תאי תיוג ותיווך ויראלי השתלה של המדיאלי ganglionic רוממות (MGE) ל<em&gt; In vivo</em&gt; לימודים

Summary

אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפזר, לפתח וsynaptically להשתלב קליפת מארח לאחר השתלה. ניתן transduced תאים אלה בקלות לפני ההשתלה ללימודי in vivo של מבשרי GABAergic מהונדסים גנטי. כאן, אנו מציגים טכניקות תיוג נגיפיות למקד תת-קבוצות interneuron ספציפיות באמצעות קווי Cre קיימים וכתבי Cre-תלויים.

Abstract

interneurons GABAergic קליפת המוח, הנגזרת מהמדיאלי העוברית והוד הזנב ganglionic (MGE וCGE), היא מבחינה תפקודית ומורפולוגית מגוונת. אחיזה נעשתה בהבנת התפקידים של תת-קבוצות שונות בקליפת המוח interneuron, עם זאת, עדיין יש מנגנונים רבים יש לעבד שעשויה לתרום להתפתחות והתבגרות סוגים שונים של תאי GABAergic של. יתר על כן, איתות GABAergic שינתה עשויה לתרום לפנוטיפים של אוטיזם, סכיזופרניה ואפילפסיה. קווי Cre-נהג ספציפיים החלו לעטוף את הפונקציות של תת-קבוצות interneuron ייחודיות. למרות ההתקדמות במודלים של עכברים, לעתים קרובות קשה ללמוד אבות interneuron קליפת המוח GABAergic ביעילות עם גישות מולקולריות in vivo. טכניקה חשובה אחד משמשת ללמוד תכנות האוטונומי התא של תאים אלה היא השתלה של תאי MGE לקליפת מוח מארח. תאים מושתלים אלו נעים בהרחבה, להבדיל,nd תפקודי לשלב. בנוסף, תאי MGE ניתן transduced ביעילות עם lentivirus מייד לפני ההשתלה, ומאפשרים למספר רב של גישות מולקולריות. כאן אנו פירוט פרוטוקול לtransduce תאי MGE ביעילות לפני ההשתלה לניתוח in vivo, באמצעות קווי Cre-נהג זמינים ווקטורי ביטוי Cre-תלויים. גישה זו יש יתרון משום שהוא משלב מניפולציה גנטית מדויקת עם היכולת של תאים אלה לפיזור לאחר השתלה, מאפשר רזולוציה מסוימת תאים מסוג גדולה יותר in vivo.

Introduction

interneurons קליפת המוח GABAergic מהווה ~ 20-30% מתאי עצב שבקליפת המוח של היונקים, ואילו השאר מתאים לגירוי, הנוירונים עיקריים glutamatergic. Interneurons מגוונת מאוד בנכסים, האקסון אלקטרו ומורפולוגיה דנדריט והסינפטי מיקוד ^1, וחוסר איזון בטון מעכב / מעורר הם שיערו לבסיס כמה פנוטיפים של הפרעות נוירו-פסיכיאטריות / נוירולוגית כוללים אוטיזם, סכיזופרניה ואפילפסיה ^2. המטרה הכוללת של הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא לספק אמצעים לשנות ביעילות גנטית אבות interneuron קליפת המוח GABAergic לפני ההשתלה לin vivo ניתוחים.

interneurons קליפת המוח GABAergic נולדות בהוד המדיאלי וזנב ganglionic (MGE וCGE, בהתאמה) ^3,4, כמו גם את אזור הקדם-האופטי התיכון ^5. אבות interneuron קליפת המוח עוברים הגירה משיקה למרחקים ארוכים ואחריעל ידי הגירת רדיאלי להגיע ליעדים הסופיים שלהם. עם הגעה ליעדים שלהם, interneurons קליפת המוח אלה חייבת בצורה נכונה להשתלב ברשת העצבית הקיימת, וכל תת-קבוצה interneuron ייחודית תתרום למעגלים בקליפת המוח בדרכים מסוימות. ניתן להבחין בארבע קבוצות עיקריות על ידי סמנים מולקולריים: סומטוסטטין נגזר MGE (SST) ⁺ וparvalbumin (PV) ⁺ תת-קבוצות, ופפטיד נגזר CGE vasoactive מעיים (VIP) ⁺ וReelin ^+; SST ^- תת-קבוצות ^6. תת-קבוצות שונות בקליפת המוח interneuron נולדות על זמנים שונים במהלך התפתחות עוברית ובMGE ^{7 CGE, 8.} אלה וסמני interneuron אחרים בקליפת המוח GABAergic כבר השתמש כדי ליצור קווי Cre-נהג ספציפיים עבור רבים מתת-קבוצות אלה ^9-11.

ההשתלה של תאי אב MGE התפתחה כטיפול מבוסס תאי פוטנציאל לטיפול בהפרעות שעלולות להיגרם על ידי חוסר איזוןבעירור / עיכוב ^12-24. יתרונות טיפוליים אלה עשויים להיות נובעים בחלקו את היכולת הייחודית של אבות MGE (לפיזור, להבדיל ולהשתלב במוח מארח), או שעלול להיות בגלל פרי גופני רב PV ⁺ תאים מעכבים נגזרים מMGE. תאי MGE יכולים להיות גם transduced מהירות וביעילות עם lentiviruses לפני ההשתלה ^15, המאפשרים לתאים שעברו שינוי גנטי במבחנה כדי להיחקר in vivo. הרציונל לפיתוח גישה זו היה להתגבר על מחסומים בלימוד פיתוח GABAergic קליפת המוח interneuron והתבגרות. בפרט, השתלת MGE אפשרה לחוקרים ללמוד את התפתחותם של תאים שעברו מוטציה in vivo, כאשר עכבר המוטציה אחרת היה מת בנקודת זמן מוקדמת. יתר על כן, על ידי החדרת גנים של עניין לפני ההשתלה, את ההשפעות של גנים ספציפיים על פנוטיפ מוטנטי יכולות להיות מוערכים בEFFאופן icient.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לtransduce תאי MGE עם lentiviruses לפני ההשתלה. בנוסף, אנו מראים כיצד טכניקה זו ניתן להתאים להביע גן של עניין בתת-קבוצות interneuron ספציפיות מקבוצה הטרוגנית של מבשרי interneuron קליפת המוח, באמצעות שילוב של lentiviruses הביטוי Cre תלוי וקווי עכבר Cre-נהג זמינים. יתר על כן, פרוטוקול זה מציג טכניקות ופלטפורמה לחוקרים לשנות גנטי מבשרי interneuron קליפת המוח GABAergic לin vivo מחקרים בדרך ייחודית. אחד יתרונות של שיטה זו על פני גישות שוטפות אחרות הוא שהתאים המושתלים MGE יתפזרו מאתר ההזרקה. כמו כן, בניגוד לזריקות נגיפיות מוקד, לאחר תאי MGE לפזר המורפולוגיה שלהם קלה יותר להעריך. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של החדרת גנים של עניין לסוג בר או תאים שעברו מוטציה, מציג סוג תא מסויםכתב להעריך מורפולוגיה, או שעלול להיות כדי לחקור את ההשפעה של אללים מחלה in vivo.

Protocol

הצהרת אתיקה: ההליכים הבאים אושרו על ידי פרוטוקול המוסד ובעלי החיים שלנו. הקפד לקבל אישור לכל הנהלים הקשורים ניתוחי הישרדות לפני תחילת ניסויים ולאמת את כל הפרוטוקולים מעודכנים.

1. Lentivirus הכנה (שלב אופציונאלי)

1. לפצל שלוש 10 צלחות סנטימטר של תאי HEK293T עבור כל lentivirus להתבצע, בנוכחות 10 מיליליטר DMEM / 10% FBS, ולגדול ל~ מפגש 60-70%. לגדל תאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
2. Transfect פלסמידים הבאים DNA (10 מיקרוגרם כולל) לכל צלחת שימוש בכל מגיב transfection: 6.4 מיקרוגרם וקטור lentiviral CAG-Flex-GFP (רצף וקטור DNA הניתנים בטבלה 1), 1.2 מיקרוגרם pMD2.G (מקודד VSV-ז), 1.2 מיקרוגרם pRSV-Rev, ו -1.2 מיקרוגרם pMDLg / pRRE. שלושה וקטורי אריזת lentiviral זמינים מסחרי (טבלה
   הערה: גישה מסוימת זו משתמשת lentivir דור ה -3וקטורי וקטורי אל אבל דור 2 ופלסמידים הקשורים גם יעבדו.
3. הכן מיכל פסולת המכיל פתרון אקונומיקה 10% בתוך מכסה המנוע BSL2 מוסמך כדי להשבית כל פתרונות או מכשירים שיצרו קשר עם או מכילים lentivirus. בשלב הבא, להסיר לחלוטין את התקשורת 4-6 שעות לאחר transfection לפתרון אקונומיקה, להחליף עם אותו הנפח של המדיה חדשה, ולאפשר לתאים לגדול.
4. לאחר 4 ימים, לאסוף מדיה לתוך צינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי XG ב 1000 במשך 15 דקות עד גלולה כל פסולת תא. בשלב הבא, לסנן supernatant דרך קרום 0.45 מיקרומטר. כל מסנן מחייב חלבון נמוך, כמו PVDF, עובד היטב. זהירות: מקום שתי פסולת נגיפית מוצקה ונוזלית לתוך תמיסת אקונומיקה.
5. 30 מיליליטר העומס מסונן supernatant לתוך צינורות ultracentrifuge ולultracentrifuge. צנטריפוגה ב100,000 XG במשך 2.5 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. פתח את צינורות צנטריפוגה בברדס BSL2 ולהסיר supernatant לBleach 10%. הוספה של PBS ~ 100 μl לPEllet, אשר מניב titers של 1x10 ^ 7-8 יחידות / מיליליטר זיהומיות. Aliquot היום והחנות הבאים ב -80 ºC. aliquots Lentivirus יציב ב -80 ° C לשישה חודשים לפחות.
6. עכשיו יש לי רבות מוסדות ליבות ויראלי: שיקול חשוב. לרכוש נגיף מרוכז עם כייל מינימום של 1x10 ⁷ מיליליטר / יחידות זיהומיות, לתוצאות אופטימליות.

2. עכברים תורמים לMGE Dissection

1. ראשית, להגדיר את הזדווגות מתוזמן בין קו Cre להביע עניין וגם עכבר סוג בר (WT) או עכבר שיבטא כתב לאחר רקומבינציה בתיווך Cre.
   הערה: קווי Cre-נהג רבים transgenics ומתוחזקים וגדלו במדינת hemizygous. לפיכך, רק מחצית מהעוברים תכיל את גן Cre. ניתן להכין DNA במהירות מהעוברים לPCR קצר כדי לזהות אלל Cre. אז יכולים להיות שנקטפו Cre ⁺ העוברים כך רקמות MGE רק של הגנוטיפ הרצוי משמשת. משתנvely, ניתן להשתמש בכתב Cre תלוי, כדי לבחור את העוברים לנתיחה MGE והשתלה.
2. לחשב באיזה יום יהיה מתאים לE13.5. אם בעלי החיים היו לזווג הערב לפני, ביום של התוספת הוא 0.5. עכברים להזמין בעתו בהריון או נשים WT עם גורי P1 כדי זמן שלאחר הלידה (P) 1 עכברים ביום הרקמות התורמות תהיה E13.5. לחלופין, להגדיר הזדווגויות אלה בבית בשבוע שלפני זיווג בעלי החיים תורם אחד.
   הערה: האסטרטגיה לשעבר של יצירת שני E13.5 ועוברי P1 / גורים לאותו היום היא לעתים קרובות קשה לעשות באופן מהימן.

3. הכנת מדיה, כלים וציוד.

1. הכן את חומרים כימיים וכלים להכנת MGE תא (טבלה 2).
   1. הכן משטח נקי ומניח את מלקחיים נקיים, מספריים וגם סכין מייקרו או מלקחיים עדינים (לנתיחה רקמה מדויקת) על פני השטח.
   2. הכן תמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS), fאו לנתיחה, ובינוני של הנשר שונה של Dulbeco (DMEM) עם 10% הסורם שור עוברי (FBS), עבור התמרה.
   3. Preincubate 20-30 מיליליטר DMEM / 10% FBS בתרבית רקמת חממת 37 ° C כ 1 שעה. המכסה צריך להיות משוחרר כדי לאפשר חילוף גזים ואיזון pH של התקשורת.
      הערה: preincubation התקשורת יכול להיות מוכן רק לפני תחילת הניתוח.

4. תא MGE הכנה

1. להקריב את העכבר בהריון על פי פרוטוקול שאושר על חיה ולהסיר את העוברים לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה HBSS קר כקרח.
2. הסר את המוח מכל עובר באמצעות היקף ניתוחים (לעשות אחד בכל פעם, והשאיר את שאר העוברים בHBSS קר כקרח) ולאחר מכן להמשיך לחתוך את רקמת MGE.
   הערה: מפורט להלן, ובאיור 1, הם שלבים עיקריים המראים כיצד להסיר את MGE. בנוסף, איור 2 הוא סרט המציג את כל הנתיחההליך.
   1. מקם את המוח עם צד הגחוני פונה כלפי מעלה (איורים 1 א, '). הערה: זה גם בסדר שיהיה לי היבט הגב פונה כלפי מעלה. חותך את המוח במחצית לאורך מטוס saggital ליצור שתי חתיכות. מוח דוגמא התפצלה לפתע מוצג (1B דמויות, ב '), שם לב שגב (הקליפה שמעליה) והיבטי הגחון של כיסוי המוח ומקיף את רקמת רוממות ganglionic (GE).
   2. בשלב הבא, עם יד דומיננטית, להחזיק או מלקחיים עדינים מאוד או stabknife (טבלה 2), ואילו לשתק חצי הכדור עם מלקחיים שנערכו על ידי יד הלא דומיננטית. (ההיבט המדיאלי של האונה צריך לפנות כלפי מעלה). פתח את הגב ורקמת הגחון עם מלקחיים וסכין לדקור כדי לחשוף את הרקמה הבסיסית GE (איור 1 ג ונתח באיור 1 ג ').
      הערה: הסרת חלק מאמצעי תקשורת מצלחת פטרי לנתיחה יכולה לעשות את זה קל יותר לייצב את הרקמות תוך PErforming נתיחת MGE.
   3. לבצע חתכים ישרים עם stabknife או מלקחיים בסדר להפריד CGE, LGE ורקמות במחיצה (חתכי דוגמא לראות כונה על ידי אדום קווים מקווקווים, איורים 1D ו- D "). קיצוצים אלה יכולים להתבצע בכל סדר.
      הערה: תארו לעצמכם MGE כ'תיבה 'שנחתכה מהרקמה הסובבת. בכך אעזור לreproducibly לבצע קיצוצים דומים לכל נתיחה, ובכך להקטין שונות ובניתוחי רקמה.
   4. לבסוף, להפוך את MGE על צידו וחתוך את החלק התחתון (מה שהיה הצד הלטרלי של המוח). זה מסיר את אזור המעטפת של MGE (להשליך ב1E דמויות ו1E ') משאר MGE. ההיבט הנותר של MGE מכיל אזור בעיקר חדרית ומנות אזור subventricular של MGE, המכיל כמעט את כל התאים MGE. להמשיך ברקמה זו.
3. שיקול חשוב: התוספת של ג'ל סיליקון לתחתית ca צלחת פטריn לשמש כמשטח לנתיחה מעולה כפי שהוא מגן על טיפים העדינים של מלקחיים ומספק משטח רך לתולה רקמה עם מלקחיים.

4.3 אסטרטגיות נוספות לMGE Dissection.

1. חותך את העור של העובר באמצעות מלקחיים כמו מספריים כדי להסיר את המוח במהירות. כעובר מניח בצד שלה, מחזיק את הרקמה בבסיס של הראש עם המלקחיים המשמשים לעגן את הרקמה. ראשית, לחתוך קדמי הגחון למוח והאחורי הגחון למוח, ולאחר מכן לחבר את שני חתכים לאורך הצד של העובר. אז לתפוס את קפל עור ולמשוך אותו מעל החלק העליון של המוח. המוח אז יכול להיות גזור משם במהירות מהרקמות שנותרו.
2. לחלופין, לעגן את החלק האחורי של המוח כולו מאחורי הקליפה. בינתיים, לתפוס כל חצי הכדור בהיבט הזנב הגב ביותר של קליפת המוח ולקרוע את הקליפה מן הרקמה המעוגנת בכיוון קדמי. בדרך זו, שני גortices ניתן להסיר והוד ganglionic דו-צדדי מתגלה, עדיין מחובר לשאר רקמות שמירה על האנטומיה המדיאלי-הצדדית.
3. החלף ל דקירת הסכין לבצע חתכים מדויקים סביב MGE בכל חצי הכדור. השתמש באחת סט נפרד נקי של מלקחיים כדי לאסוף את MGE או פיפטה עם טיפ גדול (כלומר., P1000).
   הערה: שמור על הרקמות שנאספו מכל החומר האחר הגזור, כחלק מאמצעי התקשורת היא בלתי נמנעת כאשר הועברה MGE נאסף.
4. לאסוף את MGE ולשים את הרקמה לתוך 1.5 מיליליטר צינור אוסף המכיל FBS / 10% DMEM, (נפח של 500 μl מספיק כדי לאסוף את MGEs). חזור על פעולה עבור חץ הכדור השני והמקום באותו צינור האיסוף. שמור על דגימות קרח עד שכל הרקמה שנאספו.

5. תיוג lentiviral והשתלות

1. הזז את הצינורות של רקמת MGE למכסה מנוע BSL2 מוסמכת ולהסיר את המדיה.
   הערה:רקמת MGE היא גדולה מספיק כדי להיות גלוי לעין, ויישב לחלק התחתון של הצינור המאפשר התקשורת הקרה להיות להסיר בקלות ובעדינות.
2. להוסיף ~ 500 ul של תקשורת DMEM / 10% FBS, שהיה preincubated בחממה תרבות 37 ° C רקמות. לאחר מכן, להוסיף polybrene כדי להקל על התמרה על צינור אחד בריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מיליליטר. Triturate רקמות MGE ליצור השעיה תא בודדת, באמצעות קצה פיפטה P1000. לבסוף, להוסיף ~ 15-20 μl של lentivirus המרוכז לכל צינור.
3. שיקול חשוב: טחינה דקה של 10-12 פעמים היא מספיק כדי לשבור את רקמת MGE מעובר אחד, אבל יותר triturations עשוי להידרש אם MGEs מרובה הם אספו יחד. נסה את תנאי טחינה דקה שונים כדי לקבוע מה עובד הכי טוב.
4. באופן מאובטח לסגור צינור אחד, להפוך לערבב, מאשר מקום כל הצינורות בחממה 37 ° C. דגירה התאים בlentivirus לפחות 30 דקות ועד שעה 1. פעמים יותר הביאו לדהכדאיות תא מקומטות. להפוך את הצינורות כל 10 דקות עד שהזמן הוא למעלה.
5. לאחר הדגרה עם lentivirus, להסיר את הצינורות מהחממה וצנטריפוגות ב ~ 700 XG במשך 3 דקות עד גלולה התאים. בשכונה BSL2, להסיר את supernatant וזורקים לאקונומיקת 10%. לאחר מכן, להוסיף 1 FBS / 10% מיליליטר DMEM וtriturate גלולה 2-3 פעמים כדי לשטוף, אז צנטריפוגות שוב באותה המהירות לגלולת התאים. חזור על לשטוף את הצעד הזה 2-3 פעמים יותר כדי להסיר וירוס עודף.
   הערה: בצע את השלבים צנטריפוגה ב 4 ° C, לעומת זאת, כדאיות מופחתת לא נצפתה כאשר ספינים קצרים מבוצעים בRT.
6. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר תקשורת האפשרית ולשים את כל צינור על קרח. עקב תקשורת שיורית על הצדדים של הצינור, ~ 2-3 μl של תקשורת יהיה בסופו מכסה את התא גלולה בזמן הליך ההשתלה החל.

6. השתלה ואישור ב

1. לרכוש גורי P1 מארח ולהכין את ההליךאזור על ידי ריסוס למטה עם 70% אתנול. כדי לשמור על סטריליות במהלך ההליך מומלץ לבצע הליכים אלה בחדר הליך נקי ייעודי. בנוסף, השתמש באחד כלים כירורגיים autoclaved לעקר משטחים שהגורים יהיו במגע עם שימוש באתנול 70%. דוגמא של ציוד נציג הדרושים לביצוע ההשתלות ואזור הליך נציג מוצגת באיור 3.

שים לב: בעוד הליך זה הוא הזרקה של כמויות קטנות, ולא הליך כירורגי שיחייב חתך, פצע או תפרים פתוחים, הוא עדיין מומלץ שmicropipette חדש משמש עבור כל עכבר להיות מוזרק. Micropipettes הוא חום מעוקר כאשר משכו ומשופע על משטח שרוסס עם אתנול 70% מאוחסנים במכל אטום.

1. צור micropipettes יש קוטר בקצה בין 40-80 מיקרומטר. בעקבות הממדים הללו יניבו אופטימלייםתוצאות. חום לעקר את micropipettes כאשר משך ומשופע על משטח ולרסס עם אתנול 70% לפני אחסון micropipettes במכל אטום.
   הערה: לחלופין, אם גישה להתקנים הדרושים כדי ליצור המחטים האלה (טבלה 2) מגבילה, להשתמש בכל מכשיר הזרקה אחר. עם זאת, אלה לא יכולים להיות גם מתאימים כמו micropipettes בשל קטרים ​​שונים.
2. צייר את שמן מינרלים לתוך מזרק 1 מיליליטר, ועם מחט G 30 1/2, למלא את פיפטה הזכוכית לחלוטין עם שמן מינרלים. בשלב הבא, הר הבוכנה על מכשיר stereotaxic, לאחר מכן לצרף את פיפטה הזכוכית למכשיר ועומס stereotaxic על הבוכנה. שימוש בכונן ההידראולי, להזיז את הבוכנה בערך באמצע הדרך לתוך פיפטה הזכוכית, הסרת שמן מינרלים שנשפך החוצה עם מגבת נייר נקייה נקייה.
   1. לחלופין לבאמצעות מזרק, להטביע את הקצה האחורי של פיפטה בשמן מינרלים ומלאים על ידי פעולת נימים. כדי למנוע בועות אוויר בpipettדואר, לשמור על לחץ חיובי על המזרק עד לחלוטין מחוץ לפיפטה הזכוכית.
      הערה: התקנים אחרים יכולים לשמש להשתלה בהצלחה תאי MGE ^14. כל מכשיר שיכול לספק נפח קטן או ליד 100 עבודות nl גם להליך זה.
3. בשלב הבא, להשתמש במגבת סטרילית נייר, או כל חומר סופג, עם הפינה התעקמה נקודה עדינה כדי להסיר בעדינות תקשורת עודפת מעל התא גלולה MGE. צעד זה מרכז את צפיפות התאים, כך שיכולים להיות מושגת כרכי הזרקה קטנות יותר. בשלב הבא, להשתמש בנפח נמוך (P2 הוא מועדף) פיפטה לצייר לאט התא גלולה וtriturate 1-2 פעמים לפני שעברת את ההשעיה התא על גבי משטח הידרופובי. הנפח צריך להיות ממש מתחת 1 μl. הזז את קצה המחט לתוך ההשעיה התא ושימוש בכונן ההידראולי, להכין את ההשעיה התא לתוך פיפטה.
4. לטשטש גור P1 באמצעות היפותרמיה (לעטוף בכפפות לטקס ולשים על קרח ~ 2-4 דקות).בדוק ליעילות של הרדמה עם גירוי מזיק. לצבוט את העור בין האצבעות עם מלקחיים בסדר: הגור צריך להיות מגיב אם צבט. לאחר מכן, למקם את הגור על עובש שהוא תחת מכשיר ההזרקה, אז להפוך את העור המתוח על ידי משיכת בחזרה את העור על הראש והאבטחה עם קלטת מעבדה סטנדרטית.
   שים לב: בעוד היפותרמיה היא יעילה מאוד בעכברים ותוצאות בשיעור תמותה נמוך בילוד, חייבים להיעשות במהירות נהלים, כגורים יתחילו להתאושש בתחת 10 דקות. בנוסף, 4 דקות על קרח היא גבול עליון של מה שיכול להיות נסבל. נסה לגרום להיפותרמיה רק ​​פעם אחת אם נדרש זמן רב יותר לזריקות. עם זאת, אם גור מתאושש מוקדם, תאפשר ראשון הגור להתאושש באופן מלא לפני גרימת היפותרמיה שוב. יתר על כן, רק לגרום להיפותרמיה עוד פעם אחת כדי לבצע זריקות. גורים יתאוששו בתוך 5-10 דקות של היפותרמיה. זה ניתן להקל על ידי הצבת את הגורים עם המלטה ואמא או על ידי הצבת את הגור בsurfac חםדואר להתאושש.
5. שימוש במכשיר stereotaxic, מקם את קצה פיפטה הזכוכית על פני השטח על ראשו של הגור, בניצב למשטח של הראש. כאשר פיפטה היא במגע עם הראש, לשקול את זה כ'0 '. בשלב הבא, לדחוף את פיפטה דרך פני השטח של העור והגולגולת לתוך הקליפה, לאחר מכן הכנס ולחזור פיפטה ~ 2 פעמים לפני הפסקה. לאופטימלי מיקוד של תאים לתוך הניאוקורטקס, זריקות מבוצעות כאשר micropipette הוא בעומק של 0.1 מ"מ. עם זאת, זה צריך להיות מותאם על ידי המשתמש (ראה הערה בהמשך).
   שים לב: בעוד עומק זה אמין מטרות שכבות neocortical עמוק יותר עם המכשירים שתוארו לעיל, כמה עומקים צריכים להיבדק נקבעו באופן אמפירי. בנוסף, מגוון רחב של מעמקים בעמדת rostro- הזנב וMedio-הרוחב שונה צריך להיבדק כדי לקבוע מה עומק הוא אופטימלי בכל אתר. כמו כן, לנקב הראשוני צריך להיות מהיר, כמו חדירה איטית להניאוקורטקס מפחיתה את יכולת גleanly לחדור את הרקמה. נסה מהירויות שונות בעת ההפעלה הראשונה בהליך זה כדי למצוא את מה שעובד הכי טוב. בנוסף, לקואורדינטות בדיקות, אין תחליף אמיתי לשימוש בתאים שכותרתו, כמו צבעים היו לא אמינים כדי לציין מיקום.
6. ברגע שהמחט נמצאת בעמדה, לסובב את המכשיר ההידראולי לקדם את הבוכנה לתוך פיפטה הזכוכית, דוחף סט נפח של השעיה תא לתוך הקליפה. הזרק 50-70 NLS לכל אתר. חזור על תהליך זה ב3-6 אתרים שונים ברמות מקורי, הזנב שונים אם המטרה היא להשיג פריסה רחבה של תאים בכל הניאוקורטקס.
   הערה: כרכים של 100 NL או יותר יכולים לגרום לנגעים ולהוביל לגושים גדולים של תאים מוזרקים שאינם מצליחין להעביר ביעילות מאתר ההזרקה. לפיכך, כרכי הזרקה קטנים יותר (~ 70 NL או פחות) הם אופטימליים, על אתרים נוספים, אם היתרי זמן.
7. כאשר זריקות הושלמו, להסיר את הגור מהבמה ולסמן אותו (גזיר בוהן הוא דרך אמינה כדי לזהות את pעליות בהמשך). ברגע שהגור התאושש והוא מסוגל לנוע בכוחות עצמו (זה מתרחש תוך דקות של הסרת אותם מהבמה), החזיר אותו עם אמא וגורים.
   הערה: מכיוון שמדובר בהליך זעיר-פולשני אין נהלים לאחר ניתוח פעם אחת את הגור נע בחופשיות וחימם. עם זאת, יש לבדוק גורים לא רק לאחר ההליך, אלא גם ביום שלמחרת כדי להבטיח שאין להם סימנים של הידרדרות במצב בריאות.
8. לפני שתתחיל בהליך על הגור הבא, לרסס את האזור עם 70% אתנול כדי לשמור על אזור עבודה סטרילית. לאפשר לגורים מוזרקים לפתח ולאחר מכן להעריך את הרקמה בשלב התפתחותי המתאים (ים).

תוצאות

מאז יש לי תאי MGE היכולת הייחודית להעביר ולשלב כאשר הושתלו הניאוקורטקס מארח ^16, שהם מספקים מערכת מודל מצוינת למניפולציה גנטית לפני מחקרי in vivo. במסמך זה, אנו מראים כיצד ניתן לבודד את רקמת MGE מעוברי E13.5 (איורים 1 ו -2), אשר לאחר מכן ניתן transduced עם lentiviruses או

Discussion

השימוש של מבשרי interneuron קליפת המוח GABAergic מהוד ganglionic העוברי (GES) לטיפולים בתאים מבוססים מראה הבטחה למצבים רבים ^{12 -1 4.} יש צורך בטכניקות מולקולריות מדויקות כדי לעקוב אחר, ולהביע את הגנים של עניין בתת-קבוצות interneuron ספציפיות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתיוג תאים עוב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler		made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil		Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene