대한 바이러스 성 매개 라벨링 및 내측 신경절 예하의 이식 (MGE) 세포<em&gt; 생체</em&gt; 연구

요약

GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구 세포는 이식 후 호스트 피질에 통합 시냅스 개발하고, 분산. 이 세포는 쉽게 유전자 변형 GABA 성 전구 물질의 생체 내 연구에 이식하기 전에 형질 도입 할 수있다. 여기서 우리는 기존 Cre 호텔 라인과 Cre 호텔 의존 기자를 사용하여 특정 interneuron 하위 그룹을 대상으로 바이러스 성 라벨링 기술을 보여줍니다.

초록

배아 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE과 CGE)에서 파생 된 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 기능과 형태 학적으로 다양하다. 진출 별개 피질 interneuron 서브 그룹의 역할 이해를 만들어왔다 그러나, GABA 성 세포의 다른 유형의 발달 및 성숙에 기여할 수 손볼 여전히 많은 메커니즘이있다. 또한, 변경 GABA 성 신호는 자폐증, 정신 분열증과 간질의 표현형에 기여할 수있다. 특정 치운다 드라이버 라인은 고유 interneuron 서브 그룹의 기능을 소포 시작했다. 마우스 모델에서의 발전에도 불구하고, 효율적으로 생체 분자 접근법 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 연구하기가 어렵다. 이러한 세포의 세포 자율적 인 프로그램을 연구하는 데 중요한 기술은 호스트 피질에 MGE 세포의 이식이다. 이 이식 된 세포는 분화, 광범위하게 마이그레이션,차 기능적으로 통합 할 수 있습니다. 또한, MGE 세포를 효율적으로 접근 분자의 다수를 허용 이식 직전 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 여기서 사용할 치운다 드라이버 라인과 치운다 의존성 발현 벡터를 사용하여, 세부를 효율적으로 생체 내 이식 분석 전에 MGE 세포를 형질 도입하는데 사용되는 프로토콜 우리. 이 생체 내에서 크 셀형 특정 해상도를 허용하는, 이식 후 세포를 분산시키는 이들의 능력과 정확한 유전자 조작을 결합 때문에이 방법은 바람직하다.

서문

나머지는, 글루탐산 주요 신경 세포를 흥분에 해당하는 동안 GABA 성 대뇌 피질의 interneurons는 포유류의 신피질에 신경 ~ 20 ~ 30 %를 포함한다. 의 interneurons는 전기 생리 학적 특성, 축삭과 수상 돌기의 형태와 ^1을 대상으로 시냅스 매우 다양하고, 흥분성 / 억제 톤의 불균형은 자폐증, 정신 분열증과 ^간질이 포함 신경 / 신경 정신 질환의 일부 표현형의 기초가 가설된다. 본원에 기술 된 프로토콜의 전반적인 목적은 효율적으로 유전자 분석을위한 생체 내 이식 전에 GABA 성 피질 interneuron 전구 세포를 수정하는 수단을 제공하는 것이다.

대뇌 피질의 GABA 성에서의 interneurons는 중간과 꼬리 신경절 eminences (MGE 각각 CGE) ^3,4뿐만 아니라 전핵 지역 ⁵ 태어난다. 두피 interneuron 전구 세포는 장거리 접선 마이그레이션이 다음 받다방사형 마이그레이션에 의해 최종 목표에 도달. 목적지에 도착하면,이 대뇌 피질의 interneurons 올바르게 기존의 신경 네트워크에 통합해야하며, 각각의 고유 interneuron 하위 그룹은 특정 방법으로 대뇌 피질의 회로에 기여할 것이다. 네 가지 주요 하위 그룹은 분자 마커에 의해 구별 할 수 있습니다 MGE 파생 소마토스타틴 (SST) ⁺ 및 parvalbumin (PV) ⁺ 서브 그룹 및 CGE 유래 혈관 활성 장 펩티드 (VIP) ⁺ 및 Reelin ^+; SST ^- 하위 그룹 ^6. 다른 대뇌 피질의 interneuron 하위 그룹이 MGE과 CGE ^{7, 8} 배아 개발하는 동안 서로 다른 시간에 걸쳐 태어난다. 이들과 다른 대뇌 피질의 GABA 성을 interneuron 마커는 이러한 하위 그룹 ^9-11의 많은 특정 Cre 호텔 드라이버 라인을 생성하는 데 사용되었다.

