הפגנה של דגם פצע עור העכברוש איסכמי

Summary

החולדה, בשל הגודל, הזמינות, וההתנהגות לא הצייתנית שלה, נוצלה כמודל מחקר במשך שנים רבות. המטרה של פרוטוקול זה היא לנצל את החולדה כמודל ריפוי עור פצע איסכמי לספק תובנה חשובה הפתופיזיולוגיה של פצעים כרוניים.

Abstract

הנטייה לפצעים כרוניים בבני אדם עולה עם הזדקנות, תנאי מחלה כמו סוכרת ותפקוד לב וכלי דם פגום, ולחץ תמידי עקב חוסר תנועה. מודלים של בעלי החיים פותחו ניסיון שכדי לחקות את התנאים האלה לצורך קידום ההבנה של המורכבות של פצעים כרוניים שלנו. המודל המתואר כאן הוא מודל דש עור איסכמי חולדה המאפשר הפחתה ממושכת של זרימת דם וכתוצאה מכך פצעים שהפכו איסכמי ודומה פנוטיפ כרוני פצע (כלי דם מופחתים, דלקת מוגברת וסגירת פצעים מתעכבת). הוא מורכב מדש גב bipedicled עם 2 פצעים איסכמיים ממוקמים במרכז ו -2 פצעים אינם איסכמי לרוחב הדש כפקדים. בנוסף רומן למודל דש עור איסכמי זה הוא המיקום של גיליון סיליקון מתחת לדש שמתפקד כמחסום וסד למניעת revascularization ולהפחית התכווצות כלרפא את הפצעים. למרותדיון של שימוש בחולדות לריפוי פצע לימודים בשל ההבדלים אנטומיים ופיסיולוגיים שונים לגמרי שלהם בהשוואה לבני אדם (כלומר, הנוכחות של שריר carnosus מִרפָּד, תוחלת חיים קצרה, מספר הגדל של זקיקי שיער, וביכולתם לרפא את הפצעים נגועים) השינויים מועסקים במודל זה הופכים אותו לאלטרנטיבה יקרה לדגמי דש עור איסכמי שפותחו בעבר.

Introduction

פיתוח תרופות יעיל ותרופות ריפוי פצע אחרות דורשים מתאימים בדגמי vivo, למרות בעיות ידועות בתרגום ממצאים במודלים של בעלי חיים לטיפולים אנושיים ^1. להלן תיאור של פרוטוקול מפורט לשימוש במודל עכברים של ריפוי עור איסכמי פצע לחקור מנגנונים שעוד יותר את ההבנה של ריפוי פצע פתולוגי. מיני החולדה, לעתים קרובות מועסק בשל הזמינות רחבה, גודלה והטבע הצייתן משמש לפצע לימודי ריפוי כפי שהוא גדול מספיק כדי לספק שטח עור מתאים לפציעת incisional וexcisional, הדמיה ורקמות אוסף ^2. עם זאת יש לקחת בחשבון זהיר שהעור של עכברים ובני אדם הוא שונים מבחינה אנטומית, עם חולדות שהופנו לבעלי חיים רופפים עור כ. מאפיין מובהק זה מאפשר להתכווצות פצע, ולא epithelialization לתרום באופן משמעותי לסגירת העור של העכברים wounds ^2. בנוסף, הנוכחות של שריר carnosus מִרפָּד תת-עורי בחולדות, תורמת לריפוי על ידי שתי היווצרות ההתכווצות וקולגן ^3,4. הבחנות אנטומיים חשובות מאוד אלה נחשבו בפיתוח מודל פצע עור איסכמי חולדה ושינויים ספציפיים יושמו כדי להקטין התכווצות פצע ולהפחית את ההשפעה של השריר carnosus מִרפָּד ^5.

בכיבי רגל סוכרתיים, כיבים ברגלי ורידים, וכיבי לחץ, ריפוי מתעכב ופצעים אלה נחשבים כרוניים. הפצעים מתאפיינים בדלקת מופרזת, המונעת את הפצע מהתקדמות לשלבים הבאים של תיקון פצע ^6. אחד הגורמים העיקריים בהתפתחות של פצע כרוני הוא איסכמיה המקומית רקמה (זרימת דם מופחתת) ⁵ תורמת לחוסר היכולת לנקות את הדלקת. בזמן שבמהלכו מודל זה היה מפותח ותקף (ב2003-4), לא היו מודלים של בעלי חיים סטנדרטיים שיכול לספק מספיק רקמה לבדיקת אינדוקציה של אנגיוגנזה במיטת הפצע, שלב מפתח בריפוי פצע נורמלי והמוטיבציה לפיתוח מודל זה ^5. שאמרו, המודל שהוצג כאן הוא שינוי של מודל פצע איסכמי המתואר במקור על ידי שוורץ et al. ⁷ ולאחר מכן השתמש בצורה שונה על ידי et al חן. ⁸

במודל פצע איסכמי שונה, שינויים נעשו כדי לעקוף את המאפיינים אנטומיים שהוזכרו לעיל של העכברוש שיובילו לריפוי על ידי התכווצות ולא epithelialization: (1) שני פצעי excisional עובי מלאים נוצרים בתוך דש עור הגב וbipedicled שריר carnosus מִרפָּד מוסר מהפצע למיטה על ידי לנתח בדיוק מעל fascia השריר. (2) יש הדש עצמו ממדים צרים יותר, על מנת להבטיח שאספקת דם היא אקראית ופצעים הממוקמים בנקודת האמצע של tהוא הדש הוא איסכמי. (3) גיליון סיליקון מוחדר מתחת לדש, מניעת readherence וreperfusion של הדש מהרקמה בסיסית. התכווצות פצע מוגבלת (לא בוטל) על ידי עיגון או תפירת הדש לגיליון סיליקון ^5.

לאחרונה המודל נעשה שימוש במחקרים שנעו בין השפעות לחץ חמצן על פצע איסכמי ריפוי ^9,10 לריפוי פצע איסכמי בצעיר לעומת חולדות בגילי ¹¹ והוכיח להיות מודל אמין של איסכמיה רקמות הממושכת. הממדים של הדש bipedicled גם הותאמו לזני עכברוש שונים, כוללים ספראג Dawley (ארוך 11 סנטימטרים על ידי 2 סנטימטרים רוחב) וחולדות F344 (ארוך 10.5 סנטימטר על 3.0-3.5 סנטימטרים רוחב) ומינים אחרים, ובכלל זה חזירים ¹² ועכברים ^13,14. סרט הווידאו הזה מנצל את מתח החולדה טהור F344 בהפגנה של מודל פצע עור איסכמי.

אישור לכל נהלים בבעלי החיים המוצגים להלן היה להשיגed מאוניברסיטת הדרום פלורידה הוועדה של טיפול בבעלי חיים (IACUC) ולציית לכל הדרישות של צער בעלי החיים החוק והמדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה.

Protocol

הערה: אישור לכל נהלים בבעלי החיים המוצגים להלן התקבל מאוניברסיטת הדרום פלורידה הוועדה של טיפול בבעלי חיים (IACUC) ולציית לכל הדרישות של צער בעלי החיים החוק והמדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה.

1. הכנת גיליונות סיליקון ומכשירי ניתוח

1. רצועות חתוכות (10.5 סנטימטרים x 3.0 סנטימטרים) של אי-חיזקו 0.01 עובי, יריעות סיליקון כיתה רפואית ולעקר באמצעות החיטוי.
2. לנקות ולחטא מכשירי ניתוח (מספריים, מלקחיים ווילאות או מגבות כדי ליצור שדה סטרילי במהלך ניתוח) מתאימים.

2. בעלי חיים ניסויי

1. השתמש בזכר בוגר או חולדות נקבות במשקל בטווח 250-350 g מתקבל ממגדל מסחרי. אם חולדות בגילים מנוצלות, הם צריכים להיות ≥350 g כדי להבטיח את הישרדות טובה יותר לאחר ניתוח. לפני תחילתו של כל ניסויים להסתגל כל בעלי החיים לפחות7 ימים בתנאים סטנדרטיים של מחזור אור-חושך 12 שעות עם כרצונך מזון ומים.

3. הרדמה, שיכוך כאבים לפני ניתוח והכנת Operative

1. לגרום הרדמה כללית על ידי שימוש בisoflurane 3% -4% באמצעות תא אינדוקציה ולשמור (באמצעות שימוש בחרטום) בשעה 1% -2% עם O ₂ במהלך הכנת עור וניתוחים. לפקח על עומק ההרדמה על ידי התבוננות בשיעור ועומק הנשימה, קמצוץ interdigital או רפלקס מצמוץ palpebral.
   הערה: בשלב זה, משחה וטרינר יכולה להיות ממוקמת על העיניים כדי למנוע יובש ואילו בעלי החיים נמצאים תחת הרדמה.
2. בשלט רחוק מיקום כירורגים באזור סטרילי, למקם את העכברוש במצב שכיבה ולגלח את dorsum עם קוצץ מבסיס הצוואר ומטה כ -11 סנטימטרים. סטנסיל עם סמן קבוע, את קווי המתאר ל3.0 סנטימטרים x 10.5 סנטימטרים הדש (ראו איור 1 א).
3. הזז את העכבר לsurgica נקי, המיועדאזור l המצויד בכרית חימום אושרה ווילאות כירורגי סטרילי או מגבות. להזריק 5 מ"ג / קילוגרם Ketoprofen תת עורי לפני החתכים הניתוחיים הראשונים לטיפול בכאב. נוזלים נוספים (מלוח) יכולים להינתן (עד 5 סמ"ק) תת עורי במידת הצורך.
4. הכן את העור עוד יותר על ידי השטיפה ראשונה עם 70% אלכוהול איזופרופיל והשני עם chlorhexidine 0.2%, ולאחר מכן להחיל סדינים מעוקרים כדי ליצור שדה סטרילי. גם 10% povidone- יוד (פולידין) ניתן להשתמש.
   הערה: אנטיביוטיקה (אמפיצילין ב 15 מ"ג / קילוגרם) יכולה להיות מנוהלת תת עורי, אבל אם טכניקות ספטית טובות משמשות היא אינה נדרשת.

4. יצירת פצעי excisional וBipedicled דש

1. שימוש בכלי סטרילי, חד פעמי 6 מ"מ ביופסיה, ליצור שני פצעים "איסכמי" עגולים במרכז אזור הדש המיועד (איור 1). העומק של הפצע צריך להיות עד ל( לא דרך) fascia הבסיסי של קארנו מִרפָּדשריר sus (הבלעה 1B איור).
2. שימוש במלקחיים להרים את העור באמצע המתווה הפצע שנוצרה על ידי הביופסיה ולאחר מכן להשתמש במספרי איריס (עם טיפים מעוגלים) שיחתכו את החתיכה העגולה של רקמה (כולל שריר carnosus מִרפָּד). התוצאה תהיה בעובי מלא פצע עם fascia כבסיס של הפצע.
   הערה: הרקמה נכרתה (תקעי פצע) ניתן להצמיד קפואה בחנקן נוזלי או קבוע ב 10% O נאגר פורמלין / N לעיבוד מאוחר יותר כשליטה, עור רגיל.
3. צור דש bipedicled על ידי ביצוע חתכים עם אזמל סטרילי בכל צד של הפצעים איסכמיים לאורך הקווים מצוירים מראש (איור 1 ג), כי הם 10.5 סנטימטר אורך ו -3.0 סנטימטר זה מזה. עומק החתכים צריך להיות עד לשרירי paraspinous. בעזרת המספריים איריס, להפריד fascia carnosus מִרפָּד משרירי paraspinous, להיות זהיר, כדי לשמור על fascia שלם בשם "הבסיס" של האגרופים מ"מ 6 (Figure 1D).
4. קח 1 גיליון סיליקון מראש לחתוך סטרילית ולמקם אותו בין fascia carnosus מִרפָּד ושרירי paraspinous (איור 1E) להבטיח שהגיליון לא יתקפל או לקפל. שימוש בתפרים שחורים, שאינם נספגים (גודל 4.0) לסגור את שני החתכים על ידי עיגון גיליון סיליקון לעור עם לפחות 8 תפרים נקטעו בכל צד, לאורכו של הדש (איור 1F ו1G).
5. שימוש בכלי סטרילי, חד פעמי ביופסיה, ליצור שני פצעים פנימיים שליטה "אינם איסכמי" (עד fascia הקדמי של שריר carnosus מִרפָּד) 1 סנטימטר לרוחב הפצעים איסכמיים בכל צד של הדש (איור 1G).
6. הנח שליט מתחת לפצעים ולקחת את תמונות דיגיטליות למטרות מדידת פצע (ראה איור 3 א). בשלב זה, את זרימת דם (זלוף) יכולה להיות במעקב על ידי שימוש בליזר דופלר או מניפולציות אחרות (מיקום תרופתי מקומי) שבוצעו.
7. החל דבק נוזלי אושר שתי גולגולת וזנב לפצעים וסרט שקוף הלבשה כדי לשמור על סביבת הפצע לח ונקי (סטרילי). הלבשה נוספת עשויה להיות ממוקמת בסוף הזנב של הדש כדי למנוע את החיה מהסרת תפרי הזנב ביותר.

נהלים 5. לאחר ניתוח

1. הנח בעלי חיים בכלובים (שוכנו בנפרד) מצוידים במתקני האכלה רדודים כדי למנוע מהאתר כירורגית מתחכך המזין. לא צריכים להשאיר בעלי חיים ללא השגחה או חזרו לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהם יחזרו להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal ולהציג תנועה תכליתית. מחצלות חימום צריכה להיות ממוקמות מתחת מחצית מהכלוב עד 2 ימים במהלך התאוששות.
2. לטיפול בכאב לאחר הניתוח, לנהל Ketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם) תת עורי לבעלי חיים בוקר ו1x ליום הבא שללאחר ניתוח עד 48 שעות. גם לבעלי חיים צריכים להיות במעקב יומי לסימנים מתמשכים של כאב, ירידה במשקל או זיהומים באתר ניתוח.

6. מדידות פצע לאחר שינויים וגימור

1. מדדו פצעים איסכמיים ולא-איסכמי לעתים קרובות בהרדמה כללית באמצעות isoflurane ב -3% -4% באמצעות תא אינדוקציה ומתוחזק (דרך חרטום) בשעה 1% -2% עם O ₂ כמו בשלב 3.1.
2. הסר את האיפור בעדינות כדי לא למשוך את הדבק מהעור. בשלב זה תמונות דיגיטליות נוספות נלקחות למדידות פצע, טיפול מקומי מוחל מחדש, הדמיה דופלר הלייזר (LDI) או מניפולציות אחרות המבוצעות בהתאם לצרכיה של החוקר.
3. החל דבק והלבשה נקייה ולאפשר לבעלי החיים להתאושש כמו בשלב 5.1.

7. פצע איסוף והמתת חסד

1. איסכמי קציר ופצעים שאינם איסכמי (בימי החוקר ימצאו לנכון) ואילו בעלי החיים הוא בהרדמה כללית באמצעות isoflurane ב -3% -4% באמצעות indתא uction ומתוחזק (דרך חרטום) בשעה 1% -2% עם O ₂ כמו בשלב 3.1.
2. באמצעות אזמל, לבצע כריתה בצורת ריבוע סביב הפצע לכלול כמה רקמות בריאות סביב הפצע. הנח את הכריתה ל1.5 מיליליטר הצמד צינור כובע ולהצמיד הקפאה בחנקן נוזלי (חנות ב -80 ° C) לצורך הניתוח מולקולרי עתיד או לדגור ב 10% O נאגר פורמלין / N ב RT לעיבוד היסטולוגית.
   הערה: ניתן גם לחתוך חתכים בפצע במחצית לספק יותר דגימות לבדיקה.
3. לאחר הסרת רקמת פצע, להרדימו בשיטה שאושרה של CO ₂ שאיפה.

תוצאות

פרוטוקול מודל ריפוי עכברוש איסכמי פצע צריך לקחת כ 20 דקות לכל בעל חיים אם ביצע ביעילות. לפני היישום של הלבשת המודל אמור להופיע כפי שהוא מיוצג באיור 1G. זה יהיה חשוב כדי לוודא שהדש ופצעי bipedicled בי הם איסכמי. מתח חמצן תת עורי (PscO ₂₎ ברמה של הפצעים כבר נמדד במהלך...

Discussion

ריפוי פצעים בחולדות היה לעתים קרובות הנושא לוויכוח בשל יכולתם לרפא את הפצעים נגועים ושיעור גבוה של שונות interanimal ^5. אחת מהמטרות המקוריות של המודל במהלך פיתוחו היה כדי להקטין וריאציה זו. שינויים ברוחב של הדש, צמצום מספר הפצעים במיקום ספציפי (התמקד בדש עם מיקום ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128