Применяя Стереотаксическая техника инъекций по изучению генетических эффектов на животных Поведения

Резюме

Стереотаксической инъекции лентивирусы выражения кДНК или shRNAs может модулировать экспрессию генов в определенных областях головного мозга мышей. Здесь мы приводим протокол для объединения стереотаксические инъекции с поведенческими задач, таких как тест открытого поля (УДК) и принудительного плавания Test (ФСТ).

Аннотация

Стереотаксической инъекции полезный метод, чтобы доставить высокий титр лентивирусы целевых областей мозга у мышей. Лентивирусов можете гиперэкспрессией или нокдаун экспрессии генов в относительно целенаправленного области без значительного ущерба для ткани головного мозга. После выздоровления, вводят мыши могут быть проверены на различных поведенческих задач, таких как тест открытого поля (УДК) и принудительного плавания Test (ФСТ). УДК предназначен для оценки движения и тревожный фенотип у мышей путем измерения количества времени, которое тратит мыши в центре нового открытом поле. Более тревожно мыши провести значительно меньше времени в центре нового поля по сравнению с контролем. ФСТ оценивает анти-депрессивный фенотип путем количественного определения количества времени, что мыши, провести неподвижными, когда помещается в ведре воды. Мышь с анти-депрессивной фенотипа будет тратить значительно меньше времени неподвижности по сравнению с контрольными животными. Цель этого протокола заключается в использовании СТЕРЕОeotactic инъекции лентивирусом в сочетании с поведенческие тесты, чтобы оценить, как генетические факторы, модулировать поведение животных.

Введение

Мышь была широко используется в области нейробиологии, потому что это легко манипулировать генетически. Методы генной нокаутом позволит исследователям изучить, как каждый генетический фактор формирует поведение мыши. Кроме того, CRE-LoxP система обеспечивает ценный инструмент для ткане и клеточной специфической для данного типа гена нокаут у мышей, который позволяет исследователям изучать функцию генов в различных тканях. ¹ Тем не менее, на практике, выражение закономерности CRE промоутеров трудно контроля , и до сих пор многие известные драйверы CRE не достигли выражение для конкретного региона. ^2,3

Кроме того, стереотаксической инъекции метод, который нацелен на определенные регионы мозга взрослой мыши. Вводя генетически вирусы, экспрессирующие кДНК или shRNA, конкретного региона модуляции экспрессии гена может быть достигнуто. Хотя размер мозг каждой мыши изменяется, расположение конкретных областей мозга может быть определена с использованием стереотаксической коорнат установить с достопримечательностями на черепе головного мозга мыши. Наиболее часто используемые ориентиры брегма, лямбда, и Interaural линии. Использование координаты, полученные от головного мозга атласа, ⁴ точное местоположение каждой области мозга можно определить по передне-задней (/ P), медиального-боковой (M / L), и спинной-вентральной (Д / В) осей от брегма / Interaural линии пересечения. Обычно вирусы вводили в мозге мышей с тегами или красным или зеленым флуоресцентным белком (GFP или RFP), так что инъекции могут быть подтверждены с помощью флуоресцентной микроскопии.

Поведенческие оценки мышей особенно необходимы для фундаментальных исследований психических расстройств. Симптомы психических расстройств у пациентов, как правило, связаны аномальное поведение. Некоторые из этих поведения человека эволюционно консервативными и могут быть непосредственно подражал и наблюдается у мышей. Например, депрессия может быть смоделирована в мыши путем измерения поведения отчаяние. Люди с депрессией OFTан чувствовать, как будто ничего не делают никогда помочь, а симптом, который может в конечном счете привести к самоубийству. У грызунов, это может быть смоделирована с помощью принудительного плавания Test (ФСТ), который измеряет количество времени, мышь плавание против плавающей в бассейне с водой (рассматривается как отказ от). Это парадигма подтверждено спасение фенотип с антидепрессантов. ^7,8,9 мышей, которые получили антидепрессанты будут тратить значительно меньше времени неподвижно по сравнению с необработанными управления. Другой поведенческий тест, тест открытом поле (УДК) предназначен для оценки передвижения у мышей, и дополнительно может быть использован для анализа тревожный фенотип у мышей. ^5,6 Этот тест основан на предпосылке, что мыши чувствуют себя безопаснее, когда они близки к стене в романе открытом поле. Мышей дикого типа, в конечном счете изучить новой среде, так как они любопытные животные. Тем не менее, тратить меньше времени в центре поля указывает тревогу у мышей, а мыши не смогут преодолеть Первол страх, вызванный новой среде. Беспокойство мыши, а количественно по количеству времени, проведенного в центре открытом поле, можно сравнить с клинической тревоги у человека, который присутствует во многих психических расстройств.

Сочетание стереотаксических инъекций с поведенческими парадигмами является новым способом изменения экспрессии конкретного гена в целевой области мозга. Эффект экспрессии гена модулированного на поведение мыши могут быть определены. В отличие от всей нокаутом мозга, этот метод особенно полезен, поскольку он только цели конкретных областей мозга. Кроме того, стереотаксических инъекции, как правило, выполняется в взрослых мышей дикого типа, следовательно, выражение эндогенный ген был сохранен на протяжении стадий развития. Этот метод позволит избежать посрамить силу, если ген необходим для выживания во время эмбрионального или послеродовой стадии развития. Одним из основных ограничений является то, что экспериментальные мыши нужно идти через вч инвазивной хирургии, в котором черепа мышей должны быть открыты. Кроме того, степень генной модуляции определяется титром и эффективностью вируса. Вирус должен быть введен в правильном регионе, используя стереотаксические координаты, которая требует специальных инструментов. Проверка правильной месте инъекции может быть завершена только посмертно.

Этот метод был ранее использован для тестирования участия конкретного гена в различных неврологических заболеваний. Например, вирусные РНК-интерференции опосредовано ориентации гена Th (дофамина, который позволяет быть синтезированы) вводили в черной субстанции компактов и анализа поведения опорно-двигательного аппарата проводилось. ¹⁰ Другое исследование используется стереотаксической инъекции в лентивирусов глушителей DISC1 оценить поведение мыши по отношению шизофрении. Нокдаун DISC1 привели к увеличению передвижения в ответ на новизну (параллели положительные симптомы шизофрении), и больше неподвижность вФСТ. ¹¹ Точно так же, дополнительные исследования обнаружили, что 5-НТ _1В экспрессия привело к увеличению исследовательского поведения в OFT, в соответствии с анти-тревога фенотипа с использованием этого метода. ¹² Стереотаксические инъекции могут доставить вирус CRE, чтобы побудить рекомбинации в CRE-LoxP мышей , Этот метод был использован для селективного удаления рецептор Y2 в миндалине и постельное ядро ​​терминальной полоски. При поведенческого анализа, эти мыши были обнаружены анти-депрессивной фенотипа, когда ген был удален в центральной миндалине, но не фенотип, когда ген был удален в базолатеральной миндалине или кровати ядра терминальной полоски. ¹³ Таким образом, этот метод обеспечивает уникальный инструмент для изучения генетического влияния на поведение животных.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: За всеми протоколы с участием животных в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными из Университета штата Пенсильвания, IACUC # 44057

1. Лентивирус Производство

ПРИМЕЧАНИЕ: день до трансфекции, LentiX-293 должен быть в 80% слияния.

1. Промыть клетки с DMEM перед трансфекции и инкубируют в 10 мл DMEM / 10% FBS с пенициллином (100 МЕ / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Развести ДНК и полиэтиленимина (PEI) (1 мг / мл) в соотношении 1: 3 (1 мкг ДНК: 3 мкл PEI) в 1 мл DMEM и вихря в течение 1 мин. Объем ДНК добавили зависит от концентрации ДНК. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
   1. Например, можно использовать 20 мкг плазмидной ДНК, состоящую из 10 мкг векторной плазмиды, 5 мкг плазмиды psPax2 ^14, 5 мкг вируса везикулярного стоматита (VSV) с 60 мкл на чашку PEI.
3. Смешать ДНК и PEI решение снова встряхиванием в течение 1 мин. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Добавить 1/10 объема общей культуральной среде DMEM (т.е. 1 мл культуральной среды для 10 мл в 100 мм блюдо). Добавить 1 мл ДНК-PEI капли смеси по капле в блюдо и встряхните блюдо вокруг, пока в культуральную среду не хорошо смешивается с ДНК.
5. Инкубировать в течение 6 ч при комнатной температуре и удалить супернатант. Добавьте 5 мл культуральной среды.
6. 48 ч после трансфекции, собирают вирусный супернатант и вращение на 627 мкг в течение 5 мин при 4 ° С в 50 мл пробирку. Фильтр 30 мл вирусной супернатанта через шприцевой фильтр 0,45 мкм в ультрацентрифужную пробирку.
7. Добавить стерильную воду, чтобы сбалансировать трубы и покрытия труб с небольшой кусочек парафильма. Спин трубки на 11249 мкг в течение 120 мин при 4 ° С. Удалить жидкость, используя вакуумный наконечник.
8. Добавить 100 мкл холодного PBS трубки. Осторожно покачайте трубу на 4 ° CO / N.
9. Для вновь приостановить вирусов, пипетки тон PBS добавляют на стадии 1.8 на пеллетных 10 раз, стараясь не прикасаться к гранул с наконечником. Осадок не будет повторно приостановлено, пока это не является полным.
10. Алиготе вирус на 10-20 мкл на пробирку, вспышка замораживания в жидком азоте и хранят при -80 ° С.

2. стереотаксической инъекции

2.1) Подготовка инструментов

1. Поместите ножницы, тупой конец пинцетом, держатель иглы, скальпели, ватные тампоны, и ткань в запечатанном пакете с индикатором стерилизации, и автоклав до операции. Кроме того, получить 10% повидон йод, 70% этиловый спирт, рассасывающиеся швы, грелку, искусственные слезы, стеклянная бусина стерилизатора, дрель, сверло, 2 одноразовые шприцы, шприц для инъекций, электрическая бритва, обезболивающее (кетопрофен), анестетик (Авертен), перчатки и стереотаксической аппарат с ТНВД.
2. Сделайте 1,25% Avertin решение свежий, что день, фильтр в стерильных капот, используя 0,2-# 181; м стерильный шприц фильтр, и поместите в стерильную пробирку в сыворотке крови. Смешайте 2,5 г 2,2,2-трибромэтил спирта в 5 мл трет-амилового спирта, а затем растворить в 200 мл воды. Держите рН ниже 5. ¹⁵

2.2) Подготовка Mouse

1. Администрирование Авертен в расчете на массу мыши (375 мг / кг). Вводят ¹⁵ мышь с помощью Avertin внутрибрюшинно (IP) инъекции, а затем поместить обратно в клетку, пока полностью под наркозом.
2. Дайте обезболивающее через IP инъекций (ketaprofen, 5 мг / кг), и место искусственные слезы на глазах мыши, чтобы предотвратить высыхание.
3. Убедитесь, что мышь полностью спит, зажимая их ноги. Если мышь реагирует на ноги крайнем случае, а затем дать больше анестетика (в дозах 50 мкл). Бритье головы мыши с помощью электрической бритвой. Бритье область эксплуатироваться на (как правило, от просто за уши, чтобы в верхней части морды), и его окрестностями.
4. Поместите I мышиNto стереотаксической аппарата. Задвижка передние зубы на переднем зажиме, и опустите зажим и затяните его так, что челюсть полностью безопасным.
5. Вставьте уха баров в ушной канал, чтобы полностью стабилизировать голову. Будьте осторожны, чтобы не вставить наушники бары слишком далеко, что может привести к повреждению внутреннего уха. После завершения, тело мыши должны быть в состоянии перенести немного, не нарушая положения головы.
6. Поместите грелку под мышкой, чтобы регулировать температуру тела мыши в течение всей процедуры.
7. Очистите хирургическое области тщательно. Использование ватным тампоном, втирать 10% повидон йод в круговом движении, начиная с середины хирургического сайта и перемещение наружу. Затем, используя ватный тампон, чтобы протереть 70% этиловый спирт на операционном сайте в таким же образом. Повторите два раза.

2.3) Первый разрез

1. После того, как мышь нацелен, открыть стерильную сумку оборудования. Изменение перчатки, прежде чем Тоучинг инструменты. Выньте стерильный ткань и положите инструменты на ткани. Если какой-либо инструмент касается ООН-стерильную поверхность, использовать бисер стерилизатор на 15 сек стерилизовать.
2. Возьмите скальпель в доминирующую руку и тупой конец пинцетом в не доминантной рукой. Используйте тупым концом пинцета осторожно сцепление кожи мыши, и сделать надрез с помощью скальпеля. Начните разрез около 1,5 см выше ушей (к носу) и распространяется на около 0,5 см ниже ушей. Расширьте разрез вертикально посередине головы мыши, чтобы выставить брегмы (Рисунок 1).
3. После брегма визуализируется, взять стерильную кончик хлопок нежно удаления крови, покрывающие поверхность черепа. Использование двух подсказки хлопка, чтобы подтолкнуть кожу к стороне головы.

2.4) Настройка оборудования

1. После любой крови удалена от поверхности черепа и брегма четко визуализируются, подготовить шприц (CONцентрация 10 ⁸ ТУ / мл, объем 1 мкл). В вытяжном шкафу, заполните шприц с вирусом, который будет введен. Убедитесь, что нет пузырей внутри. Поместите шприц в стереотаксической аппарат, убедившись, что он надежно.
2. Медленно опустить шприц, пока она не находится прямо над поверхности черепа, так что кончик стерильной иглой шприца установлен на пересечении темени и межушной линии. Установите этот пункт в качестве нуля, и определить координаты с этой точки.
3. В зависимости от области мозга интерес, варьировать стереотаксические координаты. Определите эти координаты путем использования мозга атлас ^4. После того, как координаты определяются, переместить иглу шприца в соответствии эти координаты. Цель зубчатой ​​извилины, используя координаты: M / L = +/- 1 мм, / Р = -1,82 мм. Опустите иглу в правой выше черепа визуализировать, где отверстие должно быть просверлено.
4. Поднимите шприц немного, взять дрель и сверла разместить бит непосредственно над буровой целевой при температуре около 45 ° углом к ​​черепу. Начните бурение, бурение и держать до тех пор, пока череп уступает. Когда череп уступает, падение сопротивления могут быть обнаружены. Быть осторожным, чтобы не просверлить в мозг, таким образом, чтобы предотвратить разрушение коры.
5. Возьмите стерильную кончик хлопок и вытрите кровь из отверстия.
6. Опустить шприц так, чтобы кончик находится прямо на поверхности мозга (не черепа). Набор D / V координат (глубина) до 0. Нижний шприц на нужную глубину, на основе координат атлас мозга. Для достижения зубчатой ​​извилины, набор D / V, чтобы -1,79 мм.
7. Начало впрыска со скоростью 0,2 мкл / мин. Смотрите, чтобы гарантировать, что шприц не скользит ниже требуемой глубины. Если это происходит, слегка поднять шприц на желаемую глубину снова.
8. После инъекции закончен, подождите около 2 минут, чтобы убедиться, что любой остаточный вирус был поглощен. Медленно поднимите шприц и использовать наконечник хлопок для удаления Лисущностей из места инъекции.
9. Повторите для другой полушарии.

2.5) Наложение швов

1. Выньте стерильный шовный материал и иглы из упаковки и сцепление иглу, используя иглодержатели. Лицо заостренный край иглы от держателя иглы. Держите тупым концом щипцов в не доминантной рукой, и использовать его для захвата кожу мыши. Начните с доминирующей рукой.
2. Аккуратно надавите на шов через кожу и использовать тупым концом щипцов, чтобы захватить кожу на другой стороне разреза. Потяните шовный материал через примерно до 0,75 дюйма не остается.
3. Отпусти иглы, и использовать с тупым концом пинцета, чтобы обернуть нить вокруг иглодержателя одно время, то, захватить 0,75-дюймовый оставшиеся шов с держателем иглы и вытяните нить через, так что иглы и иглодержатель в конечном итоге на стороне головки, противоположной той, которую они первоначально были на. Это должно сформировать узел.
4. Повторите этот шагеще три раза, чередуя стороны головы держатель иглы заканчивается на каждый момент времени.
5. Отрежьте нить и повторите шаги 2.5.1-2.5.3 до разрез закрыт.

2.6) Послеоперационный уход

1. Аккуратно снимите ушные баров от мыши и снимите его челюсть от переднего зажима.
2. Держите мышь на грелку, пока он не проснется и движется вокруг самостоятельно. Монитор мыши в день, и держать глаза и за признаками боли, например, не холить, еды или питья. Дайте дополнительную обезболивающее при необходимости.

3. Откройте Тест поле

3.1) Настройка

1. Получить пустой квадрат, пластиковые арену размеры 50 см х 50 см, 50 см высокими стенами (но может быть чуть больше). Очистить арену с 70% этилового спирта до начала эксперимента. Убедитесь, этиловый спирт полного высыхания перед установкой мыши на арену.
2. Поместите арену напол, и стараемся, чтобы освещение так, чтобы минимизировать тени и блики.
3. При использовании программное обеспечение для отслеживания, установите камеру прямо над головой в открытом поле, примерно в 1,5 футов над открытом поле (достаточно далеко, чтобы полностью охватить весь арене, но достаточно близко, чтобы иметь четкое представление о мыши).
4. Настройка зоны в центре коробки (примерно на площади 30 см х 30 см). ¹⁶ Чтобы установить зону, нажмите на вкладке зона 1 на боковой панели.
   1. Выбор формы контур в верхней панели, и контур периметра центральной зоне. Выберите добавить зону, и нажмите на внутренней центральной зоне. Используя программу подсказкам, назвать зону (это будет называться как «центра» для этой процедуры). Если поведенческий тест будет забито вручную, убедитесь, что нижняя часть области разделена на 10 см х 10 см квадратов, отмеченные с помощью ленты.
5. Установите программное обеспечение, так что настройки верны, и мышь легко VisiБле на экране. Достижения этой цели путем корректировки параметров обнаружения на машине, чтобы быть совместимым с испытательной арене (освещение) и цвета мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если настройки верны, система должна отслеживать только мышь, а не каких-либо теней или мочи / фекалий. Конкретные настройки программного обеспечения зависит от освещения арены, и цвет мыши.

3.2) Акклиматизация и испытания

1. Перемещение экспериментальных мышей в поведенческой номер 1 ч до испытания для того, чтобы акклиматизироваться их к своему окружению. Оставить мышей в их клетке для акклиматизации.
2. Включите камеру, чтобы ленты поведенческие задачи и место мышь к средней перед ареной, так что мышь лицом к стене.
3. Установите таймер в течение 5 мин, и шаг в сторону от арены. Если возможно, оставьте номер для того, чтобы случайно не влиять на мышь.
4. После того, как 5 мин вверх, снимите мыши и поместите их в клетку.
5. Используйте 70% этиловый спирт, чтобы тщательно очистить поле, прежде чем перейти к следующему мыши. Убедитесь, этиловый спирт полного высыхания.

3.3) Подсчет

1. Рассмотрим как мышь в центре области, когда все четыре лапы внутри среднего 30 см х 30 см.
2. Определения количества времени мышь тратит в центре. Кроме того, определить, на этот раз с помощью отслеживания программного обеспечения (например, Noldus ethovison).
   1. Чтобы сделать это, перейдите на вкладку анализа и нажмите на кнопку "движения" в профилях анализа. Удалить категории в настоящее время установлен, а затем выберите "в зоне" на вкладке местонахождения. Выберите центральную зону. Далее, выберите "Выход" (анализ на вкладке результатов) для просмотра результатов. Таблица с перечнем время провел неподвижным каждое испытание должно появиться.
3. В противном случае, забить часто вручную. Открытое поле должно быть 25 на 10 см х 10 см квадраты, описанные в нижней части УПМРп поле (как указано в пункте 3.1.3). Определения количества времени мышь тратит в центре, в дополнение к количеству записей в центре арены. ¹⁶
   ПРИМЕЧАНИЕ: центр 30 см х 30 см район считается центром открытом поле. Мыши рассматривается как населяющих центральную область, если все четыре лапы находятся внутри области см 30 х 30.

4. Тест принудительного плавания

ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте минимум пять дней между поведенческими задач.

4.1) Настройка

1. Получить 2 L четкое ведро, и залейте 22 ° C воды. Поместите ведро на столе, и стараемся, чтобы освещение так, чтобы минимизировать тени и блики.
2. При использовании программное обеспечение для отслеживания, установите камеру прямо над головой в ведро.
3. Настройка программного обеспечения, так что мышь легко видны на экране.

4.2) Акклиматизация и испытания

1. Перемещение подопытных мышей в поведенческой роом 1 час до начала испытания, чтобы акклиматизироваться в окрестностях. Оставить мышей в их клетке для акклиматизации.
2. Включите камеру на ленту поведенческих задач. Аккуратно поместите курсор в середине ведро воды. Убедитесь, чтобы не уронить мышь в. Медленно опустите мышь, так что его передние ноги касаются воды в первую очередь. Позаботьтесь, чтобы предотвратить их голову от погружения.
3. Установите таймер на 6 минут, и шаг в сторону от области поведения.
4. После того, как 6 мин вверх, снимите мышь из ведра, и протрите излишки воды до размещения мышь обратно в их клетке.

4.3) Подсчет

1. При использовании отслеживания программного обеспечения, установите процентов неподвижность до 11%, как это было предложено Noldus (это должно быть по умолчанию), для количественной оценки времени плавающей против купания.
2. Для количественной оценки с использованием системы слежения, перейдите на вкладку анализа, и нажмите на движение под профилями анализа. Удалить категории в настоящее время установлен, а затем выберите мобильности состояние, налевой боковой панели (под индивидуального поведения). Установите неподвижность до 11%.
3. Выберите трек визуализации, на вкладке результатов. Выберите выход анализа (на вкладке результатов) для просмотра результатов. Таблица с перечнем время провел неподвижным каждое испытание должно появиться.
4. Если руки скоринга, измерить время мышь тратит плавание или скалолазание, и количество времени, затрачиваемое мыши неподвижны. Кроме того, измерения задержки в первый раз неподвижной. Смотрите рисунок 2 в разделе Результаты.

Результаты

Точная стереотаксической инъекции в значительной степени опирается на установки правильные координаты. Кончик иглы, используемой для введения вирус должен быть установлен непосредственно на пересечении брегмы и межушной линии (рис 1). Это полезно использовать стереомикр...

Обсуждение

Успешные стереотаксических инъекций полагаться на трех факторах: сохранение мышь жив, установив правильный нулевую точку для координат (кончик иглы на пересечении брегмы и межушной линии), и установив правильный глубину до нулевой точки (кончик иглы просто прикасаясь к наружной повер...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder