Un poisson-alimentation Laboratoire d'essais biologiques pour évaluer l'activité antiprédatrices des métabolites secondaires dans les tissus d'organismes marins

Résumé

Ce bio-essai emploie un poisson prédateur de modèle pour évaluer la présence de métabolites alimentation-dissuasion à partir d'extraits organiques des tissus d'organismes marins à des concentrations naturelles en utilisant une matrice d'aliments comparable nutritionnel.

Résumé

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Introduction

l'écologie chimique développé grâce à la collaboration de chimistes et écologistes. Alors que le sous-discipline de l'écologie terrestre chimique a été autour depuis un certain temps, celle de l'écologie marine chimique est âgé de seulement quelques décennies, mais a fourni des informations importantes sur la structure des organismes marins ^1-8 l'écologie et de la communauté de l'évolution. Profitant des technologies émergentes de plongée sous-marine et la spectroscopie RMN, chimistes organiques générés rapidement un grand nombre de publications décrivant de nouveaux métabolites invertébrés et les algues marines benthiques dans les années 1970 et 1980 ^9. En supposant que les métabolites secondaires doivent servir à quelque chose, beaucoup de ces publications attribuées propriétés écologiquement importantes à de nouveaux composés, sans preuves empiriques. À peu près au même moment, les écologistes ont également été profitent de l'avènement de la plongée sous-marine et en décrivant les distributions et l'abondance d'animaux et de plantes benthiques déjà connus from méthodes d'échantillonnage relativement inefficaces comme le dragage. L'hypothèse de ces chercheurs était que tout sessiles et corps mou doivent être défendus chimiquement pour éviter la consommation par les prédateurs ^10. Dans un effort pour introduire l'empirisme à ce qui était contraire travail descriptif sur l'abondance des espèces, certains écologistes ont commencé à extrapoler défenses chimiques à partir de tests de toxicité ^11. La plupart des tests de toxicité en cause l'exposition des poissons entiers ou autres organismes à des suspensions aqueuses d'extraits organiques bruts de tissus d'invertébrés, avec la détermination ultérieure des concentrations d'extraits secs de masse responsables de la mort de la moitié des organismes d'essai. Cependant, des essais de toxicité ne imitent la manière dont les prédateurs potentiels perçoivent proies dans des conditions naturelles, et des études ultérieures ne ont trouvé aucune relation entre la toxicité et la palatabilité ^12-13. Il est surprenant que les publications dans des revues prestigieuses ont utilisé des techniques ayant peu ou pas ecological pertinence ^14-15 et que ces études sont toujours largement cités aujourd'hui. Il est encore plus alarmant de constater que les études basées sur des données de toxicité continuent d'être publiés ^16-18. La méthode d'analyse biologique décrit ici a été développé à la fin des années 1980 pour fournir une approche écologiquement pertinentes pour les écologistes chimiques marines pour évaluer défenses chimiques antiprédatrices. La méthode nécessite un prédateur de modèle pour déguster un extrait organique brut de l'organisme cible à une concentration naturelle dans une matrice alimentaire comparables sur le plan nutritionnel, fournissant des données d'appétence qui sont écologiquement plus significative que les données de toxicité.

L'approche générale pour évaluer l'activité antiprédatrices des tissus d'organismes marins comprend quatre critères importants: (1) un prédateur généraliste approprié doit être utilisé dans des essais d'alimentation, (2) métabolites organiques de toutes les polarités doivent être exhaustive extraites du tissu de la cibler organisme, (3) les métabolites doivent be mélangé dans un aliment nutritionnellement expérimental approprié à la même concentration volumétrique que l'on trouve dans l'organisme à partir duquel ils ont été extraits, et (4) la conception expérimentale et approche statistique doivent fournir un paramètre significatif pour indiquer distastefulness relative.

La procédure décrite ci-dessous est conçu spécifiquement pour évaluer défenses chimiques antiprédatrices chez les invertébrés marins des Caraïbes. Nous employons le labre bluehead, Thalassoma bifasciatum, comme un poisson prédateur modèle, car cette espèce est commune sur les récifs coralliens des Caraïbes et est connu pour déguster un large assortiment des invertébrés benthiques ^19. Le tissu de l'organisme cible est d'abord extrait, puis combiné avec un mélange de nourriture, et enfin offert à des groupes de T. bifasciatum d'observer se ils rejettent les aliments extrait traité. Données test en utilisant cette méthode ont fourni des renseignements importants sur la chimie de défense des organismes marins ^12,20-21, ll'histoire de l'IFE compromis ^{22-24, 25-26} et l'écologie des communautés.

