צנתור לב בעכברים כדי למדוד את יחסי נפח לחץ: חקירת אפקט Bowditch

Summary

This article describes the measurement of murine left ventricular function via pressure/volume analysis at different heart rates.

Abstract

מודלים של בעלי חיים המחקים הפרעות לב אנושיות נוצרו כדי לבחון אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. מרכיב מפתח להערכת אסטרטגיות אלה הוא לבחון את ההשפעות שלהם על תפקוד לב. ישנן מספר טכניקות למדידה במכניקת vivo לב (למשל, בדיקת אקו, יחסי לחץ / נפח, וכו '). בהשוואה לבדיקת אקו, חדרית בזמן אמת שמאלה (LV) לחץ / ניתוח נפח באמצעות צנתור הוא יותר מדויק ומעמיק בהערכת תפקוד LV. בנוסף, ניתוח LV לחץ / נפח מספק את היכולת להקליט באופן מיידי שינויים במניפולציות של התכווצות (למשל גירוי β-adrenergic,) ועלבונות פתולוגי (למשל, איסכמיה / reperfusion פציעה). בנוסף למקסימום (+ DP / DT) (לדוגמא, לחץ הסיסטולי סוף ומינימום שיעור שינוי לחץ בLV (-dP / DT), הערכה מדויקת של תפקוד LV באמצעות כמה מדדי עומס עצמאיניתן להשיג יחסי נפח ועבודת שבץ recruitable preload). יש קצב לב יש השפעה משמעותית על התכווצות LV כך שעלייה בקצב הלב היא המנגנון העיקרי להגדלת תפוקת לב (כלומר, השפעת Bowditch). כך, כאשר משווים פרמטרים המודינמיים בין קבוצות ניסוי, יש צורך יש לי קצב לב דומה. יתר על כן, סימן היכר של דגמים רבים קרדיומיופתיה היא ירידה במילואי התכווצות (כלומר, ירידה בהשפעת Bowditch). כתוצאה מכך, ניתן לקבל מידע חיוני על ידי קביעת ההשפעות של הגדלת קצב לב על התכווצות. הנתונים שלנו ואחרים הוכיחו שעכבר נוקאאוט synthase תחמוצת חנקן העצבי (NOS1) ירד התכווצות. כאן אנו מתארים את הליך מדידת לחץ LV / נפח עם הגדלת שיעורי לב תוך שימוש במודל עכבר נוקאאוט NOS1.

Introduction

המטרה של הלב היא לשאוב דם בכל הגוף כדי לעמוד בדרישות המטבוליות של האורגניזם. מאז דרישות אלה כל הזמן משתנים (לדוגמא, במהלך פעילות גופנית), הלב חייב להתאים (כלומר, להגדיל את תפוקת לב). הלב פיתח מסלולים רבים כדי להשיג את ההישג הזה. אופן ראש הלב משיג זאת הוא באמצעות עלייה בקצב לב (כלומר, השפעת Bowditch) ^1. כלומר, עם העלייה בקצב לב של אדם, זה גורם לעלייה בהתכווצות ועלייה בתפוקת לב. לפיכך, תפקוד לב הוא מאוד תלוי בקצב לב. למרבה הצער, מחלות לב (למשל, אוטם שריר לב, יתר, וכו ') תוצאות בתפקוד לב ירוד שבלב וכתוצאה מכך לא יהיו מסוגל לעמוד בדרישות חילוף החומרים של הגוף. מחלות לב היא הסיבה העיקרית לתחלואה ותמותה בחברה מערבית. מודלים של בעלי החיים כי לשחזר רב cardiomy אדםopathies משמש לחקור מנגנונים מולקולריים ולבחון טיפולים פוטנציאליים. להבחין מנגנונים אלה ולקבוע אם טיפול יכול להיות בר-קיימא, חוקרים חייבים להעריך את תפקוד לב in vivo.

ישנן מספר דרכים כדי להעריך את תפקוד לב in vivo (למשל, בדיקת אקו, MRI, וכו '), אשר באופן שיגרתי למדוד מקטע פליטה, קיצור חלקי, תפוקת לב, וכו' עם זאת, פרמטרים אלה תלויים במידה רבה על afterload, preload, וקצב לב בנוסף להתכווצות ^2. מדידת התכווצות היא הכרחית כדי להבין את המאפיינים הפנימיים של הלב בסביבה המקורית שלו. מקסימום השיעור _(מקס / DT DP) של פיתוח לחץ מביא צעד אחד קרוב יותר להבנת התכווצותנו. למרבה הצער, DP / DT הוא גם תלוי בתנאי קצב לב וטעינת ^3. לכן טכניקות פותחו כדי למדוד עומס (וקצב לב, לראות below) מדדים עצמאיים של התכווצות שריר לב (כלומר, יחסים הסיסטולי סוף לחץ נפח (ESPVR) ולטעון מראש עבודת שבץ recruitable (PRSW)) ^4-6. ESPVR מתאר את הלחץ המקסימאלי שניתן לפתח על ידי החדר בכל נפח LV נתון. השיפוע של ESPVR מייצג את elastance הסוף-סיסטולי (תצליח להגיע לשם."). PRSW הוא רגרסיה לינארית של עבודת שבץ (אזור המוקף PV הלולאה) עם הסוף-דיאסטולי הנפח. נהלים אלה הם מדידה מדויקת יותר ומדויקת של התכווצות בהשוואה לפרמטרים המודינמית כגון מקטע פליטה, תפוקת לב, ונפח פעימה. ניתן להשיג ESPVR וPRSW באמצעות החסימה הזמנית של נחות הווריד הנבוב (IVC). חסימת IVC ניתן לבצע עם חזה סגור, כדי למנוע את ההשפעה של שינוי בלחץ intrapleural על תפקוד לב.

קצב לב גובר גם משפר התכווצות והרפיה ^1. לפיכך, בעת השוואה בין תפקוד לב Experimentaקבוצות l (למשל, ± DP / DT), קצב לב צריך להיות דומה. עם זאת, קצב לב דומה בדרך כלל אינו מתרחש בכל חיה בשל תנאים שונים (מחלה, התערבות מחקר, וכו '). יש לציין כי הרדמה (בזריקות ושאיפה) מורידה את קצב לב. קצב לב הוא הקובע עיקרי של התכווצות, הרדמה תהיה משמעותית להשפיע התכווצות. מסיבה זו, אנו מתארים ההליך שלנו. בנוסף, סימן היכר של cardiomyopathies רב הוא שמורת ירד התכווצות (כלומר, השפעת Bowditch ירד). לכן, תפקוד לב צריך להימדד על פני טווח של קצב לב. כאן אנו מתארים כיצד להשתמש בממריץ (עם חזה סגור) כדי להשיג את ההשפעות הללו.

בנוסף לקצב לב, תחמוצת חנקן (NO) היא גם מאפנן חשוב של התכווצות ^7. NO מיוצר באמצעות אנזימים המכונים NO synthase (NOS). אנחנו ואחרים הראינו כי עכברים עם נוק אאוט של NOS העצבי (NOS1 - / - התכווצות) הקהתה myocyte ופרמטרים המודינמיים בלב vivo ^8,9. עכבר זה ישמש כדי להדגים את המדידה של התכווצות חדר השמאלית דרך הליך ניתוח לחץ LV / נפח מתבצע בקצב לב שונים.

Protocol

הערה: פרוטוקול חיה זו אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת אוהיו. הליך זה יכול לשמש בכל עכבר שבי הקוטר הפנימי של עורק התרדמה הוא גדול מספיק כדי להכניס את הצנתר. השתמש עכברים שהם מעל 16 גרם (מבוגרים חודשים מ ~ 2).

1. הכנת עכבר לצנתור

1. לאטום את כל מכשירים וציוד כירורגי בכיס עיקור. לעקר את השקיק במכונת החיטוי. לשמור על שדה סטרילי לאורך כל ההליך וללבוש כפפות סטריליות.
2. הרדימי עכברים עם קטמין (55 מ"ג / קילוגרם) בתוספת xylazine (15 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקת intraperitoneal.
   הערה: כל הליך מדידת שני הלחץ / הנפח בקצב לב שונים וESPRV לוקח פחות מ -20 דקות. אם נדרש זמן נוסף (כלומר, יותר מ -30 דקות), לתת ¼ מנה נוספת של הרדמה כל 30 דקות.
3. להסיר את השיער בr הקדמילאגיון של אזור חזה צוואר והסרת שיער באמצעות קרם (לדוגמא, Nair) והדבק את הגפיים של העכבר על גבי פלטפורמת הקצף. אשר למצב של הרדמה עמוקה על ידי צביטת הבוהן.
4. הכנס בדיקה רקטלית כדי לפקח על טמפרטורת הגוף (C ° 37 ± 1), ולשמור על השימוש בכרית חימום מוסדר תרמו (הממוקמת בין לעטוף כירורגית והפלטפורמה).
5. הכן אורך תפר 4-0 (~ 10 סנטימטרים). תפר לולאה סביב השיניים החותכות העליונות וקלטת לפלטפורמה. זה יהיה לשמור ישר הצוואר.
6. לעקר את אזור הניתוח על ידי שטיפת האזור עם פולידין ואלכוהול 75% שלוש פעמים.

2. צנתור

1. הכן את הצנתר על ידי presoaking הקצה מלוחים או מים מזוקקים (37 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 30 דקות לפני שימוש (על פי הוראות יצרן) להסתגל סרעפת חיישן לחץ לסביבה ביולוגית הרטובה ולמנוע סחף אות לחץ ושלילי הקלטות לחץ.
2. לעשות חתך 0.8 סנטימטר אורך בין הלסת התחתונה ועצם החזה באזור הקדמי של הצוואר. עם המספריים העדינים, להפריד את רקמת חיבור של עור שרירים כדי לחשוף את קנה הנשימה ממוקמת מתחת לשריר stemohyoideus.
3. הפרד את השומן ורקמת שריר בצד הימין של קנה הנשימה עם מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את העורק הראשי הנכון.
   הערה: עורק התרדמה הוא העורק הגדול ביותר באזור הקדמי של הצוואר, מכיל דם אדום בהיר, והוא פועם. אל תבלבל עם וריד הצוואר שפועל במקביל לעורק הראשי. וריד הצוואר הוא-pulsatile שאינו אדום וכהה. בנוסף, במהלך הבידוד של עורק התרדמה, המשתמש צריך להיות מודע לא לפגוע בעצב pneumogastric.
4. הסר את השומן מעורק התרדמה תקין עם המלקחיים המעוקלים. אם קיים הסתעפות של כלי השיט שיקשה טכניקה מבצעית זה, לחתוך אותם עם כויה Bovie לנתק את העורק הראשי.להפריד כמה שיותר הרקמה ככל האפשר תחת העורק הראשי באמצעות מלקחיים מעוקלים.
5. חותך שני 5 סנטימטר 6-0 חוטי משי. להעביר בכל חוט משי תחת עורק התרדמה הימני.
6. מיקום חוט אחד ליד החלק הפרוקסימלי ואחר סמוך לחלק הדיסטלי של העורק. הפוך קשר הדוק על החוט בחלק הדיסטלי, ולהפוך את קשר רופף על החוט בחלק הפרוקסימלי.
7. לחסום את זרימת דם על ידי כיווץ החלק הפרוקסימלי של העורק באמצעות מהדק כלי דם hemostat הקטן (מקום המהדק מתחת לחוט הפרוקסימלי). האזור האטום של העורק יהיה מלא בדם שהופך אותו קל לביצוע צעד 2.8.
8. לנקב חור קטן בעורק הראשי הנכון בין שני האשכולות (אך קרוב יותר לחוט הדיסטלי) עם מחט 26 G. הכנס את קטטר לתוך העורק הראשי. מעט להדק את הקשר הרופף בחלק הפרוקסימלי של עורק התרדמה על קטטר כדי לשמור על מקום.
   הערה: שימוש בניקור המחט עדיפה בהשוואהלחתך מספריים. על ידי ביצוע קשר הדוק בחלק הדיסטלי של העורק הראשון, ולאחר מכן מהדק את החלק הפרוקסימלי, העורק יהיה מלא מלא בדם. זה עושה את זה קל מאוד לתקוע דרך כלי הדם. יתר על כן, בגודל של המחט (26 G) מפוצץ את העורק עם חור שיפה מתאים את הגודל של קטטר. בעת השימוש בשיטת חתך מספריים, היה קשה יותר לשלוט על הגודל של החתך. עם זאת, השיטה שנבחרה צריכה להיות תלויה על איזה מהם המנתח מרגיש יותר בנוח עם.
9. להתחיל להקליט אותות לחץ כמו בשלב 3.
10. שחרר את מהדק hemostat ולהמשיך החדרת הצנתר קדימה לתוך החדר השמאלי. אם התנגדות מסוימת חווה כאשר קידום קטטר, בעדינות למשוך אותו אחורה ולנסות לקדם שוב. לעכבר במשקל ~ 18-25 גר ', האורך המשוער של קטטר שהוכנס הוא 18 מ"מ.
    הערה: אות לחץ הדם ינוע 70-120 מ"מ כספית. ברגע שלאהוא הצנתר הוא בחדר השמאלי הצורה של שינויי אות לחץ והלחץ ינוע 0-120 מ"מ כספית (מוצג באיור 1). תפקוד לב יתייצב תוך 2-3 דקות לאחר הכניסה של הצנתר.
11. לפקח באופן רציף את טמפרטורת גוף, רמת הרדמה, וקצב נשימה.

3. רכישת נתונים

1. תוכנה השתמש LabChartPro 7 (או תוכנה דומה). השתמש באפשרות זרימת העבודה של PV Loop LabChart מודול. שימוש במודול זה, בחר את הגדרת ברירת המחדל של לחץ ולולאות נפח.
2. הגדרה שלושה ערוצים: ערוץ אחד ללחץ, ערוץ אחד עבור נפח, וערוץ אחד לקצב לב. טווחים בקנה מידה שנקבעו פרמטרים לעיל כ0-150 מ"מ כספית, 0-100 μl ו0-800 פעימות / דקה, בהתאמה.
3. לחץ על מקש התחלה לשיא.

4. Bowditch אפקט

1. לעשות חתך 1 סנטימטר במקביל אזור precordium לmanubrium. חותך את שכבת השריר וExpOSE חלל הצלע באמצעות מספריים.
2. שימוש בממריץ דופק מרובע, להגדיר את הפרמטרים הבאים: מתח של 2 V, משך 2 אלפיות שני, ולאפשר מצב חוזר.
3. החזק את האלקטרודה השלילית עם מלקחיים והכנס אותו בחלל הצלע הרביעי לאזור הפסגה של הלב. החזק את האלקטרודה החיובית עם מלקחיים והכנס אותו בחלל הצלע השני באזור הפרוזדור הימני של הלב.
4. הפעל את ממריץ ולשנות את התדר לקצב הלב מ4 הרץ (240 פעימות / דקה) עד 10 הרץ (600 פעימות / דקה). בכל קצב לב חדש, לעורר את הלב 1 דקות לפני איסוף הנתונים.

5. יצירת ESPVR וPRSW

1. חותך את רקמת העור ושרירים בניצב לmanubrium באזור הבטן עם מספריים. פתח את enterocoelia ולחשוף את הכבד.
2. גרור את costarum ארקוס לכיוון הראש באמצעות גרירה מתכתית.
3. דחף בעדינות את הכבד כלפי מטה עםמקלון צמר גפן. היזהר שלא לדחוף יותר מדי כדי להשפיע על בית החזה. זה יהיה לשנות את תפקוד לב.
4. חותך את רצועות falciform של הכבד במספריים כדי לחשוף את הווריד הנבוב הנחות suprahepatic (IVC).
5. שימוש במלקחיים מעוקלים לסחוט IVC במהירות למשך 5 שניות כדי לחסום את חזרתו של דם לעלייה הימנית. הלחץ של החדר השמאלי והנפח ייפלו בשל הזרימה מופחתת ללב. ביצירת ערכים אלה, אין להשתמש בלולאות מתחת ל -60 מ"מ כספית. 60 מ"מ כספית הוא בהתייחסות ללחץ הסיסטולי.
   הערה: ערך זה מוגדר ב 60 מ"מ כספית, כי זה יגרום לירידה משמעותית בלחץ זלוף כדי להקטין באופן משמעותי זלוף כלילית ולהשפיע התכווצות.

כיול 6. נפח

1. Heparinize העכבר עם 0.1 מיליליטר של 1: 5,000 פתרון הפרין (בדילול עם מלח רגיל) על ידי הזרקת intraperitoneal.
2. הסר את הצנתר מהעורק הראשי. כאשר הצנתר הוא שלף frאום עורק התרדמה, דם heparinized יחלחל מהחור שבו הוכנס קטטר.
3. לאסוף את הדם הזה לכיול עוצמת קול באמצעות מזרק 1 מיליליטר. ממלא כל גם בקובט כיול.
4. הסר לב להרדים את העכבר באמצעות exsanguination.
5. מקם את הצנתר בכל טוב ולקבל ערך יציב יחידת נפח היחסית (RVU). ליצור עקומה סטנדרטית באמצעות הכרכים סטנדרטיים השונים וערכי RVU מכל טוב.
6. המרת RVU נרשם לμl.

7. עיבוד נתונים

1. כדי לבחון את השפעת Bowditch, בחר עקבות לחץ / נפח מצב יציב מכל קצב לב. לחץ על הניתוח הבסיסי לקבל נתונים.
2. לנתונים ESPVR וPRSW, בחר ~ עקבות לחץ 15 / כרך הראשונה, לחץ על ניתוח חסימה בתוכנה כדי ליצור את ESPVR (שיפוע של הלחץ שפותח על ידי LV בסוף-דיאסטולי נפח) וPRSW (רגרסיה ליניארית של עבודת השבץ עם הסוף-דיאסטולימדרונות נפח).
3. תן תשומת לב לצורה של הלולאות. ודא הלולאה סגורה ללא נקודות או פיתולים זוויתי. זהו סימן של מיקום צנתר לא תקין או רעש עודף. מעת לעת לבדוק לולאות במהלך הניסוי על מנת להבטיח נתונים בלחץ ונפח ראויים הם להיות שנוצרו.

תוצאות

ההחדרה הנכונה של קטטר לתוך החדר השמאלי היא צעד חשוב להשגת ערכי לחץ ונפח מתאימים. מוצג באיור 1, באמצעות LabChart 7 Pro, הוא השינוי של צורת גל הלחץ (צורה וערכים) כקטטר עובר מהעורק לתוך החדר.

לאחר כניסה תקינה של קטטר לתוך החדר השמאלי...

Discussion

שלב קריטי לטכניקה זו כדי לקבל מדד אמין של התכווצות הוא מיקום קטטר נכון לLV. אם קטטר לא ממוקם בצורה נכונה, כאשר LV חוזי הקירות עשויים לפנות לקטטר וכתוצאה מכך ערכים מאוד גבוה, ולא פיסיולוגי, לחץ גורם לולאות PV בצורה לא סדירות. במידת הצורך, את הקטטר ניתן לסובב כדי להשיג את המי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Xlyzine 100mg/ml	Ana Sed	4821
Katamin 50mg/ml	Ketalar	310006
Heparin	APP Pharmaceuticals	6003922
4-0 silk thread	Surgical specialties	SP102
6-0 silk thread	Surgical specialties	MBKF270
Forceps	Fine Science Tools	11251-10
Curve forceps	Fine Science Tools	11274-20
Scissors	Fine Science Tools	14090-09
Vascular clamp	Fine Science Tools	18555-03
Microscope	World precision instruments	PZM-3
Pressure catheter	Millar instruments	SPR-839
Pressure and volume system	Millar instruments	MPVS-300
PowerLab4/35	AD instruments	N12128
LabchartPro 7	AD instruments
Temperature controller	CWE	TC-1000
Stimulator	Grass	SD-5
Sterile glove	Micro-Touch	1305018821
Hair remover lotion	Nair
Betadine surgical scrub	Veterinary	NDC 6761815401
Acohol	Decon Laboratories	2801
Bovie cautery	Bovie	AA29
1ml Syringe(26G needle)	BD	8017299