יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

Summary

הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).

Abstract

הזרקת stereotactic היא טכניקה שימושית כדי לספק lentiviruses גבוה כייל לאזורים במוח ממוקדים בעכברים. Lentiviruses יכול גם ביטוי יתר או ביטוי גני מציאה באזור יחסית ממוקד ללא פגיעה משמעותית ברקמת המוח. לאחר התאוששות, העכבר המוזרק יכול להיבדק על משימות התנהגותיות שונות כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST). OFT נועד להעריך את התנועה ואת הפנוטיפ החרדה בעכברים על ידי מדידת משך זמן שמבלה עכבר במרכז שדה פתוח רומן. עכבר חרד יותר ישקיע פחות באופן משמעותי זמן במרכז שדה רומן השוואה לקבוצת ביקורת. FST מעריך את הפנוטיפ אנטי-דיכאון על ידי כימות את כמות הזמן שמבלים עכברים נייחים כאשר הניחו לדלי של מים. עכבר עם פנוטיפ אנטי-דיכאון יבלה נייח פחות זמן באופן משמעותי לעומת שליטת בעלי חיים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בsterהזרקת eotactic של lentivirus בשיתוף עם בדיקות התנהגותיות להעריך כיצד גנטי גורמים לווסת התנהגויות של בעלי חיים.

Introduction

העכבר כבר בשימוש נרחב בנוירוביולוגיה כי זה קל לתפעל גנטי. טכניקות נוקאאוט הגן מאפשרות לחוקרים לחקור כיצד כל גורם גנטי מעצב התנהגויות עכבר. יתר על כן, מערכת cre-loxP מספקת כלי רב ערך עבור דקיק ובתא type- נוקאאוט ספציפי גן בעכברים, המאפשר לחוקרים ללמוד תפקוד גן ברקמות שונות. ¹ עם זאת, בפועל, דפוסי ביטוי של יזמי cre קשים לשליטה , ועד כה רבים cre נהגים הוקמו לא השיגו ביטוי ספציפי לאזור. ^2,3

לחלופין, הזרקת stereotactic היא שיטה שמכוונת אזורים ספציפיים במוח של העכבר הבוגר. על ידי הזרקת וירוסים מהונדסים גנטי לבטא cDNA או shRNA, אפנון האזור ספציפי של ביטוי גנים יכול להיות מושגת. למרות שגודל המוח של כל עכבר משתנה, המיקום של אזורים מסוימים במוח ניתן לקבוע באמצעות coordi stereotacticנטס להגדיר מציוני הדרך בגולגולת של מוח העכבר. ציוני הדרך הנפוצות ביותר הן גבחת, למבדה, וקו interaural. באמצעות קואורדינטות מתקבלות מאטלס מוח, ⁴ המיקום המדויק של כל אזור במוח ניתן לזהות על ידי Antero-האחורי (/ P), (M / L) המדיאלי-צדדי, וגב-הגחון (D / V) צירים מ גבחת / צומת קו interaural. בדרך כלל וירוסים שהוחדר לתוך מוחם של עכברים מתויגים עם או חלבון אדום, או ירוק ניאון (RFP או GFP), כך שניתן תהיה אישרו זריקות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הערכות התנהגות של עכברים נחוצות במיוחד למחקר בסיסי של הפרעות פסיכיאטריות. סימפטומים של הפרעות פסיכיאטריות בחולים בדרך כלל כרוכים בהתנהגויות חריגות. חלק מהתנהגויות האנושיות אלה אבולוציונית שימור וניתן חיקה ישירות ונצפה בעכבר. לדוגמא, דיכאון יכול להיות מודל בעכבר על ידי מדידת ייאוש התנהגות. אנשים עם דיכאון לעתים קרובותen מרגיש כאילו שום דבר שהם עושים אי פעם לעזור, סימפטום שיכול סופו של דבר להוביל להתאבדות. במכרסמים, זה יכול להיות מודל באמצעות הבדיקה בכפייה לשחות (FST), אשר מודדת את כמות הזמן שעכבר שחיה לעומת צף בבריכה של מים (נתפס כויתור). פרדיגמה זו אומתה על ידי הצלת פנוטיפ עם תרופות נגד דיכאון. ^7,8,9 עכברים שקבלו תרופות נגד דיכאון יבלה נייח זמן באופן משמעותי פחות בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה. עוד מבחן התנהגותי, מבחן שדה הפתוח (OFT) נועד להעריך את התנועה בעכברים, וגם יכול לשמש כדי לנתח את הפנוטיפ החרדה בעכברים. ^5,6 מבחן זה מבוסס על ההנחה שהעכברים מרגישים בטוחים יותר כאשר הם קרובים אל הקיר בשדה פתוח רומן. עכברים מסוג בר סופו של דבר יהיה לחקור את סביבת הרומן, כפי שהם בעלי חיים סקרנים. עם זאת, הוצאות פחות זמן במרכז השדה מציינת חרדה בעכבר, כמו העכבר לא יהיה מסוגל להתגבר על initiaפחד l הביא על ידי סביבת רומן. החרדה של העכבר, כמו לכמת ידי כמות הזמן מושקעת במרכז שדה פתוח, ניתן להשוות לחרדה קלינית בבני אדם, אשר שוהה בהפרעות פסיכיאטריות רבות.

השילוב של זריקות stereotactic עם פרדיגמות התנהגות הוא דרך חדשנית לשנות את הביטוי של גן מסוים באזור מוח ממוקד. ההשפעה של ביטוי גנים מווסת על התנהגויות עכבר אז יכולה להיות נחושה. בניגוד לנוקאאוט המוח כולו, שיטה זו שימושית במיוחד כפי שרק מטרות אזורים ספציפיים במוח. בנוסף, זריקות stereotactic מבוצעות בדרך כלל בעכבר הסוג בר המבוגר, לכן, ביטוי גני אנדוגני נשמר לאורך שלבי התפתחות. שיטה זו תמנע את ההשפעה לבלבל אם נדרש הגן להישרדות בשלב העוברי או לאחר לידה של פיתוח. מגבלה עיקרית אחת היא שעכברי הניסוי צריך ללכת through ניתוח פולשני, שבו יש לי הגולגולות של עכברים שייפתח. יתר על כן, מידת אפנון גן נקבעת על ידי כייל והיעילות של הנגיף. הווירוס צריך להיות מוזרק לאזור הנכון באמצעות קואורדינטות stereotactic, אשר דורש מכשירים מיוחדים. אימות של הזריקה הנכונה יכולה להסתיים רק לאחר המוות.

שיטה זו שימשה בעבר כדי לבדוק את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות נוירולוגיות שונות. לדוגמא, RNAi בתיווך ויראלי מיקוד גן Th (המאפשר דופמין להיות מסונתז) הוזרק לcompacta nigra substantia, וניתוח ההתנהגות של התנועה נערך. ¹⁰ מחקר נוסף המשמש להזרקת stereotactic של DISC1 השתקת lentivirus להעריך התנהגות עכבר ביחס לסכיזופרניה. מציאה של DISC1 הובילה לתנועה מוגברת בתגובה לחידוש (סימפטומים הקבלות חיוביים בסכיזופרניה), וחוסר תנועה גדולה יותר בFST. ¹¹ כמו כן, מחקר נוסף מצא כי ביטוי יתר של 5-HT _1B הוביל להתנהגות גישוש עלתה בOFT, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ נוגד חרדה בשיטה זו. ¹² זריקות stereotactic יכולות לספק וירוס cre לגרום רקומבינציה בעכברי cre-loxP . שיטה זו שימשה למחוק את קולט Y2 באמיגדלה וגרעין המיטה של ​​terminalis stria סלקטיבי. על ניתוח התנהגות, עכברים אלה נמצאו פנוטיפ אנטי-דיכאון כאשר הגן נמחק באמיגדלה המרכזית, אבל אין פנוטיפ כאשר הגן נמחק באמיגדלה basolateral או גרעין המיטה של terminalis stria. ¹³ כך, טכניקה זו מספק כלי ייחודי כדי לחקור את ההשפעה הגנטית על התנהגות בעלי חיים.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים היו במעקב בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת פנסילבניה, # IACUC 44,057

1. Lentivirus הפקה

הערה: היום לפני transfection, LentiX-293 תאים צריכים להיות בconfluency 80%.

1. יש לשטוף את תאים עם DMEM רק לפני transfection דגירה ב 10 מיליליטר של DMEM / 10% FBS עם פניצילין (100 IU / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 דקות ב RT.
2. לדלל DNA וPolyethylenimine (PEI) (1 מ"ג / מיליליטר) ב 1: 3 יחס (1 מיקרוגרם של ה- DNA: 3 μl של PEI) ב 1 מיליליטר של DMEM ומערבולת דקות 1. הנפח של ה- DNA הוסיף תלוי בריכוז של ה- DNA. לדגור על RT במשך 10 דקות.
   1. לדוגמא, השתמש 20 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א, מורכב של 10 מיקרוגרם של פלסמיד וקטור, 5 מיקרוגרם של פלסמיד psPax2 ^14, 5 מיקרוגרם של וירוס stomatitis שלפוחי (VSV) עם 60 μl של PEI לכל צלחת.
3. מערבבים את ה- DNA ופתרון PEI שוב על ידי vortexing דקות 1. לדגור על RT במשך 10 דקות.
4. הוסף 1 / נפח 10 של מדיום התרבות הכולל של DMEM (כלומר 1 מיליליטר למדיום תרבות 10 מיליליטר בצלחת 100 מ"מ). הוסף 1 מיליליטר של ירידת תערובת DNA-PEI על ידי ירידה לתוך הצלחת ולערבל את הצלחת סביב עד למדיום התרבות הוא גם מעורב עם ה- DNA.
5. דגירה של 6 שעות ב RT ולהסיר את supernatant. הוסף 5 מיליליטר של מדיום התרבות.
6. 48 שעות לאחר transfection, לאסוף supernatant וספין נגיפיים ב627 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס בשפופרת 50 מיליליטר. סנן 30 מיליליטר של supernatant ויראלי דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לצינור ultracentrifuge.
7. מוסיף מים סטריליים כדי לאזן את הצינורות, ולכסות את הצינורות עם חתיכה קטנה של parafilm. צינורות ספין ב11249 XG במשך 120 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר נוזלי באמצעות קצה ואקום.
8. להוסיף של PBS הקר 100 μl הצינור. נער בעדינות את הצינור על 4 מעלות CO / N.
9. מחדש להשעות, לא פיפטה וירוסהוא PBS הוסיף בשלב 1.8 על גלולה 10 פעמים, נזהר שלא לגעת בכדור עם הקצה. גלולה לא מחדש תלויה עד זה הוא מוחלט.
10. Aliquot הווירוס ב10-20 μl לכל צינור, הבזק-הקפאה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C.

2. הזרקה stereotactic

2.1) הכנה של מכשירים

1. הנח זוג מספריים, מלקחיים בוטה-סוף, בעל מחט, אזמל, צמר גפן, ובד בחבילה אטומה עם מחוון עיקור, וחיטוי לפני הניתוח. בנוסף, להשיג 10% יוד povidone, 70% אתיל אלכוהול, תפרים נספגים, כרית חימום, דמעות מלאכותיות, מעקר זכוכית חרוז, תרגיל, מקדח, 2 מזרקים חד פעמי, מזרק להזרקה, מכונת גילוח חשמלי, משכך כאבים (ketoprofen), הרדמה (Avertin), כפפות, ומנגנון stereotactic עם משאבת הזרקה.
2. הפוך 1.25% פתרון Avertin טרי באותו יום, מסנן במנדף סטרילי באמצעות 0.2 &181 #; מ 'מסנן מזרק סטרילי, ואת המקום לתוך בקבוקון סרום סטרילי. מערבבים 2.5 גרם של אלכוהול 2,2,2-tribromoethyl לתוך 5 מיליליטר של אלכוהול טרט-אמיל, אז לפזר ב200 מיליליטר מים. שמור את ה- pH מתחת 5. ¹⁵

2.2) הכנת העכבר

1. לנהל Avertin מבוסס על המשקל של העכבר (375 מ"ג / קילוגרם). ¹⁵ להזריק את העכבר עם Avertin באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP), ולאחר מכן למקם חזרה לכלוב שלה עד בהרדמה מלאה.
2. תן לשיכוך כאבים באמצעות הזרקת IP (ketaprofen, 5 מ"ג / קילוגרם), ומקום דמעות מלאכותיות על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות.
3. ודא שהעכבר הוא ישן באופן מלא על ידי צובט את רגלם. אם העכבר מגיב לקמצוץ הרגל, ואז לתת יותר הרדמה (במינונים של 50 μl). לגלח את הראש של העכבר באמצעות סכין גילוח חשמלי. לגלח את האזור שמסביב לאזור שיופעל על (בדרך כלל מרק מאחורי האוזניים, לחלק העליון של החוטם), ו.
4. הנח אותי העכברn כדי מנגנון stereotactic. תפס השיניים הקדמיות על המהדק הקדמי, ולהוריד את המהדק ולהדק אותו כך שהלסת היא מאובטחת באופן מלא.
5. הכנס את הברים האוזן לתוך תעלת האוזן כדי לייצב את הראש באופן מלא. היזהר שלא להכניס את הברים אוזן ברחוקה מדי, שעלול לגרום נזק לאוזן הפנימית. ברגע שסיים, הגוף של העכבר צריך להיות מסוגל להעביר מעט מבלי לשבש את עמדתו של הראש.
6. הנח כרית חימום מתחת לעכבר כדי לווסת את טמפרטורת הגוף של העכבר לאורך כל ההליך.
7. נקה את אזור הניתוח ביסודיות. באמצעות מקלון צמר גפן, למרוח 10% יוד povidone בתנועה מעגלית, החל מאמצע האתר כירורגית ונע כלפי חוץ. לאחר מכן, השתמש מקלון צמר גפן לשפשף 70% אתיל אלכוהול באתר כירורגית באותו אופן. חזור על שתי פעמים.

2.3) ראשית החתך

1. ברגע שהעכבר הכין, לפתוח את תיק ציוד סטרילי. כפפות שינוי לפני touching המכשירים. קח את בד סטרילי ולמקם את המכשירים על הבד. אם כל מכשיר נוגע במשטח בלתי-סטרילי, להשתמש במעקר חרוז הזכוכית במשך 15 שניות כדי לעקר אותה.
2. קח האזמל במלקחי יד ובוטה סוף הדומיננטיים ביד הלא הדומיננטית. השתמש במלקחיים הבוטה-הסוף לעדינות אחיזת העור של העכבר, ולעשות חתך באמצעות האזמל. בגין החתך כ -1.5 סנטימטרים מעל האוזניים (לכיוון האף) ולהאריך לכ -0.5 סנטימטרים מתחת לאוזניים. להאריך את החתך אנכי באמצע ראשו של העכבר כדי לחשוף את גבחת (איור 1).
3. ברגע שהיא דמיינה גבחת, קח טיפ גפן סטרילי כדי להסיר כל דם מכסה את פני השטח של הגולגולת בעדינות. השתמש בשני טיפים כותנה לדחוף את העור כלפי הצד של הראש.

2.4) התקנת ציוד

1. אחרי כל דם הוא להסיר את פני השטח של הגולגולת, וגבחת ברורה דמיין, להכין את המזרק (קוןcentration של 10 ⁸ TU / מיליליטר, נפח של μl 1). במנדף, למלא את המזרק עם הווירוס להיות מוזרק. ודא שאין בועות בפנים. מניחים את המזרק במנגנון stereotactic, כדי לוודא שהוא מאובטח באופן מלא.
2. לאט לאט להוריד את המזרק עד שהוא ממש מעל פני השטח של הגולגולת, כך שקצה מחט מזרק סטרילי מוגדר לצומת של גבחת וקו interaural. קבע שלב זה כאפס, ולקבוע את קואורדינטות מנקודה זו.
3. בהתאם לאזור המוח של עניין, להשתנות קואורדינטות stereotactic. לקבוע קואורדינטות אלה על ידי שימוש באטלס מוח ^4. ברגע שהקואורדינטות נקבעות, להזיז את המחט של המזרק כדי להתאים קואורדינטות אלה. מקד את הרכס המשונן באמצעות הקואורדינטות: M / L = +/- 1 מ"מ, / P = -1.82 מ"מ. מנמיכים את המחט לימין מעל לגולגולת לדמיין איפה החור צריך להיות קדח.
4. להעלות את המזרק מעט, לקחת את התרגיל ואת המקום דו התרגילימין לא מעל אתר קידוח היעד בכ -45 מעלות זווית לגולגולת. בגין קידוח, ולשמור על קידוח עד הגולגולת נותנת דרך. כאשר הגולגולת נותנת דרך, ניתן להבחין בירידה בהתנגדות. היזהר שלא לקדוח לתוך המוח, כדי למנוע נזק בקליפת המוח.
5. קח טיפ גפן סטרילי ולמחות כל דם מהחור.
6. מנמיכים את המזרק כך שהקצה יושב ממש על פני השטח של המוח (לא הגולגולת). הגדר את / D V לתאם (עומק) ל0. תחתון המזרק לעומק הרצוי, המבוסס על קואורדינטות אטלס המוח. כדי להגיע לרכס המשונן, D / V מוגדר -1.79 מ"מ.
7. התחל ההזרקה בשיעור של 0.2 μl / דקה. צפה כדי להבטיח שהמזרק לא יחליק נמוך מהעומק הרצוי. במקרה זה, בעדינות להעלות את המזרק לעומק הרצוי שוב.
8. לאחר ההזרקה נגמרה, לחכות כ -2 דקות על מנת להבטיח שנקלט כל וירוס שיורית. לאט לאט להעלות את המזרק ולהשתמש קצה כותנה כדי להסיר כל liפאונד מאתר ההזרקה.
9. חזור לחץ הכדור השני.

2.5 תפירה)

1. הסר את התפר ומחט סטרילית מהאריזה ואחיזתה המחט באמצעות מחזיקי המחט. להתמודד עם הקצה המחודד של המחט מבעל המחט. החזק את המלקחיים הבוטה-הסוף ביד הלא הדומיננטית, ולהשתמש בו כדי אחיזת העור בעכבר. התחל עם היד הדומיננטית.
2. דחף בעדינות את התפר דרך העור ולהשתמש במלקחיים הבוטה-הסוף לתפוס את העור בצד השני של החתך האחר. משוך את חומר התפר דרך עד 0.75 אינץ 'על נשאר.
3. לשחרר את המחט, ולהשתמש במלקחיים הבוטה-הסוף לעטוף את התפר סביב זמן בעל מחט אחת, ולאחר מכן, לתפוס את התפר שנותר 0.75 אינץ 'עם בעל המחט, ולמשוך את התפר דרך, כך שבעל המחט ומחט בסופו של בצד של הראש הפוך לזה שהם היו במקור. זה אמור ליצור קשר.
4. חזור על שלב זהעוד שלוש פעמים, לסירוגין בצד של ראש בעל המחט בסופו בכל פעם.
5. חותך את התפר ולחזור על צעדים 2.5.1-2.5.3 עד החתך נסגר.

2.6) טיפול שלאחר ניתוח

1. הוצא בעדינות את הברים אוזן מהעכבר, ולהסיר את לסתו מהמהדק הקדמי.
2. שמור את העכבר על כרית החימום עד שמתעורר ונע סביב בכוחות עצמו. לפקח העכבר יומי, ולשמור ועין על סימנים של כאב, כמו לא טיפוח, אכילה או שתייה. תן לשיכוך כאבים נוספים כאשר הכרחי.

מבחן שדה פתוח 3.

3.1) הגדרה

1. להשיג כיכר ריקה, זירת פלסטיק עם ממדים של 50 סנטימטרים X 50 סנטימטרים, עם חומות גבוהות 50 סנטימטר (אבל יכול להיות מעט גדול יותר). נקה את הזירה עם 70% אתיל אלכוהול לפני תחילת הניסוי. ודא אתיל האלכוהול התייבש לחלוטין לפני הצבת עכבר לזירה.
2. מניחים את הזירה ברצפה, ולנסות להבטיח התאורה מוגדרת כדי למזער צללים ובוהקים.
3. אם אתם משתמשים בתוכנת מעקב, מקם את המצלמה ישירות מעל לשדה הפתוח, כ 1.5 רגל מעל השדה הפתוח (מספיק רחוק כדי להקיף מלא כל הזירה, אבל קרוב מספיק כדי לקבל תצוגה ברורה של העכבר).
4. הגדר את האזור במרכז התיבה (כ שטח של 30 סנטימטרים X 30 סנטימטרים). ¹⁶ להגדרת אזור, לחץ על כרטיסיית אזור 1 בלוח הצד.
   1. בחר מתאר צורה בפנל העליון, ומתאר למתחם של אזור המרכז. בחר להוסיף אזור, ולחץ על החלק הפנימי של אזור המרכז. שימוש בהנחיות התכנית, שם האזור (זה יהיה מכונה 'מרכז' לנוהל זה). אם בדיקת ההתנהגות תהיה הבקיע ביד, לוודא את החלק התחתון של השדה מחולק ל- 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים ריבועים, מסומן באמצעות קלטת.
5. להגדיר את התוכנה כך שההגדרות נכונות, והעכבר הוא בקלות Visible על המסך. להשיג זאת על ידי התאמת הגדרות זיהוי במחשב כדי להיות תואם עם זירת הבדיקות (תאורה) וצבע עכבר.
   הערה: כאשר ההגדרות נכונות, המערכת צריכה לעקוב רק העכבר, ולא כל צללים או שתן / צואה. הגדרות התוכנה הספציפיות תלויות בתאורה של הזירה, ואת הצבע של העכבר.

3.2) הסתגלות ומבחן

1. הזז עכברי ניסוי לשעת חדר 1 התנהגותיות לפני הבדיקה על מנת להסתגל לסביבתם. השאר את העכברים בכלוב שלהם להסתגלות.
2. הפעל את המצלמה לקלטת המשימה התנהגותיות ולמקם את העכבר לכיוון חזית אמצע הזירה כך שהעכבר עם הפנים לקיר.
3. הגדר את השעון במשך 5 דקות, ולהתרחק מהזירה. במידת האפשר, לצאת מהחדר כדי לא להשפיע על העכבר בטעות.
4. ברגע 5 דקות הן למעלה, להסיר את העכבר ולמקם אותם בכלוב שלהם.
5. השתמש 70% אתיל אלכוהול כדי לנקות ביסודיות את השדה לפני שתמשיך לעכבר הבא. ודא אתיל האלכוהול התייבש לחלוטין.

3.3) ניקוד

1. קחו למשל את העכבר כמו להיות במרכז השדה, כאשר כל ארבע כפות נמצאות בתוך 30 סנטימטרים X 30 סנטימטרים באמצע.
2. לכמת את כמות הזמן שמבלה את העכבר במרכז. לחלופין, לקבוע זמן זה באמצעות תוכנת מעקב (כגון ethovison Noldus).
   1. כדי לעשות זאת, ללכת ללשונית הניתוח, ולחץ על "תנועה" בפרופילי ניתוח. מחק את הקטגוריות מוגדרות כעת, ולאחר מכן בחר "באזור" בכרטיסייה המיקום. בחר את אזור המרכז. בשלב הבא, בחר באפשרות "פלט ניתוח" (תחת לשונית תוצאות) לצפייה בתוצאות. טבלה המפרטת את המשך הזמן נייח עבור כל ניסוי אמור להופיע.
3. אחרת, תוצאת OFT ביד. השדה הפתוח צריך להיות ריבועי 25 10 סנטימטרים X 10 סנטימטרים המפורטים בחלק התחתון של אופשדה n (כפי שמתואר בשלב 3.1.3). לכמת את כמות הזמן שמבלה את העכבר במרכז, בנוסף למספר הכניסות למרכז הזירה. ¹⁶
   הערה: 30 סנטימטרים X 30 סנטימטרים אזור המרכז נחשבת למרכז של השדה הפתוח. עכבר נחשב מאכלסים את אזור המרכז אם כל ארבע כפות נמצאות בתוך אזור סנטימטרים 30 x 30.

מבחן לשחות בכפייה 4.

הערה: אפשר מינימום של חמישה ימים בין משימות התנהגותיות.

4.1) הגדרה

1. להשיג דלי ברור 2 L, ולמלא עם 22 מעלות צלזיוס מים. מניחים את הדלי על שולחן, ולנסות להבטיח התאורה מוגדרת כדי למזער צללים ובוהקים.
2. אם אתם משתמשים בתוכנת מעקב, מקם את המצלמה ישירות מעל לדלי.
3. הגדר את התוכנה כך שהעכבר הוא בקלות גלוי על המסך.

4.2) הסתגלות ומבחן

1. הזז עכברי ניסוי לro ההתנהגותאום שעה 1 לפני הבדיקה להסתגל לסביבה. השאר את העכברים בכלוב שלהם להסתגלות.
2. הפעל את המצלמה לקלטת המשימה התנהגותיות. בעדינות, מניח את העכבר באמצע דלי מים. ודא שלא שחרר את העכבר ב. לאט לאט להוריד את העכבר, כך שכפות רגליו הקדמיות לגעת במים הראשונות. לטפל כדי למנוע את ראשם מההצללה.
3. הגדר את השעון ל -6 דקות, ולהתרחק מהאזור התנהגותיות.
4. ברגע 6 דקות הן למעלה, להסיר את העכבר מהדלי, ולנגב את עודפי מים לפני הצבת העכבר לכלוב שלהם.

4.3) ניקוד

1. אם אתם משתמשים בתוכנת מעקב, להגדיר חוסר תנועה אחוזים ל -11%, כפי שהוצע על ידי Noldus (זה צריך להיות הגדרת ברירת המחדל), לכמת זמן צף לעומת שחייה.
2. כדי לכמת באמצעות מערכת המעקב, עבור לכרטיסיית הניתוח, ולחץ על תנועה תחת פרופילי ניתוח. מחק את הקטגוריות מוגדרות כעת, ולאחר מכן בחר מדינת ניידות, בבצד הלוח השמאלי (בהתנהגות פרט). הגדר חוסר תנועה עד 11%.
3. בחר הדמיה מסלול, תחת לשונית התוצאות. בחר פלט ניתוח (תחת לשונית תוצאות) לצפייה בתוצאות. טבלה המפרטת את המשך הזמן נייח עבור כל ניסוי אמור להופיע.
4. אם יד ניקוד, למדוד את זמן העכבר מבלה חייה או טיפוס, וכמות הזמן שמבלה את העכבר נייח. בנוסף, למדוד את זמן האחזור לנייח בפעם הראשונה. ראה איור 2 בסעיף תוצאות.

תוצאות

הזרקת stereotactic מדויקת מסתמכת במידה רבה על הגדרת הקואורדינטות הנכונות. קצה המחט המשמשת להזרקת הווירוס צריך להיות מוגדר באופן ישיר על הצומת של גבחת וקו interaural (איור 1). זה מועיל להשתמש סטראו כדי לברר אם או לא המחט ממוקמת כראוי. כאשר מסתכלים מבעד למיקרוסקופ, המח?...

Discussion

זריקות stereotactic מוצלחות מסתמכות על שלושה גורמים: שמירה על העכבר בחיים, הגדרת נקודת האפס הנכונה לקואורדינטות (קצה המחט בצומת של גבחת וקו interaural), וקביעת העומק הנכון לנקודת האפס (קצה המחט רק נגיעה החיצונית של רקמת המוח). הכדאיות של עכברים היא חשובה. הישרדות ניתוח יכולה להסת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder