O cateterismo cardíaco em camundongos para medir o volume Pressão do relacionamento: Investigando o efeito Bowditch

Resumo

This article describes the measurement of murine left ventricular function via pressure/volume analysis at different heart rates.

Resumo

Os modelos animais que imitam desordens cardíacas humanas foram criadas para testar potenciais estratégias terapêuticas. Um componente-chave para avaliar estas estratégias é examinar os seus efeitos sobre a função cardíaca. Existem várias técnicas para medir em mecânica vivo cardíacos (por exemplo, ecocardiografia, relações pressão / volume, etc.). Em comparação com a ecocardiografia, ventricular em tempo real à esquerda (LV) Pressão / análise de volume através de cateterismo é mais precisa e perspicaz na avaliação da função do VE. Além disso, a análise do VE pressão / volume fornece a capacidade de gravar instantaneamente alterações durante as manipulações de contractilidade (por exemplo, estimulação β-adrenérgico) e insultos patológicos (por exemplo, isquemia / reperfusão). Para além da máxima (+ dP / dt) e mínimo (-dP / dt) taxa de variação de pressão no VE, uma avaliação precisa da função ventricular esquerda através de vários índices independentes de carga (por exemplo, a pressão sistólica finalrelação volume e pré-carga de trabalho do curso recrutável) pode ser alcançado. A frequência cardíaca tem um efeito significativo na contractilidade do VE de tal modo que um aumento no ritmo cardíaco é o principal mecanismo para aumentar o débito cardíaco (isto é, efeito Bowditch). Assim, quando se comparam hemodinâmica entre os grupos experimentais, é necessário dispor de frequências cardíacas semelhantes. Além disso, uma característica de muitos modelos de cardiomiopatia é uma diminuição da reserva contrátil (isto é, uma diminuição do efeito Bowditch). Consequentemente, a informação vital pode ser obtida através da determinação dos efeitos de aumento da frequência cardíaca na contractilidade. Os nossos dados e outros tem demonstrado que o óxido nítrico sintase neuronal (NOS1) rato de abate diminuiu contractilidade. Aqui nós descrevemos o procedimento de medição de pressão LV / volume com o aumento da freqüência cardíaca, utilizando o modelo knockout rato NOS1.

Introdução

A finalidade do coração de bombear o sangue é todo o corpo para satisfazer as necessidades metabólicas do organismo. Uma vez que estas exigências são constantemente flutuante (por exemplo, durante o exercício), o coração tem de se adaptar (ou seja, aumentar o débito cardíaco). O coração criou numerosas vias para realizar esta façanha. A maneira privilegiada no coração consegue isso é através de um aumento da freqüência cardíaca (isto é, efeito Bowditch) ^1. Isto é, como um aumento da frequência cardíaca, isso resulta em um aumento da contractilidade e um aumento do débito cardíaco. Assim, a função do coração é extremamente dependente da freqüência cardíaca. Infelizmente, a doença de coração (por exemplo, enfarte do miocárdio, hipertrofia, etc) resulta no mau funcionamento do coração em que o coração não será, consequentemente, capaz de satisfazer as necessidades metabólicas do corpo. A doença cardíaca é a principal causa de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. Os modelos animais que recapitulam muitos cardiomy humanoopathies são utilizados para investigar os mecanismos moleculares e para testar terapias potenciais. Para discernir esses mecanismos e determinar se a terapia pode ser viável, os investigadores devem avaliar a função cardíaca in vivo.

Existem várias maneiras de avaliar a função cardíaca in vivo (por exemplo, o ecocardiograma, ressonância magnética, etc.), que rotineiramente medir a fração de ejeção, fração de encurtamento, o débito cardíaco, etc. No entanto, estes parâmetros são altamente dependentes de pós-carga, pré-carga e freqüência cardíaca Além disso a contractilidade ^2. Medindo contratilidade é indispensável para compreender as propriedades intrínsecas do coração em seu ambiente nativo. A taxa máxima (dP / dt _max) de desenvolvimento de pressão nos leva um passo mais perto de compreender a contratilidade. Infelizmente, dP / dt é também dependente da frequência cardíaca e condições de carga ^3. Por isso foram desenvolvidas técnicas para medir a carga (e frequência cardíaca, consulte below) índices independentes de contratilidade do miocárdio (ou seja, o volume sistólico final relação de pressão (ESPVR) e pré-carga recrutável trabalho acidente vascular cerebral (PRSW)) ^4-6. ESPVR descreve a pressão máxima que pode ser desenvolvida pelo ventrículo em qualquer dado volume do VE. A inclinação da ESPVR representa a elastância sistólica final (EEE). PRSW é a regressão linear de trabalho acidente vascular cerebral (área fechada pelo laço PV) com o volume diastólica final. Estes procedimentos são uma medida mais exata e precisa da contratilidade em comparação com parâmetros hemodinâmicos tais como fração de ejeção, débito cardíaco e volume sistólico. ESPVR PRSW e pode ser obtido através do bloqueio temporário da veia cava inferior (IVC). O bloqueio da VCI pode ser realizada com uma caixa fechada para evitar o efeito da alteração da pressão intrapleural sobre a função cardíaca.

O aumento da freqüência cardíaca também aumenta a contração e relaxamento ^1. Assim, quando se compara a função cardíaca entre experimentaOs grupos L (por exemplo, ± dP / dt), as frequências cardíacas precisa ser semelhante. No entanto, as taxas similares do coração normalmente não ocorrem em cada animal devido a várias condições (doença, intervenção investigação, etc.). Deve notar-se que a anestesia (injectável e inalado) diminui a frequência cardíaca. Como a frequência cardíaca é um dos principais determinantes da contratilidade, a anestesia irá afectar consideravelmente a contratilidade. Por esta razão, nós descrevemos o nosso procedimento. Além disso, uma característica de muitas cardiomiopatias é uma diminuição da reserva contrátil (isto é, um efeito de diminuição da Bowditch). Por conseguinte, a função cardíaca deve ser medida ao longo de uma gama de frequências cardíacas. Aqui nós descrevemos como usar um estimulador (com uma caixa fechada) para conseguir estes efeitos.

Além disso a frequência cardíaca, o óxido nítrico (NO) é também um importante modulador da contractilidade ^7. O NO é produzido por meio de enzimas denominadas NO sintase (NOS). Nós e outros mostraram que camundongos com nocaute de neuronal NOS (NOS1 ^{- / - contração dos miócitos) ter anulado e in vivo hemodinâmica cardíaca 8,9. Este rato irá ser utilizado para demonstrar a medição da contractilidade do ventrículo esquerdo via o procedimento de análise de pressão LV / volume realizada em várias frequências cardíacas.}

Protocolo

NOTA: Este protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) no The Ohio State University. Este procedimento pode ser usado em qualquer rato em que o diâmetro interno da artéria carótida é grande o suficiente para inserir o cateter. Use ratos que estão acima de 16 g (com mais de ~ 2 meses).

1. Preparação do rato por cateterismo

1. Vede todas instrumentos cirúrgicos e materiais em uma bolsa de esterilização. Esterilizar a bolsa em uma máquina autoclave. Manter um campo estéril durante todo o procedimento e usar luvas estéreis.
2. Anestesiar ratos com cetamina (55 mg / kg), além de xilazina (15 mg / kg) por injecção intraperitoneal.
   NOTA: Todo o procedimento de medição tanto a pressão / volume em diversas freqüências cardíacas e ESPRV leva menos de 20 min. Se for necessário um tempo adicional (ou seja, mais de 30 min), ¼ dar uma dose adicional de anestesia a cada 30 min.
3. Remova o cabelo no r anterioregion de pescoço e peito área usando o cabelo removendo loção (por exemplo, Nair) e cole os membros do mouse sobre a plataforma de espuma. Confirme o estado de anestesia profunda por uma pitada dedo do pé.
4. Insira uma sonda rectal para monitorizar a temperatura do corpo (37 ± 1 ° C), e manter usando uma almofada de aquecimento regulada-termo (localizado entre a cobertura cirúrgica e plataforma).
5. Prepara-se uma duração de 4-0 (~ 10 cm). Laço de sutura em torno dos incisivos superiores e fita para plataforma. Isto irá manter a linha reta pescoço.
6. Esterilizar a área cirúrgica esfregando a área com Betadine e álcool 75% três vezes.

2. Cateterismo

1. Prepara-se o cateter pelo presoaking a ponta em solução salina ou água destilada (37 ° C) durante pelo menos 30 min antes da utilização (de acordo com as instruções do fabricante) para aclimatar o diafragma sensor de pressão para o ambiente biológico húmido e impedir a dispersão do sinal de pressão e negativo registos de pressão.
2. Adicione uma incisão longitudinal 0,8 centímetros entre a mandíbula inferior e esterno na região anterior do pescoço. Com as tesouras finas, separar o tecido conjuntivo da pele-muscular para expor a traqueia localizado sob o músculo stemohyoideus.
3. Separou-se a gordura e tecido muscular no lado direito da traqueia com uma pinça curvos para expor a artéria carótida direita.
   NOTA: A artéria carótida é a maior artéria na região anterior do pescoço, contém sangue vermelho brilhante, e é pulsátil. Não confundir com a veia jugular que corre paralela à artéria carótida. A veia jugular é vermelho escuro e não pulsátil. Além disso, durante o isolamento da artéria carótida, o usuário deve estar ciente de não danificar o nervo pneumogastric.
4. Remover a gordura a partir da artéria carótida direita com as pinças curvas. Se existe ramificação do vaso que vai impedir esta técnica operacional, cortá-los com um cautério Bovie dissociar a artéria carótida.Separe o máximo de tecido possível, sob a artéria carótida usando uma pinça curva.
5. Corte dois cinco centímetros 6-0 fios de seda. Passe cada fio de seda sob a artéria carótida direita.
6. Posição um segmento perto da parte proximal eo outro perto da parte distal da artéria. Faça um nó apertado na rosca na parte distal, e fazer um nó frouxo na linha na parte proximal.
7. Bloquear o fluxo de sangue por aperto a parte proximal da artéria usando uma pinça vascular pequena pinça hemostática (colocar a braçadeira abaixo o segmento proximal). A região selada da artéria vai ser enchido com sangue, tornando mais fácil executar o passo 2.8.
8. Perfurar um pequeno buraco na artéria carótida direita entre os dois tópicos (mas mais perto do segmento distal) com uma agulha de 26 G. Inserir o cateter na artéria carótida. Aperte ligeiramente o nó frouxo na parte proximal da artéria carótida para o cateter para manter no lugar.
   NOTA: Usando a punção com agulha é preferido em relaçãoa tesoura incisão. Ao fazer um nó apertado na parte distal da artéria em primeiro lugar, e depois de prender a parte proximal, artéria vai ser totalmente cheio com sangue. Isto torna muito fácil para picar através do vaso sanguíneo. Além disso, o tamanho da agulha (26 L) perfura a artéria com um furo que se adapta muito bem ao tamanho do cateter. Quando se utiliza o método de incisão tesoura, que era mais difícil de controlar o tamanho da incisão. No entanto, o método escolhido deve ser dependente de qual o cirurgião sente-se mais confortável.
9. Comece a gravar sinais de pressão como no passo 3.
10. Solte a braçadeira pinça hemostática e continuar a inserção do cateter para dentro do ventrículo esquerdo. Se alguma resistência é experiente quando o avanço do cateter, puxe-o suavemente para trás e tentar avançar novamente. Para um rato pesando 18-25 g ~, o comprimento estimado do cateter que é inserido é de 18 mm.
    NOTA: O sinal de pressão arterial irá flutuar 70-120 mm Hg. Uma vez que tele é cateter no ventrículo esquerdo a forma do sinal muda de pressão e a pressão irá variar de 0 a 120 mm de Hg (mostrado na Figura 1). A função do coração vai se estabilizar dentro de 2-3 min após a inserção do cateter.
11. Monitorar continuamente a temperatura corporal, nível de anestesia, e taxa de respiração.

3. Aquisição de Dados

1. Use software LabChartPro 7 (ou software similar). Use a opção de WorkFlow do LabChart Módulo PV loop. Usando este módulo, selecione a configuração padrão de pressão e volume Loops.
2. Set-up de três canais: um canal de pressão, um canal para o volume, e um canal para a freqüência cardíaca. Definir intervalos de escala de parâmetros acima como 0-150 mm Hg, 0-100 0-800 ul e batida / min, respectivamente.
3. Pressione a tecla Iniciar para gravar.

4. Efeito Bowditch

1. Fazer uma incisão de 1 cm na área precórdio paralelo ao manubrium. Corte a camada de músculo e expose o espaço intercostal com uma tesoura.
2. Usando um estimulador pulso quadrado, definir os seguintes parâmetros: Tensão de 2 V, duração de 2 ms, e ativar o modo de repetição.
3. Segurar o eléctrodo negativo com uma pinça e inseri-la através do quarto espaço intercostal para a região apical do coração. Segurar o eléctrodo positivo com uma pinça e inseri-la através do segundo espaço intercostal para a região do átrio direito do coração.
4. Ligue o estimulador e mudar a freqüência para estimular o coração a partir de 4 Hz (240 batimentos / min) até 10 Hz (600 batimentos / min). A cada nova freqüência cardíaca, estimular o coração para 1 min antes da coleta de dados.

5. Gerando o ESPVR e PRSW

1. Cortar a pele e o tecido muscular perpendicular ao manubrium na região abdominal com uma tesoura. Abra o enterocoelia e expor o fígado.
2. Arraste o costarum Arcus para a cabeça usando tração metálico.
3. Com cuidado, empurre para baixo com o fígadoum cotonete. Tenha cuidado para não empurrar demais para afetar a cavidade torácica. Isso vai mudar a função do coração.
4. Cortar o ligamento falciforme do fígado com uma tesoura para expor a veia cava inferior suprahepática (IVC).
5. Use pinças curvas para apertar rapidamente da VCI durante 5 segundos para bloquear o retorno do sangue para o átrio direito. A pressão ventricular esquerda e volume irá cair devido à entrada reduzida para o coração. Em gerar esses valores, não use loops de abaixo de 60 mm Hg. A 60 mm Hg é em referência a pressão sistólica.
   NOTA: Esse valor é fixado em 60 mm Hg, porque isso irá causar uma queda significativa na pressão de perfusão para diminuir consideravelmente a perfusão coronária e afetar a contratilidade.

6. Volume Calibration

1. Heparinizar o rato com 0,1 ml de 1: 5,000 solução de heparina (diluído com solução salina normal) por injecção intraperitoneal.
2. Remover o cateter da artéria carótida. Quando o cateter é retirado from a artéria carótida, sangue heparinizado vai escoar do buraco onde o cateter foi inserido.
3. Recolha este sangue para calibragem de volume usando uma seringa de 1 ml. Encher cada poço na cuvete de calibração.
4. Remover coração para sacrificá o mouse via sangria.
5. Posicione o cateter em cada poço e obter um valor estável unidade de volume relativo (RVU). Gerar uma curva padrão, utilizando os vários volumes padrão e valores RVU de cada poço.
6. Converter o RVU gravadas ul.

7. Processamento de Dados

1. Para examinar o efeito Bowditch, selecione no estado estacionário vestígios pressão / volume de cada frequência cardíaca. Clique na análise de base para obter dados.
2. Para dados ESPVR e PRSW, selecione os primeiros vestígios ~ 15 pressão / volume, clique em análise de oclusão no software para gerar o ESPVR (inclinação da pressão desenvolvida pela LV no volume diastólico final) e PRSW (a regressão linear de trabalho sistólico com o fim-diastólicavolume) pistas.
3. Submeter a atenção para a forma dos laços. Verifique se o circuito é fechado sem pontos angulares ou torções. Este é um sinal de colocação do cateter imprópria ou excesso de ruído. Verifique periodicamente laços durante a experiência para garantir que os dados de pressão e volume adequados estão sendo gerados.

Resultados

A inserção correcta do cateter no interior do ventrículo esquerdo é um passo importante para atingir os valores de pressão e de volume apropriados. Mostrado na Figura 1, usando LabChart Pro 7, representa a mudança da forma de onda de pressão (forma e valores) como o cateter da artéria vai para o ventrículo.

Após a inserção correcta do cateter no ventrículo esquerdo, a pressão (P) e o volume (V) Os valores obtidos, em seguida, ser utilizada para gerar os loops P...

Discussão

Um passo crítico para esta técnica para obter uma medida confiável da contratilidade é a colocação do cateter adequado para a LV. Se o cateter não é colocado corretamente, quando o LV contrai as paredes podem entrar em contato com o cateter, resultando em valores muito elevados, e não fisiológico, causando pressão laços PV de forma irregular. Se necessário, o cateter pode ser girada para realizar o posicionamento correcto. Outro passo chave para esta técnica é certificar-se o mouse receberam anestesia ade...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Xlyzine 100mg/ml	Ana Sed	4821
Katamin 50mg/ml	Ketalar	310006
Heparin	APP Pharmaceuticals	6003922
4-0 silk thread	Surgical specialties	SP102
6-0 silk thread	Surgical specialties	MBKF270
Forceps	Fine Science Tools	11251-10
Curve forceps	Fine Science Tools	11274-20
Scissors	Fine Science Tools	14090-09
Vascular clamp	Fine Science Tools	18555-03
Microscope	World precision instruments	PZM-3
Pressure catheter	Millar instruments	SPR-839
Pressure and volume system	Millar instruments	MPVS-300
PowerLab4/35	AD instruments	N12128
LabchartPro 7	AD instruments
Temperature controller	CWE	TC-1000
Stimulator	Grass	SD-5
Sterile glove	Micro-Touch	1305018821
Hair remover lotion	Nair
Betadine surgical scrub	Veterinary	NDC 6761815401
Acohol	Decon Laboratories	2801
Bovie cautery	Bovie	AA29
1ml Syringe(26G needle)	BD	8017299