쥐 허혈성 피부 상처 모델의 데모

요약

쥐가 크기 때문에, 가용성, 오히려 유순 한 행동에, 몇 년 동안 연구 모델로 이용되고있다. 이 프로토콜의 목적은 만성 상처의 병태 생리에 대한 통찰력을 제공하는 허혈성 상처 치유 피부 모델로서 쥐를 이용하는 것이다.

초록

인간의 만성 상처에 대한 성향 등으로 인해 부동에 당뇨병과 장애인 심혈관 기능 및 누그러 압력 노화, 질병 상태에 따라 증가한다. 동물 모델은 만성 상처의 복잡성의 이해를 발전하기위한 목적으로 이러한 조건을 모방하는 것을 시도 개발되었다. 본 명세서에 기재된 모델은 허혈성되고 만성 상처 표현형 (혈관 감소, 염증 및 지연 증가 상처 봉합)을 닮은 상처 발생 혈류 감소 연장을 허용 래트 피변 허혈 모델이다. 그것은 컨트롤 등의 플랩 측 방향의 중앙 배치의 2 허혈성 상처와이 비 허혈성 상처와 bipedicled 등의 플랩으로 구성되어 있습니다. 이 피변 허혈 모델 신규 추가 배리어 및 혈관 재 형성을 방지 및 상처 치유로 수축을 감소시키기 부목로서 기능 플랩 아래에 실리콘 시트의 배치이다. 에도 불구하고때문에 사람에 비해 자신의 매우 독특한 해부학 및 생리 학적 차이에 대한 연구를 상처 치유에 대한 쥐를 사용하는 논쟁 (즉, panniculus의 카르노 서스 근육, 짧은 수명의 존재, 모낭의 수가 증가하고, 감염된 상처를 치유 할 수있는 능력) 이 모델에 사용 된 수정은 이전에 개발 된 허혈성 피부 플랩 모델에 귀중한 대체합니다.

서문

효과적인 약물 개발 및 다른 상처 치유 치료제는 인간의 치료 ¹ 동물 모델에서 연구 결과를 번역하는 알려진 문제점에도 불구하고, 생체 내 모델에서 적절한 필요합니다. 다음은 병리 기전 상처 치유의 추가적인 이해를 조사하는 허혈성 피부 상처 치유 쥐 모델의 사용을위한 프로토콜의 상세한 설명이다. 쥐의 종, 종종 넓은 가용성, 크기로 인해 고용하고 절개 및 절제 상처, 이미징 및 조직 ² 컬렉션에 적합한 피부 영역을 제공하기에 충분히 큰 같이 유순 자연 상처 치유 연구에 사용됩니다. 그러나 쥐가 느슨한 피부 동물 언급되면서, 쥐와 인간의 피부 해부학 적 차이가 심하게 고려해야한다. 이 독특한 특성은 래트 피부의 폐쇄 w 크게 기여하기보다는 오히려 상피화, 상처 수축 허​​용ounds ^2. 또한, 쥐의 피하 panniculus 카르노 서스 근육의 존재는, 수축 모두 콜라겐 형성에 의해 ^3,4- 치유에 기여한다. 이러한 매우 중요한 해부학 적 차이는 허혈 래트의 피부 상처 모델의 개발을 고려하고, 특정 변형 상처 수축을 감소시키고 panniculus 카르노 서스의 근육 ^(5)의 영향력을 감소시키기 위해 실행되었다.

당뇨병 성 족부 궤양, 다리 궤양, 및 욕창에서 치유가 지연되고 이러한 상처는 만성 간주됩니다. 상처는 상처 수리 ^(6)의 다음 단계로 진행되지 않도록 상처 과도한 염증을 특징으로한다. 만성 상처의 개발에 주요 요인 중 하나는 염증을 취소 무능력에 기여 지역화 된 조직의 허혈 (감소 혈액의 흐름) ^5입니다. 이 모델은 2003-4 년에 (개발 및 유효성을 검사 한 동안시), 상처 침대, 정상적인 상처 치유 동안 키 단계와이 모델 ^{5 개발을위한} 동기 부여 혈관 신생 유도를 테스트하기에 충분한 조직을 제공 할 수있는 표준화 된 동물 모델은 없었다. 즉, 여기에 제시된 모델은 첸 등에 의해 변형 된 형태로 사용 원래 슈워츠 등. ^7, 이후 설명하는 허혈성 상처 모델의 변형입니다 말했다. ⁽⁸⁾

변성 허혈성 상처 모델에서 변경 오히려 상피화보다 수축에 의해 치유 이어질 래트 상술 한 해부학 적 특징을 우회 이루어져왔다 : (1) 두 전층 절제 상처는 bipedicled 등쪽 피부 플랩 내에 생성된다 panniculus 카르노 서스 근육은 단지 근육의 근막 위의 해부에 의해 침대 상처에서 제거됩니다. (2) 자체가 플랩 t의 중간에 위치하는 더 좁은 혈액 공급이 랜덤 인 것을 보장 차원 및 상처를 가지고그는 플랩 허혈성 있습니다. (3) 실리콘 시트는 하부 조직으로부터 플랩의 재관류 재 부착을 방지 플랩 아래에 삽입된다. 상처 수축 고정 또는 실리콘 시트 ^(5)에 의해 봉합 플랩 (제거되지 않은) 제한된다.

이 모델은 최근 세 쥐 ¹¹ 대 젊은 허혈성 상처 치유에 ^9,10 치유 허혈성 상처에 고압 산소의 효과에 이르기까지 연구에 사용되었으며, 장기간 조직 허혈의 신뢰할 수있는 모델로 입증되었습니다. bipedicled 플랩의 크기는 돼지 ^(12)와 마우스를 포함하여 다른 종 (3.0-3.5 cm 폭 10.5 cm 길이)와 F344 쥐 (2cm 폭으로 11cm 길이) 스프 라그을 포함한 다른 쥐의 변종에 맞게 조정되었습니다 ^{13, 14.} 이 비디오는 허혈성 피부 상처 모델의 데모에서 F344 근친 쥐의 피로를 사용합니다.

아래에 제시된 모든 동물 절차에 대한 승인 획득했다사우스 플로리다의 동물 관리위원회 (IACUC)의 대학에서 에드와 동물 복지법 및 관리에 대한 가이드 및 실험 동물의 사용의 모든 요구 사항을 준수.

프로토콜

참고 : 아래에 제시된 모든 동물 절차에 대한 승인은 사우스 플로리다의 동물 관리위원회 (IACUC)의 대학에서 얻은 동물 복지법 및 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 모든 요구 사항을 준수했다.

실리콘 시트 및 수술 도구 1. 준비

1. 규격에 맞게 자르는 스트립 (10.5 cm X 3.0 cm) 0.01 두께, 의료용 실리콘 시트를 비는 강화 및 오토 클레이브를 사용하여 소독.
2. 청소하고 (수술 중 멸균 필드를 만들 가위, 집게와 커튼이나 수건) 적절한 수술 도구를 소독.

2. 실험 동물

1. 성인 남성 또는 상업적 개종에서 얻은 250-350g 범위에 무게 암컷 쥐를 사용합니다. 세 래트가 이용되는 경우, 더 잘 수술 후 생존을 보장하기 위해 ≥350 g이어야한다. 모든 실험의 시작에 앞서 적어도 모든 동물을 순응먹이와 물은 마음대로 먹게하면서 12 시간 명암주기의 표준 조건 하에서 칠일.

3. 마취, 수술 전 진통과 수술 준비

1. 유도 챔버를 통해 3 % -4 %를 이소 플루 란을 사용하여 전신 마취를 유도하고 피부 준비 및 수술 중 O ₂ 1 %에서 (코 콘의 사용을 통해) -2 %를 유지한다. 속도와 호흡, 인터 ​​핀치 또는 눈꺼풀 깜빡임과 깊이의 관찰에 의해 마취의 깊이를 모니터링합니다.
   주 :이 때, 수의사 연고 동물이 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈 상에 배치 될 수있다.
2. 무균 수술 영역에서 위치 원격에서 발생하기 쉬운 위치에 쥐를 배치하고 목 아래 약 11cm의 기지에서 가위로 배부 면도. 영구 마커 스텐실, 3.0 cm X 10.5 cm 플랩에 대한 개요는 (그림 1A 참조).
3. 깨끗하고 지정된 surgica에 쥐를 이동승인 된 가열 패드 및 무균 수술 커튼이나 수건을 갖추고 리터 영역입니다. 통증 관리를위한 제 절개 수술 5 ㎎ / kg 케토 프로 피하 주사 종래. 필요에 따라 추가의 유체 (생리 식염수)를 피하에 (최대 5를 CC)을들 수있다.
4. 멸균 필드를 만들 멸균 커튼을 적용 후, 70 % 이소 프로필 알코올 0.2 % 클로르헥시딘과 초 먼저 보라고하여 더 피부를 준비합니다. 10 % 포비돈 - 요오드 (베타 딘)도 사용할 수있다.
   참고 : 항생제 (15 ㎎ / ㎏에서 암피실린)를 피하 투여 할 수 있지만, 좋은 무균 기술을 사용하는 경우, 그것은 필요하지 않습니다.

4. 절제 상처와 Bipedicled 플랩 만들기

1. 멸균 일회용 6mm 생검 펀치 도구를 사용하여, 지정된 영역 플랩 (도 1b)의 중심에 두 개의 원형 "허혈"상처를 만든다. 상처의 깊이는 아래 (안 통해)에 panniculus의 carno의 기본 근막해야SUS 근육 (그림 1B 인세 트).
2. 사용 집게 펀치 생검에 의해 생성 된 상처 윤곽의 중간에 피부를 들어 올린 다음 (panniculus의 카르노 서스 근육 포함) 조직의 원형 조각을 절제하는 (곡선 팁) 홍채 가위를 사용합니다. 결과는 상처의 기부로서 근막 권취 전층 것이다.
   참고 : 적출 한 조직 (상처 플러그) 액체 질소에 냉동 또는 제어와 같은 후 처리, 정상 피부에 10 % 완충 포르말린 O / N에 고정 스냅 할 수 있습니다.
3. 떨어져 길이 10.5 cm 3.0 cm있는 사전으로 그린 선 (그림 1C)을 따라 허혈성 상처의 각 측면에 멸균 메스로 절개를함으로써 bipedicled 플랩을 만듭니다. 절개의 깊이는 아래 paraspinous 근육해야한다. 홍채 가위를 사용하여, (6mm 펀치의 "기본"으로 그대로의 밴드되지 않도록 조심스럽게 paraspinous 근육에서 F를 panniculus의 카르노 서스 근막을 분리igure 1D).
4. 1 멸균 프리 컷 실리콘 시트를 가지고 panniculus의 카르노 서스 근막 시트가 구부러 지거나 접하지 않는 것을 보장 paraspinous 근육 (그림 1E) 사이를에 배치합니다. 블랙, 비 흡수성 봉합사 (크기 4.0)를 사용하여 플랩 (도 1F 및 1G)의 길이를 따라, 각각의 측면상의 적어도 8 중단 바늘 피부에 실리콘 시트를 고정함으로써 두 절개를 닫는다.
5. 멸균 일회용 생검 펀치 도구를 사용하여, 1cm가 플랩 (그림 1G)의 양쪽에있는 허혈성 상처에 대해 측면 (panniculus의 카르노 서스 근육의 앞쪽 근막 아래로)이 내부 통제 "비 허혈성"상처를 만들 수 있습니다.
6. 상처 아래 통치자를 놓고 상처 측정을 목적으로 (그림 3A 참조) 디지털 사진을 찍어. 이때, 혈류 (재관류) 레이저 도플러 또는 다른 조작이 수행 (국소 약물 배치)를 이용하여 모니터링 할 수있다.
7. 뇌와 꼬리 상처와 촉촉하고 (멸균) 깨끗한 상처 환경을 유지하기 위해 드레싱 투명 필름을 모두 승인 된 액체 접착제를 적용합니다. 추가적인 드레싱 가장 꼬리 봉합사를 제거하는 동물을 방지 플랩의 꼬리 단부에 배치 될 수있다.

5. 수술 후 절차

1. 공급 문지르는 수술 부위를 방지하기 위해 얕은 공급기가 장착 케이지 (단독으로 보관)에있는 동물을 놓습니다. 동물 방치 또는 흉골 드러 누움을 유지하고 목적이있는 운동을 전시 할 수있는 충분한 의식을 되 찾을 때까지 다른 동물의 회사에 반환 할 수 없습니다. 난방 매트를 복구하는 동안 최대 2 일 동안 케이지의 절반 아래에 배치해야합니다.
2. 수술 후 통증을 관리하려면, 최대 48 시간의 수술 후는 다음 아침과 하루에 1 배 동물에 피하 케토 프로 펜 (5 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. 동물도 매일 모니터링해야통증, 체중 감소 또는 수술 부위 감염의 징후 연장.

6. 후속 상처 측정 및 드레싱 변경

1. 유도 챔버를 통해 3 %에서 이소 플루 란을 사용하여 전신 마취 자주 -4 %를 허혈성 및 비 허혈성 상처를 측정하고 단계 3.1에서와 같이 O _2와 1 % -2 %에서 (코 콘을 통해) 유지.
2. 피부 접착제를 잡아 당기지하기로 부드럽게 드레싱을 제거합니다. 추가 디지털 사진 감아 측정에 찍은이 때, 국소 치료 재인가, 레이저 도플러 영상 (LDI) 또는 연구자의 필요에 맞게 다른 조작을 수행.
3. 접착제 깨끗한 드레싱을 적용하고 동물이 단계 5.1에서와 같이 복구 할 수 있습니다.

7. 상처 수집 및 안락사

1. 동물 공업을 통해 3 % -4 %를 이소 플루 란을 사용하여 전신 마취 상태에서 수확 허혈성 및 비 허혈성 상처 (날이 조사는 적절하다고 판단)uction 챔버 및 단계 3.1에서와 같이 O _2와 1 % -2 %에서 (코 콘을 통해) 유지.
2. 메스를 사용하여, 상처 주위의 건강한 조직을 일부 포함하는 상처 주위에 사각형 모양의 절개를 만든다. 1.5 ml의에 절제를 놓고 캡 튜브 스냅와 미래의 분자 분석 (-80 ° C에서 저장) 액체 질소에 동결 스냅 또는 조직 학적 처리를 위해 RT에서 10 % 포르말린의 O에서 / N을 배양한다.
   주 : 상처 절개도 분석을 위해 더 많은 샘플을 제공하기 위해 반으로 잘라 될 수있다.
3. 상처 조직을 제거한 후, CO ₂ 흡입의 승인 된 방법을 사용하여 동물을 안락사.

결과

효율적으로 수행 한 경우 쥐의 허혈성 상처 치유 모델 프로토콜은 동물 당 약 20 분 소요됩니다. 이전 그림 1G에 나타낸 바와 같이 나타납니다 모델을 드레싱의 응용 프로그램. 그것은 bipedicled 플랩과 상처 안에 허혈성 있는지 확인하는 것이 중요 할 것입니다. 상처의 수준에서 피하 산소 장력 (PSCO ₂₎ 두 허혈성 상처 사이의 피하 조직에 폴라 전극을 배치하여이 모델 ^5의...

토론

쥐의 상처 치유는 종종 인해 감염된 상처와 interanimal 변화 ^(5)의 높은 비율을 치유 할 수있는 능력에 논쟁의 대상이되어왔다. 개발 중 모델의 원래 목표 중 하나는이 편차를 감소하는 것이었다. 특정 위치와 상처의 수를 감소 플랩의 폭에 대한 수정이, 실리콘 시트 및 소개 (일관성 cranio-꼬리 위치와 플랩을 중심으로)이 목표를 달성했다. 수축에 의해 상처 치유는 또한 인간에서와 같이,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128