמוק בדרך כלל יספיק.
6. לכבות את האורות. לסחוט הנורה בטיחות, לחיצה על הקצה הפתוח בתקיפות נגד החור מעל שק האוויר. החל יניקה לשאוף אוויר אל תוך החור בסימן העיפרון, גורם CAM לרדת מהפגז בסימן העיפרון.
7. בדוק שצק האוויר עבר מהקצה החותמת של הביצה לחור מסומן העיפרון באמצעות קנדלר. אם לא, השתמש בסיכת הדחיפה לעשות שני החורים מעט עמוקים יותר ולאחר מכן להירשם מחדש באמצעות שאיבת הנורה הבטיחות.
8. הדלק את האור. מחזיק את הביצה ביד אחת, להפעיל את הכלי הסיבובי DREMEL עם חתך גלגל 15/16 אינץ 'המצורף ולעשות שני חתכים רוחביים רק עמוק מספיק כדי לחתוך דרך הקליפה אבל לא עמוק מספיק כדי לחתוך את כל הדרך עד לדיכאון CAM. להפוך את החתכים סביב 2 סנטימטר באורך 1 סנטימטר ומלבד אחד את השני. הפוך את הקיצוצים רחבים מספיק כך שטבעת סיליקון 1 סנטימטר קוטר יכול לעבור דרךאבל רזה יותר רוחב הסרט דביק לסטנדרטי.
9. בשלב הבא, לעשות חתך אורכי 1 בין ובקצוות של שני חתכים רוחביים בקלילות הנגיעה הגלגל החתוך לקליפה.
10. Slide מלקחיים סטריליות תחת חתיכת קליפה ובמקביל לקליפה. תפוס את חתיכת הקליפה עם המלקחיים ולהסיר את כל החתיכה נקיה.
11. מניחים נייר דבק מעל החלון החדש שנפתח, והקפד לקפל קצה אחד מעל בעצמו על מנת להקל על ההסרה.
12. ביצי מקום בחזרה בחממה במגש הביצה (לא במדפי הביצה מסתובבים) עד הזמן של חיסון.

3. הרכבת חיסון

1. שמור תערובת חלבוני קרום במרתף, כגון Matrigel, על קרח (כדי למנוע פילמור) ומקום במכסת מנוע.
2. השתמש 2 מ"מ EDTA לנתק תאים (4 - 5 מיליליטר לכל בקבוק T75) וצלוחיות מקום בתרבית רקמת חממה במשך 5 דקות.
3. Resuspend התאים המנותק בתקשורת ולספור באמצעות hemocytometer וtrypan כחול. השתמש בין 500,000 to 2,000,000 תאים להשתלה על CAM, בהתאם לקו תא. לייעל את המספר הנכון בניסויים ראשוניים.
4. מדד הנדרש למספר תא המתאים וצנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות נפח.
5. בטל supernatant ואז resuspend תא גלולה ב 40 μ l של PBS ++ ו- 20 μ l של תערובת קרום במרתף.
   הערה: בשלב זה, ניתן לטפל בתאים עם סמים או סוכני מבחן אחרים כנדרש לניסויים על ידי resuspending להשעית תערובת קרום תא / מרתף. לחלופין, ניתן pipetted סוכנים על ההשעיה תערובת קרום תא / מרתף לאחר השתלה.
6. אחזר מדף ביצה עם ביצים מן החממה והמקום בזרימה למינרית.
7. קלטת לקלף את החלון, לשלוף טבעת סיליקון 1 מ"מ מהכובע של בקבוקון קריוגני באמצעות מלקחיים מעוקרים, ושחרר את הטבעת דרך החלון.
8. mixtur Pipet פתרון תא l 60 μ של PBS ++ וקרום במרתףדואר ישירות למרכז זירת סיליקון נח על CAM.
9. Re-קלטת החלון ולעבור מדף ביצה חזרה לחממה. בשלב זה, בזהירות בעת הזזת הביצים כטבעת והשעית התא יכול בקלות להיות שנעקר.
10. לאפשר גידולים לגדול במשך 5 עד 7 ימים.

4. גידולי קציר

1. מניחים מתחת לכרית במכסת מנוע. הכן 35 x 10 מ"מ צלחות ומכולות paraformaldehyde לפי צורך להיסטולוגיה. שים 1 מיליליטר PBS ++ בכל צלחת 35 מ"מ x 10.
2. מניחים שקית Biohazard במכסת מנוע. קח מספריים לנתיחה סטרילית והכנס את הקצה המחודד לביצה בחור קרוב לסוף החותמת.
3. חותך סביב כל הביצה longitudinally.
   הערה: CAM והגידול עם הטבעת צריך לדבוק במחצית העליונה של הקליפה עם החלון.
4. בעזרת מספריים לנתיחה ומלקחיים, לנתח את הגידול מCAM ולמקם את הגידול בצלחת 35 מ"מ x 10. למדוד ולשקול גידולים. גידולים קבועים בparaformaldehyדה ולאחר מכן פרפין-להטביע אותם לשימוש בניסויי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.

5. (אופציונאלי): דיסוציאציה תאים סרטניים

1. השתמש במספריים לנתיחה כדי לרכך את הגידול בצלחת 35 מ"מ x 10. יוצקים גידול טחון לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות ולהסיר כמה שיותר PBS ++ ככל האפשר באמצעות pipetting.
2. הוסף 2 מיליליטר של collagenase (1 מ"ג / מיליליטר PBS ++), להפוך את הצינור על פני כמה פעמים, ודגירת צינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות (עד כמה שעות).
3. הוסף 5 מיליליטר תקשורת על צינור אחד וresuspend ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 - 40X. pipetting היסודי הוא קריטי לתא דיסוציאציה מלאה.
4. לאפשר משקעים להתיישב, ולהעביר את supernatant לצינור טרי. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. הסר supernatant, משאיר מאחורי תא גלולה ניתק.
   הערה: בשלב זה, כדורי תא יכולים לשמש לניסויים שונים (cytometry זרימה, תמוגה לשימוש בסופג מערבי, בידוד RNA, וכו '). ניתן להשיג ספירת תאי גידול כוללת באמצעות hemocytometer וצביעת trypan כחולה. שימו לב שתאים קטנים יותר, סגלגלים הם תאי עוף מCAM ולא צריך להיחשב כתאים סרטניים. לא צריך להיות מספר מינימאלי של זיהום תאים שאינם סרטניים (CAM) אם הגידול הוא גזור מCAM בזהירות.

תוצאות

תמונות נציג של שלבים עיקריים בפרוטוקול מוצגות כאן. איור 1 א מדגים את השימוש של קנדלר לדמיין את העובר המתפתח, שק האוויר, וכלי הדם של CAM. איור 1-1C להראות את התהליך של נשירת CAM על ידי ביצוע שני חורים ולאחר מכן הפעלת לחץ שלילי באמצעות הנורה הבטיחות, ו1D א?...

Discussion

כמה שלבים עיקריים בפרוטוקול זה סביר ביותר להסביר את ההישרדות העוברית המשופרת, כמו גם אמינות מוגברת של צמיחת גידול. הפלת CAM מהפגז על ידי יישום יניקה לצק האוויר היא פחות פולשני יותר משיטות קיימות אחרות (באמצעות מחט כדי להסיר אלבומין מהביצה, לנתיחה בוטה, וכו '). באמצעות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium incubated eggs	Charles River	N/A	http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx
Egg incubators	GQF	Hova-Bator 2362N
Rotating egg trays	GQF	1611 Automatic Egg Turner
Egg candler	Lyon	Hi-Power 950-070
Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel	Dremel	100-N/7
Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape
Matrigel	BD Biosciences	356234
Cryogenic vials, external thread with silicone washer	Corning	430659
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C9891