Protocole

REMARQUE: L'étape 3 de ce protocole implique des sujets sur des animaux vertébrés. La procédure a été conçu afin que les animaux bénéficient d'un traitement le plus humain possible et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Caroline du Nord Wilmington.

1) Extraction de tissus

1. Utilisez tissu qui est dans son état naturel d'hydratation et pas pressé, desséché ou trop humide que ceci modifie la concentration volumétrique de métabolites secondaires. Couper ou couper le tissu en morceaux ou en tranches qui peuvent être insérés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Remarque: tissu frais peut être utilisé dans certains cas, mais il est souvent préférable de couper ou hacher tissu congelé, qui ne est pas soumis à presser quand on les coupe.
2. Ajouter les morceaux de tissu de 30 ml d'un mélange 1: 1 de dichlorométhane (DCM) et du methanol (MeOH) dans un tube à centrifuger gradué jusqu'à un volume final de 40 ml est atteinte. Assurez-vous de procéder à toutes les étapes impliquant le transfert desolvant dans une hotte avec une ventilation adéquate.
3. Boucher le tube et inverser plusieurs fois, puis agiter à plusieurs reprises pendant une période d'extraction de 4 heures. Remarque: Au cours de cette période, l'eau se combine avec le MeOH et le MeOH en résulte: la phase aqueuse se sépare de la phase DCM. Le tissu est exposé alternativement à DCM et du MeOH: eau, une émulsion telle que les tubes sont agités.
4. Transférer l'extrait DCM à un ballon à fond rond et évaporer à sec sur un évaporateur rotatif, à feu doux (<40 ° C). Utilisation minimale de solvant, transférer l'extrait séché à une 20 ml flacon à scintillation. Monter le flacon avec un adaptateur évaporateur rotatif et à nouveau évaporer à sec sur un évaporateur rotatif, à feu doux (<40 ° C).
   Note: La prochaine étape nécessite l'utilisation d'un instrument de compression maison qui peut être assemblé par vissage les éléments suivants dans l'ordre séquentiel sur l'extrémité d'une tige filetée: (1) écrou, (2) la rondelle, et (3) écrou borgne. La rondelle doit soit être perforé oumonté de sorte qu'il soit inférieur au diamètre interne d'un tube de centrifugation de 50 ml.
5. En revenant au tube à centrifuger gradué qui contient le tissu et le MeOH: extrait de l'eau, presser le milieu d'extraction hors du tissu lors de la compression. Transférer le MeOH: extrait de l'eau à la même ballon à fond rond et stocker refroidie (<10 ° C).
6. Ajouter MeOH dans le tube à centrifuger gradué jusqu'à ce que le tissu est immergé maintenant déshydraté pour une seconde extraction de durée de 2 à 6 h, puis transférer le nouveau MeOH extrait dans le ballon à fond rond contenant le réfrigérées MeOH: extrait de l'eau. Se il ya une inquiétude que le tissu n'a pas été complètement extraite, répéter l'extraction de MeOH 2-6 h.
7. Séchez le MeOH sur un évaporateur rotatif, à feu doux (<40 ° C). Transférer l'extrait aqueux restant dans le ballon à fond rond dans le flacon de scintillation contenant l'extrait séché non polaire, en utilisant un volume minimal de MeOH pour rincer le ballon à fond rond.
8. Evaporate l'extrait aqueux à sec utilisant la chaleur faible (<40 ° C) sur un concentrateur sous vide. Le flacon de scintillation contient maintenant l'extrait sec organique brut total de 10 ml de tissu. Évacuer l'espace du flacon avec du gaz N ₂ pour éviter l'oxydation de la tête, fermer hermétiquement et congelez (-20 ° C).

2) Préparation des aliments

1. Préparer calmars poudre de manteau lyophilisée.
   Remarque: manteau de calmar est une source d'alimentation qui est comparable à celle d'autres invertébrés benthiques, et sera utilisé comme ingrédient dans les sous-étapes de 2,2.
   1. Anneaux Décongeler du manteau calmars dans déminéralisée chaude (DI) de l'eau, puis les réduire en purée au mélangeur à haute vitesse.
   2. Versez une fine couche de purée calmars manteau sur une plaque à biscuits peu profonde et le gel (-20 ° C), puis casser la feuille de purée calmars congelés en petits morceaux pour être lyophilisée.
   3. Lyophiliser le manteau calmars congelés purée en suivant les procédures de fonctionnement de la freeze-cheveux.
   4. Pulvériser les pièces lyophilisés de calmars manteau purée dans un mélangeur à haute vitesse pour former une poudre.
   5. Dans une hotte, versez le manteau de calmar en poudre dans une farine tamis rotatif et tamiser pour séparer de grands morceaux de tissu de la poudre fine.
   6. Transférer le manteau calmars fine poudre dans un récipient hermétique. Évacuer l'espace de tête de récipient avec du gaz N ₂ pour éviter l'oxydation et les conserver congelés (-20 ° C).
2. Préparer le mélange de nourriture.
   Remarque: Lorsque vous exécutez plusieurs essais consécutifs, il est pratique pour préparer ~ 100 ml de mélange de nourriture, cependant cette recette peut être adapté à de plus petits volumes si nécessaire.
   1. Moissonneuse un mélange de 3 g d'acide alginique et 5 g de poudre lyophilisée du manteau calmar avec 100 ml d'eau désionisée dans un bêcher de 150 ml. Remuer vigoureusement avec une microspatule pendant quelques minutes jusqu'à ce que la poudre est entièrement hydraté et le mélange est homogène.
      Remarque: Si vous le souhaitez, colorant alimentaire peut être ajoutée à ce stPE: il est plus facile d'ajouter un colorant au mélange de la nourriture qui va générer les deux mélanges traités et témoins (masquant le pigment naturel de l'extrait dans le mélange de l'extrait traité) plutôt que d'essayer de faire correspondre la couleur du mélange d'extraction traité par addition de colorant au mélange de commande. Un colorant alimentaire verdâtre ou brunâtre est souvent souhaitable pour masquer des pigments dans l'extrait brut.
   2. Chargez exactement 10 ml de mélange de la nourriture dans une seringue graduée. Prenez soin d'éviter l'inclusion de bulles d'air lors de ce processus.
   3. Retirez le flacon à scintillation de 20 ml avec de l'extrait organique brut sec du congélateur. Ajouter une ou deux gouttes de MeOH, puis incorporer l'extrait dans un mélange homogène avec une microspatule.
   4. Éjecter le chargé seringue de 10 ml de la matrice alimentaire dans le flacon à scintillation de 20 ml et remuez avec une microspatule pour homogénéiser le mélange alimentaire extrait traité.
      Remarque: Il peut être utile pour éjecter la seringue par incréments plus petits (ce est à dire, éjecter 2 ml et homogénéiser, alors r.épéter jusqu'à ce que tous les 10 ml ont été homogénéisé).
3. Préparer les granulés de dosage.
   1. Chargez un très petit volume du mélange d'extrait (~ 1 ml) dans une seringue, et plonger la pointe de la seringue dans une solution de 0,25 M CaCl _2. Ejecter le contenu de la seringue pour former un long brin de spaghetti-like.
   2. Après quelques minutes, retirer le brin durci, couper en 4 mm de long pastilles sur une planche à découper en verre avec une lame de rasoir, puis rincer à l'eau de mer.
   3. Répétez les étapes 2.3.1 et 2.3.2 sans inclure extrait de tissu pour fabriquer des pastilles de contrôle. Assurez-vous de traiter les pastilles de contrôle avec un volume équivalent de solvant (voir addition de MeOH au mélange traité à l'étape 2.2.3) pour contrôler les plus solvant. Si un contrôle négatif désire confirmer que les poissons d'essai peut être dissuadée de l'alimentation, le benzoate de dénatonium ajouter à une concentration de 2 mg ml ^-1 au mélange de la nourriture crue ^27.

3) appétenceBioassays

1. Effectuer des essais d'alimentation avec du jaune phase labre bluehead capturés dans la nature, Thalassoma bifasciatum, gardé par groupes de trois dans les compartiments opaque-verso de laboratoire aquariums.
2. Délivrer boulettes de nourriture à partir d'un bêcher d'eau de mer en utilisant une pipette en verre avec une poire en caoutchouc. Remarque: Il peut prendre quelques jours pour former poisson pour recevoir de la nourriture de cette manière. Un stimulus conditionné (par exemple à quelques robinets de la pipette sur la vitre de l'aquarium) qui précède la livraison de nourriture peut être utile de former le poisson de se attendre à l'ajout de boulettes de nourriture.
3. Marquant pellets. Envisager une pastille accepté si facilement consommé par les poissons. Envisager une pastille rejetée si pas mangé après un minimum de trois tentatives par un ou plusieurs poissons à prendre dans leur cavité buccale, ou si le culot est approché et a ignoré après une telle tentative.
4. Échantillons notation. Remarque: La procédure de test est dépeint comme un organigramme de la figure 1 Groupes de poissons qui refusent de manger.pastilles de contrôle à ne importe quelle étape dans le protocole ne sont pas considérées. Il ya deux résultats potentiels d'un seul passage de l'essai: l'échantillon est accepté ou rejeté.
   1. Commencez avec une pastille de contrôle pour confirmer que le groupe de poissons est coopérative. Offrez une pastille traitée. Si les poissons acceptent le culot traité, marquer l'échantillon comme acceptée. Si les poissons rejettent le culot traité, offrir une pastille de contrôle a posteriori afin de déterminer si les poissons ont cessé l'alimentation. Si les poissons acceptent la pastille de contrôle a posteriori, marquer l'échantillon comme rejetée.
5. Replication. Répétez la procédure de test avec dix groupes indépendants de poissons pour chaque extrait.

4) Importance évaluation

1. Évaluer l'importance des différences dans la consommation du contrôle vs granulés traités avec une version modifiée du test exact de Fisher ^26. Modifier le test de sorte que les totaux marginaux pour le contrôle et granulés traités sont fixés, Les traiter deux échantillons aléatoires. Remarque: Cette offre p = 0,057 lorsque sept pastilles sont consommés; donc, tout extrait est considéré comme dissuasif si les six ou moins pellets sont consommés, et agréable au goût si 7 ou plusieurs pastilles sont consommés.
2. Pour comparer l'appétence rapport entre les groupes d'extraits, calculer un nombre moyen de pellets consommés au sein de chaque groupe. Gardez le seuil à 6 pastilles ainsi un groupe d'extraits répétées sont considérées comme dissuasif si le nombre moyen de pellets mangé + erreur standard (SE) ≤6. NOTE: Dans les résultats représentatifs, l'affectation de groupe est l'espèce, de sorte répliquant extraits proviennent d'individus distincts et la palatabilité rapport peuvent être comparés entre les espèces.

Résultats

Nous rapportons ici les résultats de cet essai biologique pour six espèces d'éponges commun des Caraïbes (figure 2). Ces données ont été initialement publiés en 1995 par Pawlik et al. ¹² et démontrent la puissance de cette approche pour étudier les différences dans les stratégies de défense chimiques entre taxons concomitants. Les résultats ont été rapportés comme un nombre moyen de pastilles d'aliments consommés + erreur standard (SE) pour chaque espèce. P...

Discussion

La procédure décrite ici fournit un protocole de laboratoire relativement simple, écologiquement pertinent pour évaluer défenses chimiques antiprédatrices dans les organismes marins. Ici nous passons en revue les critères importants qui sont satisfaits par cet ensemble de méthodes:

(1) prédateur appropriée. Ce test alimentation utilise le labre bluehead, Thalassoma bifasciatum, l'un des poissons les plus abondantes sur les récifs coralliens dans les Caraïbes...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dichloromethane	Fisher Scientific	D37-20
Methanol	Fisher Scientific	A41220
Anhydrous Calcium Chloride	Fisher Scientific	C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid	Fisher Scientific	20-548-146	For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity	MP Biomedicals	154723
Squid mantle rings	N/A	N/A	Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate	Aldrich	D5765
50 ml graduated centrifuge tube	Fisher Scientific	14-432-22
20 ml scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-7
Disposable Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets	Fisher Scientific	03-448-24
Red bulbs for pellet delivery	Fisher Scientific	03-448-27
250 ml round-bottom flask	Fisher Scientific	10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap	Fisher Scientific	K747130-1324
Weightboats	Fisher Scientific	02-202B
Microspatula	Fisher Scientific	21-401-10
5 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-53
10 ml graduated syringe	Fisher Scientific	14-817-54
Razor blade	Fisher Scientific	S17302