MGE 전구 세포의 이식은 불균형으로 인해 발생할 수 있습니다 질환을 치료하는 잠재적 인 세포 기반 치료로 떠오르고있다^{24 - 12} 여기 / 억제한다. 이 치료 혜택이 많은 근교 체세포 억제 PV ⁺ 세포가 MGE에서 파생 된 (차별화와 호스트 뇌에 통합, 분산), 또는 잠재적으로 있기 때문에 MGE 전구 세포의 고유 기능에 부분적으로 기인 할 수있다. MGE 세포는 시험관 내에서 유 전적으로 변형되어 생체 내에서 세포를 연구 할 수 있도록 신속하고 효율적으로 이식하기 전에 ¹⁵ 렌티 바이러스 형질 도입 될 수있다. 이 방법을 개발하기위한 이론적 근거는 GABA 성 피질 interneuron 개발 및 성숙을 연구하는 장애물을 극복하고자 하였다. 특히, MGE 이식 돌연변이 마우스가 다른 방법으로는 초기 시점에서 사망 할 때 연구팀은 생체 내에서 돌연변이 세포의 개발을 연구 할 수 있었다. 더욱이, 이식 전에 관심 유전자를 도입함으로써, 변이 표현형 특정 유전자의 효과 EFF에서 평가 될 수있다icient 방법.

여기서는 이식 이전에 렌티 MGE 세포를 형질 도입하기 상세한 프로토콜을 제공한다. 또한, 우리는이 기술 치운다 의존성 발현 렌티 가능한 치운다 드라이버 마우스 라인의 조합을 사용하여, 피질 interneuron 전구체의 이종 그룹에서 특정 interneuron 서브 그룹에서 관심 유전자를 발현하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 유 전적으로 독특한 방식으로 생체 내 연구 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체를 수정하려면 또한,이 프로토콜은 기술과 연구자를위한 플랫폼을 소개합니다. 다른 현재의 접근법을 통해이 기술의 장점은 세포 이식 MGE 멀리 주사 부위에서 분산시키는 것이다. 또한, 초점 바이러스 주사와는 달리, MGE 세포가 분산 후 자신의 형태는 평가하기가 쉽습니다. 이 접근법은 특정 세포 유형을 도입, 돌연변이 또는 야생형 세포에 목적 유전자를 도입의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다기자는 생체 내에서 질병 대립 유전자의 효과를 연구하기 위해 잠재적 형태를 평가, 또는합니다.

프로토콜

윤리 문 : 다음 절차는 우리의 기관과 동물의 프로토콜에 의해 승인되었습니다. 실험을 시작하기 전에 생존 수술과 관련된 모든 절차에 대한 승인을 얻을 수 있는지 확인하고 모든 프로토콜이 최신 확인합니다.

1. 렌티 준비 (선택적 단계)

1. 10 ㎖의 DMEM / 10 % FBS의 존재 하에서 제조 될 각 렌티 대해 HEK293T 세포 세 10cm 플레이트를 분할하고, ~ 60 % ~ 70 % 합류로 성장한다. 5 % CO _2와 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포를 성장.
2. 1.2 μg의 pMD2.G이 (VSV-G를 인코딩) 1.2 (표 1에서 제공하는 DNA 벡터 순서) 6.4 μg의 CAG 플렉스-GFP 렌티 바이러스 벡터, 다음 어떤 형질 시약을 사용하여 각 플레이트에 DNA 플라스미드 (10 μg의 총) 형질 μg의 pRSV 반전, 1.2 μg의 pMDLg / pRRE을. 세 렌티 바이러스 벡터를 패키징 시판되고있다 (표
   참고 :이 특정 접근 방식은 3 세대 lentivir을 활용알 벡터하지만 2 세대 벡터 및 관련 플라스미드도 작동합니다.
3. 연락 또는 렌티 바이러스가 포함 된 용액 또는 장치를 불 활성화 BSL2 인증 후드 내에서 10 % 표백제 용액을 함유 폐기물 용기를 준비합니다. 다음으로, 완전히, 표백제 용액에 형질 전환 후 용지를 4-6 시간을 제거 새로운 미디어의 동일한 볼륨으로 대체하고 세포 성장 할 수 있습니다.
4. 15 분은 어떤 세포 파편 펠렛 4 일 후, 1000 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 미디어를 수집합니다. 다음으로, 0.45 μm의 멤브레인을 통해 뜨는을 필터링 할 수 있습니다. 부족한 단백질 결합 필터는 PVDF처럼 잘 작동합니다. 주의 : 표백제로 장소 모두 고체 및 액체 폐기물 바이러스.
5. 로드 30 ml의 초 원심 분리기 튜브에와 초 원심 분리기로 상층 액을 여과. 4 ℃에서 2.5 시간 동안 100,000 XG에 원심 분리기. BSL2 후드에 원심 분리기 튜브를 열고 10 % 표백제에 뜨는을 제거합니다. 체육에 PBS의 ~ 100 μl를 추가1 × ^ 7-8 전염성 단위 / ㎖의 역가를 산출 llet. -80 ºC에서 다음 날 및 저장 나누어지는. 렌티 바이러스 씩 적어도 6 개월 -80 ° C에서 안정적이다.
6. 중요한 고려 사항 : 많은 기관은 지금 바이러스 성 코어를 가지고있다. 최적의 결과를 위해 1 × ⁷ 감염성 단위 / ml의 최소 역가, 농축 바이러스를 획득.

MGE 해부 2. 기부자 마우스

1. 첫째, 관심 Cre 호텔 발현 라인과 야생형 (WT) 마우스 중 하나 또는 Cre 호텔 - 중재 재조합 후 기자를 표현하는 마우스 사이의 시간 제한 짝짓기를 설정합니다.
   참고 : 많은 Cre 호텔 드라이버 라인은 형질 전환하고 유지 hemizygous 상태에서 자란있다. 따라서, 배아의 절반은 Cre 호텔의 형질 전환 유전자를 포함합니다. DNA 신속 Cre 호텔 대립 유전자를 검출하기위한 PCR 단편 배아로부터 제조 될 수있다. 원하는 유전자형 만 MGE 조직이 사용되도록 Cre 호텔 ⁺ 배아 후 수확 할 수있다. 교류 직류vely, Cre 호텔 의존 기자 MGE의 해부 및 이식 배아를 선택, 사용할 수있다.
2. E13.5에 해당되는 일 계산합니다. 동물 전에 저녁을 쌍으로 된 경우, 플러그의 날입니다 0.5입니다. 주문 시간이 초과 임신 쥐 또는 출생 후 (P)을 갖는 시간 순서대로 P1 새끼와 WT 여성 기증자의 조직 E13.5 될 일에 1 마우스. 또한, 기증자 동물 페어링하기 전에 일주 집에서이 교배를 설정합니다.
   참고 : E13.5 및 P1 배아를 모두 생성하는 전 전략 / 같은 날에 대한 새끼가 안정적으로 수행하기가 어렵다.

미디어, 도구 및 장비 3. 준비.

1. MGE 셀 준비 (표 2)의 시약과 도구를 준비합니다.
   1. 깨끗한 표면을 준비하고 표면에 깨끗한 집게, 가위 및 미세 수술 칼이나 미세 집게 중 (정확한 조직 해부)를 배치합니다.
   2. 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)를 준비, F해부하고, 전달 10 % 소 태아 슈어엠 (FBS)와 Dulbeco의 수정 독수리의 매체 (DMEM), 또는.
   3. 약 1 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 Preinc​​ubate 20 ~ 30 ml의 DMEM는 / 10 % FBS를. 뚜껑은 미디어의 가스 교환 및 산도 평형 수 있도록 느슨하게해야합니다.
      주 : 미디어 예비 배양 단지 절개를 시작하기 전에 제조 될 수있다.

4. MGE 셀 준비

1. 승인 동물 프로토콜에 따른 임신 마우스를 희생 빙냉 HBSS를 함유 10cm 페트리 접시에 배아를 제거한다.
2. (한 번에 하나를 얼음처럼 차가운 HBSS에서 배아의 나머지를 떠나)을 해부하여 각 배아로부터 뇌를 제거하고 MGE 조직을 잘라 진행.
   아래에 자세히, 그림 1, MGE를 제거하는 방법을 보여주는 주요 단계는 다음과 같습니다 있습니다. 또한,도 2는 전체를 나타내는 절개 영화이다절차.
   1. (그림 1A, ')를 위로 향하도록 복부 측면과 뇌를 놓습니다. 주 : 등쪽면이 위를 향하도록하는 것도 괜찮습니다. 두 조각을 생성하는 져널면을 따라 반으로 자르고 뇌. 예를 hemisected 뇌는 (그림 1B, B '), 그 지느러미 (상부 피질)과 뇌 커버의 복부 측면을 감지하고 신경절 예하 (GE) 조직을 둘러싸고를받습니다.
   2. 비 지배적 인 손에 의해 개최 집게로 반구을 고정하는 동안 다음, 지배적 인 손으로, 매우 미세한 집게 또는 stabknife (표 2)를 누르고 있습니다. (반구의 안쪽면은 위로 향하도록해야한다). 기본 GE 조직 (그림 1C 그림 1C '에 도시)를 나타 내기 위해 지느러미와 복부 조직 집게와 자상 칼을 펼칩니다.
      참고 : 해부 페트리 접시에서 일부 미디어를 제거하면 쉽게 체육 동안 조직을 안정화 할 수 있습니다MGE의 해부를 rforming.
   3. CGE, LG 전자와 중격 조직을 분리하는 stabknife 또는 미세 집게로 직선 컷 확인 (빨간색으로 표시 참조 예를 인하 점선, '1D와 D도). 이러한 삭감은 임의의 순서로 이루어질 수있다.
      주 : 주변 조직으로부터 잘라 '상자'로 MGE을 상상해보십시오. 이렇게하면 재현성 따라서 조직 해부의 변동성을 줄여, 각 해부 비슷한 컷을 만드는 데 도움이됩니다.
   4. 마지막으로, 옆으로 MGE를 켜고 바닥 (뇌의 좌우 측면 무엇) 떨어져 트림. 이 MGE의 나머지 MGE의 맨틀 영역 (그림 1E 및 1E에 폐기 ') 제거합니다. MGE의 나머지 측면은 주로 심실 영역과 거의 모든 MGE의 전구 세포를 포함하는 MGE의 뇌실 영역 부분을 포함하고 있습니다. 이 조직을 진행합니다.
3. 중요한 고려 사항 : 페트리 접시 캘리포니아의 바닥에 실리콘 겔의 추가이 집게의 섬세한 팁을 보호하고 집게로 조직을 달아 위해 부드러운 표면을 제공하기 때문에 n은 우수한 해부 표면의 역할을한다.

MGE 해부 4.3 추가 전략.

1. 신속하게 뇌를 제거하기 위해 가위처럼 집게를 사용하여 태아의 피부를 잘라. 태아가 옆에 낳는다으로 조직을 고정하는 데 사용되는 집게​​로 머리의 바닥에있는 조직을 보유. 먼저, 뇌 뇌 후방 복부 앞쪽 복부 절단하고 배아의 두 측면을 따라 절단 연결한다. 그리고 피부의 플랩을 잡고 뇌의 맨 위에 당깁니다. 뇌는 신속하게 남아있는 조직에서 멀리 해부 할 수 있습니다.
2. 또한, 피질 뒤에 뇌 전체의 후방 측면을 고정. 한편, 피질의 가장 지느러미 꼬리 측면에서 각각의 반구를 잡고 전방 방향으로 멀리 고정 된 조직에서 피질을 찢어. 이와 같이, 모두 Cortices 제거 할 수 있고, 양자 신경절 eminences 여전히 내측 측방 해부학 보존 조직의 나머지에 부착 드러난다.
3. 자상 나이프로 전환 각 반구에 MGE 주위에 정확한 컷을 확인합니다. MGE 또는 큰 팁 피펫 (예., P1000)를 수집하기 위해 집게 별도의 깨끗한 세트를 사용합니다.
   참고 : MGE가 수집 될 때 일부 미디어가 불가피 전송되면, 다른 모든 해부 물질로부터 멀리 수집 된 조직을 유지합니다.
4. MGE 모아서 DMEM / 10 % FBS를, (500 μL의 부피 MGEs를 수집하기에 충분하다)를 함유하는 1.5 ml의 수집 튜브로 조직을 넣어. 같은 포집 관의 다른 반구와 장소를 반복합니다. 모든 조직이 수집 될 때까지 얼음에 샘플을 유지합니다.

