מעבדה מבדק-האכלת דגים לבחינת פעילות Antipredatory של משני מטבוליטים מהרקמות של אורגניזמים ימיים

Summary

המבדק זה מעסיק דגים טורפים מודל כדי להעריך את הנוכחות של מטבוליטים האכלה-הרתעה מתמציות אורגניות של הרקמות של יצורים ימיים בריכוזים טבעיים באמצעות מטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית.

Abstract

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Introduction

אקולוגיה כימית שפותחה באמצעות שיתוף הפעולה של כימאים ואקולוגים. בעוד subdiscipline אקולוגיה כימית יבשתית בסביבה כבר זמן מה, זה של אקולוגיה כימית הימית הוא רק בן כמה עשרות שנים, אך סיפק תובנות חשובות מבנה האקולוגיה והקהילה האבולוציונית של יצורים ימיים ^1-8. מנצל את הטכנולוגיות המתהוות של צלילה וספקטרוסקופיה NMR, כימאים אורגניים במהירות שנוצרו מספר רב של פרסומים המתארים רומן מטבוליטים מחוליות ימיות של קרקעית ים ואצות בשנתי ה -1970 ו -1980 ^9. בהנחה שמטבוליטים משניים צריכים לשרת כמה מטרות, שרבים מהפרסומים אלה מיוחסים מבחינה אקולוגית תכונות חשובות לתרכובות חדשות ללא ראיות אמפיריות. בערך באותו הזמן, אקולוגים היו גם מנצלים את כניסתו של צלילה ומתארים את ההפצות ושכיחותם של בעלי חיים וצמחים של קרקעית ים הידוע בעבר הלוך ושובמ 'שיטות דגימה יחסית לא יעילות כמו חפירה. ההנחה של חוקרים אלה הייתה שכל דבר הנייח ורך-גוף חייב להיות מוגן כימי כדי למנוע הצריכה על ידי טורפים ^10. במאמץ להציג את האמפיריציזם למה שהייתה עבודה אחרת תיאורים על שכיחות מינים, כמה אקולוגים החלו אקסטרפולציה הגנות כימיות ממבחני רעילות ^11. רוב מבחני הרעילות מעורבים החשיפה של דג שלם או אורגניזמים אחרים להשעיות מימיות של תמציות אורגניות גולמיים של רקמות חסרי חוליות, בנחישות הבאה של ריכוזי מסה היבש של תמציות אחראים להריגת מחצית אורגניזמים assay. עם זאת, מבחני רעילות לא לחקות את האופן שבו תופסים את טרף טורפים פוטנציאליים בתנאים טבעיים, ומחקרים עוקבים לא מצאו קשר בין רעילות ואת הטעם ^12-13. אין זה מפתיע כי פרסומים בכתבי עת יוקרתיות השתמשו בטכניקות שיש ecologica קטן או לארלוונטי l ^14-15 והיום שמחקרים אלה עדיין מצוטטים בהרחבה. זה אפילו יותר מדאיג לציין כי מחקרים המבוססים על נתונים רעילות יוסיפו להתפרסם ^16-18. שיטת המבדק המתוארת כאן פותחה בשלהי 1980 על מנת לספק גישה רלוונטית מבחינה אקולוגית לאקולוגים כימיים ימיים להעריך הגנות כימיות antipredatory. השיטה דורשת טורף מודל לדגום תמצית אורגנית גולמי מאורגניזם היעד בריכוז טבעי במטריצת מזון דומה מבחינה תזונתית, המספקת נתונים את הטעם, כי הם יותר מבחינה אקולוגית משמעותית מנתוני רעילות.

הגישה הכללית להערכת פעילות antipredatory של הרקמות של יצורים ימיים כוללת ארבעה קריטריונים חשובים: (1) טורף generalist מתאים יש להשתמש במבחני האכלה, (2) מטבוליטים אורגניים של כל הקטבים חייבים להיות מופקים באופן ממצה מהרקמות של יעד האורגניזם, (3) מטבוליטים חייבים bהדואר מעורב לתוך מזון ניסוי מתאים מבחינה תזונתית באותו הריכוז הנפח כפי שנמצא באורגניזם שממנו הם מופקים, ו- (4) עיצוב הניסיון והגישה סטטיסטית חייבים לספק משמעותי מטרי כדי לציין distastefulness היחסי.

ההליך המתואר להלן תוכנן במיוחד כדי להעריך את ההגנות כימיות antipredatory בחסר חוליות ימיות באיים הקריביים. אנו מעסיקים wrasse bluehead, bifasciatum Thalassoma, כדגים טורפים מודל כי מין זה הוא נפוץ על שוניות אלמוגי האיים הקאריביים, והוא ידוע לדגום מגוון רחב של חסרי חוליות של קרקעית ים ^19. רקמה מאורגניזם היעד מופק ראשונה, ולאחר מכן בשילוב עם תערובת מזון, ולבסוף הציעה לקבוצות של ט ' bifasciatum להתבונן אם הם דוחים את המזונות שטופל בתמצית. נתוני assay שימוש בשיטה זו סיפקו תובנות חשובות הכימיה ההגנתית של יצורים ימיים ^12,20-21, lהיסטורית ife פשרות ^22-24, ואקולוגיה קהילת ^25-26.

Protocol

הערה: שלב 3 של פרוטוקול זה כרוך נושאי בעלי חיים בעלי חוליות. ההליך תוכנן כך שבעלים חיים מקבלים הטיפול ההומני ביותר אפשריות ואושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה ווילמינגטון.

1) הפקת רקמות

1. השתמש ברקמות שנמצאות במצב הטבעי של לחות ולא לחץ, מיובש או מדי רטובה כמו זה יהיה לשנות את ריכוז הנפח של מטבוליטים משתיים. לחתוך או לקצוץ רקמה לחתיכות או פרוסות שיכולות להיות מוכנסת לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. הערה: רקמה טרי ניתן להשתמש בחלק ממקרים, אבל זה לעתים קרובות יותר כדי לחתוך או לקצוץ רקמה קפוא, שאינה כפוף לסחיטה כאשר חתך.
2. להוסיף חתיכות רקמה 30 מיליליטר של 1: 1 תערובת של dichloromethane (DCM) ומתנול (MeOH) בצינור צנטריפוגות סיים עד נפח סופי של 40 מיליליטר הוא הגיע. הקפד לבצע את כל השלבים כרוכים בהעברהממס במנדף עם אוורור מתאים.
3. שווי הצינור ולהפוך אותו כמה פעמים, ואז להתסיס שוב ושוב במהלך תקופת חילוץ 4 שעות. הערה: בתקופה זו, מים משלבים עם MeOH וMeOH וכתוצאה מכך: שלב מים מפריד בין שלב DCM. הרקמה חשופה לסירוגין לDCM וMeOH: מים כתחליב כצינורות נסערים.
4. העבר את תמצית DCM לבקבוק מסביב לתחתית ולהתאדות עד יובש על מאייד סיבובי באמצעות חום נמוך (<40 ° C). שימוש בממס מינימאלי, להעביר את התמצית יבשה לבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר. התאם את הבקבוקון עם מתאם מאייד סיבובי ושוב להתאדות ליובש במאייד סיבובי באמצעות חום נמוך (<40 ° C).
   הערה: השלב הבא מחייב שימוש במכשיר דחיסת תוצרת בית שעשוי להיות מורכב על ידי הברגה את הפריטים הבאים לפי סדר על סוף המוט מושחל: (1) אגוז, (2) ומכונת כביסה, ו- (3) אגוז בלוט. או מכונת הכביסה חייבת להיות או מחוררתמצויד כך שזה פחות מהקוטר הפנימי של צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר.
5. חוזר לצינור צנטריפוגות סיים המכיל רקמות וMeOH: תמצית המים, לסחוט את מדיום החילוץ מתוך הרקמה באמצעות דחיסה. העבר את MeOH: תמצית מים לאותו בקבוק עגול התחתון ולאחסן מצונן (<10 ° C).
6. להוסיף MeOH לצינור צנטריפוגות סיים עד הרקמה עכשיו מיובשת היא שקועה לחילוץ שני של 2-6 משך שעה, ולאחר מכן להעביר MeOH החדשה לחלץ לבקבוק מסביב לתחתית המצונן המכיל MeOH: תמצית המים. אם יש חשש שהרקמה לא חולצו באופן מלא, לחזור על 2-6 שעות חילוץ MeOH.
7. להתנגב MeOH על מאייד סיבובי באמצעות חום נמוך (<40 ° C). העבר את התמצית המימית שנותרה מהבקבוק העגול תחתונה לבקבוקון הנצנץ המכיל את התמצית הפולרית המיובש, באמצעות נפח מינימאלי של MeOH לשטוף את הבקבוק העגול התחתון.
8. Evaporate התמצית המימית ליובש באמצעות חום נמוך (<40 ° C) על רכז ואקום. בקבוקון הנצנץ עכשיו מכיל תמצית הכוללת היבשה אורגנית הגולמי של 10 מיליליטר של רקמה. לפנות את שטח הראש של הבקבוקון עם N ₂ גז כדי למנוע חמצון, לאטום היטב, וחנות קפוא (-20 ° C).

2) הכנת מזון

1. הכן אבקת מעטפת דיונון המיובש בהקפאה.
   הערה: מעטפת קלמארי מספקת מקור של תזונה שהוא דומה לזה של חסרי חוליות אחרות של קרקעית ים, וישמש כמרכיב בsubsteps של 2.2.
   1. טבעות קפוא הפשרה של מעטפת דיונון במים ללא יונים חמים (DI), ואז רסק אותם בבלנדר במהירות גבוהה.
   2. שפכו שכבה דקה של מעטפת דיונון מחיה על נייר אפייה רדודה והקפאה (-20 ° C), ואז לשבור את גיליון של פירה דיונון הקפוא לחתיכות קטנות כדי להיות lyophilized.
   3. Lyophilize פירה מעטפת דיונון הקפוא הבאים נהלי ההפעלה של freeze-יבש.
   4. לכתוש את חתיכות lyophilized של פירה מעטפת דיונון בבלנדר במהירות גבוהה כדי ליצור אבקה.
   5. , במנדף לשפוך מעטפת דיונון האבקה לתוך נפת קמח סיבובית ולנפות להפריד נתחים גדולים של רקמה מהאבקה דקה.
   6. העבר את מעטפת דיונון אבקת הקנס למכל סגר. לפנות את שטח ראש המכל עם N ₂ גז כדי למנוע חמצון ולאחסן קפוא (-20 ° C).
2. מכין את תערובת מזון.
   הערה: בעת הפעלת מבחני רצופים מרובים, זה מעשי להכין ~ של תערובת מזון 100 מיליליטר, אולם המתכון הזה יכול להיות מדורגים לכמויות קטנות יותר במידת צורך.
   1. לשלב תערובת של חומצת alginic 3 g ואבקת 5 גרם מיובשת הקפאת דיונון מעטפת עם המים DI 100 מיליליטר בכוס 150 מיליליטר. מערבבים נמרצות עם microspatula במשך כמה דקות עד שהאבקה היא התייבשות באופן מלא וקבלת התערובת הומוגנית.
      הערה: אם תרצה, צבעי מאכל ניתן להוסיף בst זהep: קל יותר להוסיף צבע לתערובת המזון שתפיק שני תערובות השליטה טופלו ו( מיסוך פיגמנט הטבעי של התמצית בתערובת שטופלה תמצית) ולא מנסה להתאים את הצבע של התערובת שטופלה על ידי הוספת התמצית לצבוע לתערובת השליטה. צבע מזון ירקרק או חום הוא לעתים קרובות רצוי כדי להסוות כל פיגמנטים בתמצית הגולמי.
   2. לטעון מיליליטר בדיוק 10 של תערובת מזון למזרק סיים. תשמור על עצמך, כדי למנוע את הכללתו של בועות אוויר בתהליך זה.
   3. הסר את בקבוקון נצנץ 20 מיליליטר עם תמצית אורגנית גולמי יבשה מהמקפיא. הוסף טיפה או שתיים של MeOH, מוסיף התמצית לתוך תערובת הומוגנית עם microspatula.
   4. הוצא את מזרק 10 מיליליטר הטעון של מטריצת מזון לבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר ומערבבים עם microspatula לhomogenize תערובת מזון שטופל תמצית.
      הערה: זה עשוי לעזור כדי להוציא את המזרק במרווחים קטנים יותר (כלומר, להוציא 2 מיליליטר וhomogenize, אז r.EPEAT עד שכל 10 מיליליטר כבר הומוגני).
3. הכן את כדורי assay.
   1. לטעון נפח קטן מאוד של תערובת התמצית (~ 1 מיליליטר) לתוך מזרק, ולהטביע את קצה המזרק בתמיסה של 0.25 M CaCl _2. הוצא את תכולת המזרק כדי ליצור גדיל ארוך, כמו ספגטי.
   2. אחרי כמה דקות, להסיר את הגדיל הקשוח, לקצוץ אותו לכדורים ארוכים 4 מ"מ בחיתוך זכוכית לוח עם סכין גילוח, ולאחר מכן לשטוף במי ים.
   3. חזור על שלבים 2.3.1 ו2.3.2 ללא כולל תמצית רקמה לעשות כדורי שליטה. הקפד לטפל כדורי שליטה עם נפח שווה של ממס (ראה תוספת של MeOH לתערובת טופלה בשלב 2.2.3) כדי לשלוט על בנוסף ממס. אם ביקורת שלילית היא רצויה כדי לאשר שדגי assay יכולים להירתע מהאכלה, להוסיף בנזואט denatonium בריכוז של 2 מ"ג מיליליטר ^-1 לתערובת המזון הגולמית ^27.

3) את הטעםBioassays

1. לבצע מבחני האכלה עם wrasse הניצוד צהוב-שלב bluehead, bifasciatum Thalassoma, המשיך בקבוצות של שלושה בתאים אטומים-צדדיים של אקווריום מעבדה.
2. לספק כדורי מזון מכוס של מי ים בעזרת פיפטה זכוכית עם הנורה גומי. הערה: זה עלול לקחת כמה ימים כדי להכשיר דגים לקבל מזון בצורה זו. גירוי אוויר (למשל כמה דפיקות של פיפטה על זכוכית האקווריום) שמקדים את המסירה של מזון עשוי להיות מועיל להכשיר את הדג לצפות תוספת של כדורי מזון.
3. ניקוד כדורים. לשקול גלולה מקובלת אם נצרך בקלות על ידי הדגים. לשקול גלולה דחתה אם לא אכל לאחר מינימום של שלושה ניסיונות של דג אחד או יותר כדי לקחת אותו לחלל הפה שלהם, או אם גלולה הוא התקרב והתעלמה אחרי ניסיון אחד כזה.
4. דגימות ניקוד. הערה: הליך assay מתואר כתרשים זרימה באיור 1 קבוצות של דגים שמסרבים לאכול.כדורי שליטה בשלב כלשהו בפרוטוקול אינם נחשבים נוסף. ישנן שתי תוצאות אפשריות של ריצה אחת של assay: המדגם או האם לאשר או לדחות.
   1. תתחיל עם גלולה שליטה כדי לוודא שהקבוצה של דגים היא שיתופית. להציע גלולה שטופלה. אם הדגים קיבלו את הכדור טופל, להבקיע המדגם כמקובל. אם הדגים לדחות את גלולה טופלה, להציע גלולה שליטה שלאחר מכן כדי לקבוע אם הדגים הפסיקו האכלה. אם הדגים קיבלו את כדור שליטה שלאחר מכן, להבקיע המדגם נדחה.
5. שכפול. חזור על הליך assay עם עשר קבוצות עצמאיות של דגים לכל תמצית.

4) משמעות הערכה

1. להעריך את החשיבות של הבדלים בצריכה של שליטה לעומת כדורים שטופלו בגרסה שונה של המבחן המדויק של פישר ^26. שנה את הבדיקה כדי שהסיכומים השוליים לשליטה וכדורים טופלו קבועים, טיפול בשניהם דגימות אקראיות. הערה: זה מספק p = 0.057, כאשר 7 כדורים נאכלים; לכן, כל תמצית נחשבת הרתעה אם 6 או פחות כדורים נאכלים, וטעים אם 7 או יותר כדורים נאכלים.
2. כדי להשוות את הטעם היחסי בקרב קבוצות של תמציות, לחשב מספר ממוצע של כדורים אכלו בתוך כל קבוצה. שמור את הסף בשעה 6 כדורים כל כך קבוצה של תמציות לשכפל נחשבות הרתעה אם המספר הממוצע של כדורים אכל + שגיאה סטנדרטית (SE) ≤6. הערה: תמציות בתוצאות הנציג, משימת הקבוצה היא מינים, כך לשכפל מגיעות מאנשים שונים ואת הטעם ביחס ניתן להשוות בין מינים.

תוצאות

כאן אנו מדווחים תוצאות המבדק זה במשך שישה מינים של ספוגים הקריביים נפוצים (איור 2). נתונים אלה בתחילה פורסמו בשנת 1995 על ידי Pawlik et al. ¹² ולהפגין את כוחה של גישה זו לסקור את ההבדלים באסטרטגיות הגנה כימיות בין מיני שיתוף המתרחש. תוצאות דווחו כמספר ממוצע ?...

Discussion

ההליך המתואר במסמך זה מספק פרוטוקול פשוט יחסית, רלוונטי מבחינה אקולוגית מעבדה להערכת הגנות כימיות antipredatory ביצורים ימיים. כאן אנו סוקרים את הקריטריונים החשובים שמרוצים מקבוצה זו של שיטות:

(1) הטורף מתאים. Assay זה ההאכלה מעסיק wras...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dichloromethane	Fisher Scientific	D37-20
Methanol	Fisher Scientific	A41220
Anhydrous Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid	Fisher Scientific	20-548-146	For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity	MP Biomedicals	154723
Squid mantle rings	N/A	N/A	Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate	Aldrich	D5765
50 ml graduated centrifuge tube	Fisher Scientific	14-432-22
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-7
Disposable Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets	Fisher Scientific	03-448-24
Red bulbs for pellet delivery	Fisher Scientific	03-448-27
250 ml round-bottom flask	Fisher Scientific	10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap	Fisher Scientific	K747130-1324
Weightboats	Fisher Scientific	02-202B
Microspatula	Fisher Scientific	21-401-10
5 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-53
10 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-54
Razor blade	Fisher Scientific	S17302