5. 렌티 바이러스 라벨 및 이식

1. BSL2 인증 후드에 MGE 조직의 튜브를 이동하고 용지를 제거합니다.
   참고 :MGE 티슈의 눈으로 확인할 수있는 상태로 냉 매체 쉽고 부드럽게 제거 할 수 있도록 튜브의 바닥에 침전 충분히 큰 것이다.
2. DMEM / 10 % FBS 미디어의 ~ 500 UL을 추가, 그는 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 미리 배양 하였다. 다음에, 8 ㎍ / ml의 최종 농도로 각 튜브에 전달을 용이하게하기 위해 폴리 브렌을 추가한다. P1000 피펫 팁을 사용하여, 단일 세포 현탁액을 만들 MGE 조직을 연화. 마지막으로 각 관에 ~ 집중 렌티 바이러스의 15 ~ 20 μl를 추가합니다.
3. 중요한 고려 사항 : 10 ~ 12 배의 분쇄가 단일 배아 MGE 조직을 파괴하기에 충분하지만, 여러 MGEs 함께 풀링하는 경우 더 triturations이 요구 될 수있다. 가장 적합한 결정하기 위해 다른 분쇄 조건을보십시오.
4. 안전하게 37 ° C 배양기에서 장소보다, 혼합 반전, 모든 튜브를 각 튜브를 닫습니다. 적어도 30 분 동안 1 시간까지 렌티에서 세포를 배양한다. 긴 시간은 드에 성공접혔 세포 생존. 시간이 다 될 때까지 튜브를 10 분마다 전환.
5. 렌티 바이러스 배양 한 후, 세포 펠렛 3 분 ~ 700 XG에 인큐베이터와 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. BSL2 후드에서, 상층 액을 제거하고 10 % 표백제로 폐기합니다. 이어서, 1 ㎖의 DMEM / 10 % FBS를 추가 한 다음, 세척 펠릿 세포 다시 동일한 속도로 원심 분리하여 펠렛을 2-3 회 연화. 초과 바이러스를 제거하기 위해 세척 단계를 2 ~ 3 번 이상 반복합니다.
   참고 : 짧은 스핀이 RT에서 수행 할 때 4 ° C에서 원심 분리 단계를 수행하지만, 감소 가능성은 관찰되지 않았다.
6. 최종 세척 후, 가능한 한 많은 미디어를 제거하고 얼음에 각 튜브를 넣어. 인해 튜브의 측면에 잔류 미디어, 미디어 ~ 2-3 μL는 이식 절차가 시작된 시간 세포 펠렛을 덮는 끝낼 것이다.

6. 이식 및 검증

1. 호스트 P1 새끼를 획득 절차를 준비70 % 에탄올로 아래로 분사하여 지역. 절차를 수행하는 동안 무균 상태를 유지하기 위해서는 전용 청소 절차 룸에서이 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 또한, 사용 중 멸균 된 수술 도구는 새끼는 70 % 에탄올을 사용하여 접촉 표면을 소독한다. 이식 절차와 대표 영역을 수행하기 위해 필요한 장비의 대표적인 예는도 3에 도시된다.

참고 :이 절차는 소량의 주입, 그리고 절개, 아물지 않은 상처 또는 봉합을 필요로 수술이지만, 여전히 각 마우스를 주입하는 새로운 마이크로 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 마이크로 피펫을 뽑아 70 % 에탄올을 밀봉 된 용기에 저장되는 분무 된 표면 상에 경 사진 때 가열 멸균이다.

1. 40-80 μm의 사이에 선단 직경으로 마이크로 피펫을 생성한다. 이러한 차원을 따르면 최적 얻을 것입니다결과. 열은 인출 할 때 마이크로 피펫을 소독하고 경 사진 표면과 밀폐 용기에 마이크로 피펫을 저장하기 전에 70 % 에탄올로 스프레이.
   주 : (표 2)이 바늘을 만드는 데 필요한 장치에 대한 액세스가 제한되면 다른 방법으로, 임의의 다른 사출 장치를 사용한다. 그러나 이러한 다른 직경으로 인해 마이크로 피펫로 적합하지 않을 수 있습니다.
2. 1 ml의 시린지에 광유를 도출해 및 1/2 30 G 바늘, 광유 완전히 유리 피펫을 채운다. 다음으로, 플런저에 정위 장치와 부하에 유리 피펫을 첨부 한 후, 정위 장치에 플런저를 탑재합니다. 유압 드라이브를 사용하여, 깨끗한 깨끗한 종이 타월로 밖으로 유출 미네랄 오일을 제거, 유리 피펫에 대한 중간 플런저를 이동합니다.
   1. 대안으로 주사기를 사용하여, 미네랄 오일 피펫의 후단 잠수함과 모세관 현상에 의해 채워진. pipett에 공기 방울을 방지하기 위해즉, 유리 피펫에서 완전히 될 때까지 주사기에 긍정적 인 압력을 유지한다.
      주 : 기타 장치 MGE 셀 ^(14)을 이식하기 위해 사용될 수있다. 이외의 제품을 사용하거나 절차도 100 NL 작품 근처에 볼륨이 적은 제공 할 수있는 모든 장치.
3. 좋은 점으로 꼬인 구석 섬세 MGE의 세포 펠렛 이상 초과 용지를 제거하여 다음, 멸균 종이 타월 또는 흡수 소재를 사용. 이 단계는 더 작은 주사 부피가 달성 될 수 있도록 셀 밀도를 집중한다. 그 다음, 천천히 세포 펠렛을 작성하여 소수성 표면 상에 세포 현탁액을 이동하기 전에 1-2 회 연화하기 (P2가 바람직하다) 피펫 낮은 볼륨을 사용한다. 볼륨이 바로 아래 1 μL해야합니다. 세포 현탁액 내로 바늘 끝을 이동하여 유압 구동을 이용하여, 피펫으로 세포 현탁액을 그린다.
4. 저체온증을 통해 P1 강아지를 마취시키다 (라텍스 장갑에 감싸 ~ 얼음에 2-4 분을 넣어).유해 자극과 마취의 효과를 확인합니다. 미세 집게로 발가락 사이의 피부를 꼬집어 : 끼면 강아지가 응답해야합니다. 다음으로, 분사 장치 아래에있는 금형 위에 강아지를 배치 한 후 머리에 피부를 뒤로 당겨 및 표준 실험실 테이프를 확보하여 팽팽하게 피부를합니다.
   참고 : 저체온증 신생아 마우스와 낮은 사망률의 결과에 매우 효과적이지만 새끼는 10 분에서 회복하기 시작으로, 절차는 신속하게 수행해야합니다. 또한, 얼음에 4 분 허용 될 수 있는지의 상한이다. 더 긴 시간이 주사가 필요한 경우 한 번만 저체온증을 유도하려고합니다. 강아지 조기 복구 경우, 먼저 강아지가 완전히 다시 저체온을 유도하기 전에 복구 할 수 있습니다. 더욱이, 단지 하나 저체온증에게 주사를 수행하는데 더 많은 시간을 유도한다. 새끼 저체온증의 5 ~ 10 분 이내에 복구합니다. 이 쓰레기와 엄마와 새끼를 배치하거나 따뜻한 SURFAC에 강아지를 배치하여 용이하게 할 수있다전자 복구합니다.
5. 정위 장치를 사용하여 헤드의 표면에 수직, 강아지의 머리 표면에 유리 피펫의 끝을 위치. 피펫은 머리와 접촉하는 경우, '0'으로 이것을 고려하십시오. 다음으로, 삽입 한 후, 피질에 피부와 두개골의 표면을 통해 피펫을 누르고 중지하기 전에 ~ 2 회를​​ 피펫을 철회. 마이크로 피펫이 0.1 mm의 깊이 인 때 신피질 세포로 표적화 최적의 경우, 주사를 행한다. 그러나 이것은 사용자가 최적화되어야한다 (아래 주 참조).
   참고 :이 깊이가 안정적으로 위에서 설명한 장치와 깊은 신피질 층을 대상으로하지만, 몇 가지 깊이는 경험적으로 결정 테스트해야합니다. 또한, 다른 rostro-꼬리와 메디 오 - 측면 위치에서 깊이의 범위는 각 사이트에서 최적의 어떤 깊이를 확인하기 위해 테스트해야합니다. 신피질에 느린 침투가 다 할 수있는 능력을 감소로 또한, 초기 구멍은 빠른해야leanly 조직을 침투. 먼저 가장 적합한 찾으려면이 절차를 시작할 때 다른 속도를보십시오. 염료의 위치를​​ 표시하기 위해 신뢰할 수 있었다으로 또한, 테스트 좌표를 들어, 레이블 세포를 사용하는 실제 대체가 없습니다.
6. 바늘 위치에 오면, 피질에 세포 현탁액 세트 볼륨을 밀어 유리 피펫으로 플런저를 전진 회전 유압 장치. 사이트 당 50 ~ 70 NLS를 주입한다. 목표는 신​​피질에 걸쳐 세포의 넓은 분포를 얻을 경우 다른 주동이의 - 꼬리 수준에서 3-6 다른 사이트에서이 절차를 반복합니다.
   참고 : 100 NL 이상의 볼륨은 병변의 원인이 효율적으로 주사 부위에서 마이그레이션 실패 주입 된 세포의 큰 덩어리로 이어질 수 있습니다. 따라서, 작은 주입 볼륨 (~ 70 NL 이하) 시간이 허락하면 더 많은 사이트를 통해 최적입니다.
7. 주입이 완료되면, 발가락 클리핑의 실체를 확인하기 위해 신뢰할 수있는 방법이다 (무대에서 강아지를 제거하고 표시UPS 이상). 강아지가 복구 자체에 이동 할 수 있습니다되면, 엄마와 쓰레기로 다시 넣어 (이 단계에서 제거 분 이내에 발생).
   참고 :이 최소 침습적 절차이기 때문에 강아지가 자유롭게 이동하고 따뜻하게 한 번 더 수술 후 절차는 없습니다. 그러나, 새끼뿐만 아니라 절차뿐만 아니라 보장하기 위해 다음 날 후가 건강 악화의 징후가없는 확인해야합니다.
8. 다음에 강아지 절차를 시작하기 전에 무균 작업 영역을 유지하기 위해 70 % 에탄올로 영역을 스프레이. 주입 된 새끼가 개발 한 다음 적절한 발달 단계 (들)에서 조직을 평가하도록 허용합니다.

결과

MGE 세포가 이주와 호스트 신피질 ^(16)에 이식 될 때 통합하는 독특한 능력을 가지고 있기 때문에, 이들은 생체 내 시험 전에 유전자 조작에 대한 우수한 모델 시스템을 제공한다. 여기서, 우리는 하나의 E13.5 태아로부터 MGE 조직을 분리하는 방법을 보여준다 (도 1 및도 2) 다음, 시험 관내 또는 생체 내 연구에 이식하기 전에 신속하게 하나 렌티 바이러스로 형...

토론

세포 기반 치료를위한 배아 신경절 eminences (GE 나)에서 GABA 성 대뇌 피질의 interneuron 전구체의 사용은 많은 조건 ^{(12) -1 4} 약속을 보이고있다. 정확한 분자 기법을 추적하고, 특정 interneuron 하위 그룹에 대한 관심의 유전자를 표현하기 위해 필요하다. 여기에서 우리는 이식하기 전에 렌티 바이러스로 배아 MGE 세포를 라벨에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고이 기술은 생체 분석을위한 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler		made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil		Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene