JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה ליצירת תאי פיטום שמקורם במבחנה, חריטה שלהם לעכברים חסרי תאים תורניים, וניתוח של פנוטיפ, מספרים והפצה של תאי פיטום חרוטים באתרים אנטומיים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציות של תאי פיטום ב vivo.

Abstract

תאי פיטום (MCs) הם תאים hematopoietic אשר שוכנים ברקמות שונות, והם שופעים במיוחד באתרים חשופים לסביבה החיצונית, כגון עור, דרכי הנשימה ומערכת העיכול. ידוע בעיקר בשל תפקידם המזיק בתגובות אלרגיות תלויות IgE, MCs הופיעו גם כשחקנים חשובים בהגנה המארחת מפני ארס ופלש חיידקים ולטפילים. פנוטיפ MC ותפקוד יכול להיות מושפע גורמים microenvironmental שעשויים להיות שונים בהתאם למיקום האנטומי ו / או מבוסס על סוג או שלב ההתפתחות של תגובות חיסוניות. מסיבה זו, אנחנו ואחרים העדפנו בגישות vivo על פני שיטות במבחנה כדי לקבל תובנה פונקציות MC. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת MCs מתורבתים של מח עצם העכבר (BMCMCs), העברתם המאמצת לעכברים לקויי MC גנטית, וניתוח המספרים וההתפלגות של MCs שהועברו באופן מאמץ באתרים אנטומיים שונים. שיטה זו, בשם'תא התורן knock-in' גישה, נעשה שימוש נרחב במהלך 30 השנים האחרונות כדי להעריך את הפונקציות של MCs ומוצרים שמקורם MC ב vivo. אנו דנים ביתרונות ובמגבלות של שיטה זו, לאור גישות חלופיות שפותחו בשנים האחרונות.

Introduction

תאי פיטום (MCs) הם תאים hematopoietic הנובעים אבות מח עצם פלוריפוטנטי1-3. בעקבות יציאה מח עצם, MCs אבות נודדים לתוך רקמות שונות שבו הם מתפתחים לתוך MCs בוגרת תחת השפעת גורמי גדילה מקומיים1-3. MCs תושבי רקמות ממוקמים אסטרטגית בממשקי סביבה מארחת, כגון העור, דרכי הנשימה ומערכת העיכול, שם הם מתנהגים כקו הגנה ראשון מפני עלבונות חיצוניים3-6. MCs מסווגים לעתים קרובות על סמך המאפיינים הפנוטיפיים "הבסיסיים" שלהם והמיקומים האנטומיים שלהם. בעכברים תוארו שני סוגים של MCs: MCs מסוג "רקמת חיבור" (CTMCs) ומחשבי MCs הרירית (MMCs)1-3,7,8. CTMCs ממוקמים לעתים קרובות סביב venules ליד סיבי עצב, ומתגוררים בחללים serosal, בעוד MMCs לכבוש מיקומים תוך-אפיתל במעיים רירית הנשימה1-3.

מתודולוגיות רבות יושמו כדי ללמוד פונקציות ביולוגיות של MCs9-13. קבוצות רבות התמקדו בגישות במבחנה באמצעות קווי תאים (כגון הקווים האנושיים MC HMC114 או LAD215,16), IN VITRO נגזר MCs (כגון MCs נגזר דם היקפי אנושי17, או עצם העכבר נגזר תרבית MCs [BMCMCs]18, MCs בתרבית עור עוברי [FSCMCs]19 ומחשבים גרפיים [PCMCs]20) או MCs מבודדים ex vivo מאתרים אנטומיים שונים. כל המודלים האלה נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד פרטים מולקולריים של ביולוגיה MC, כגון איתות מסלולים המעורבים בהפעלת MC. עם זאת, היבט חשוב של הביולוגיה MCs הוא כי המאפיינים הפנוטיפיים והפונקציונליים שלהם (למשל,תוכן פרוטאז גרנול ציטופלסמי או תגובה לגירויים שונים) ניתן לווסת על ידי מיקום אנטומי microenvironment2,7. מאז התערובת המדויקת של גורמים כאלה כי הם נתקלים vivo עשוי להיות קשה לשחזר במבחנה, אנו מעדיפים להשתמש בגישות vivo כדי לקבל תובנות פונקציות MCs9.

קיימים מספר זנים של עכברים עם מחסור גנטי ב- MC, כגון עכברי WBB6F1-קיט W/W-v או C57BL/6-קיט W-sh/W-sh. עכברים אלה חסרים ביטוי ו/או פעילות של KIT (CD117), הקולטן של גורם הגדילה העיקרי של MC גורם תאי גזע (SCF)21,22. כתוצאה מכך, לעכברים אלה יש מחסור עמוק ב- MC אך יש להם גם חריגות פנוטיפיות נוספות הקשורות למוטציותערכת c שלהם (ב- WBB6F1-קיט W / W-v עכברים) או להשפעות של היפוך כרומוזומלי גדול שתוצאתוביטוי ערכת c מופחתת (ב C57BL / 6 -קיט W-sh / W-sh עכברים)9,10,12,23. לאחרונה, מספר זנים של עכברים עם c-קיט- מחסור עצמאי MC מכונן דווחו24-26. כל העכברים האלה וכמה סוגים חדשים נוספים של עכברים חסרי השכלה MC נבדקו לאחרונה בפירוט9,10,13.

כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת MCs מתורבתים שמקורם בעצם העכבר (BMCMCs), העברתם המאמצת לעכברים חסרי MC וניתוח המספרים וההתפלגות של MCs שהועברו באופן מאמץ באתרים אנטומיים שונים. שיטה זו שנקראת 'תא התורן לדפוק ב' ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציות של MCs ומוצרים שמקורם MC ב vivo. אנו דנים ביתרונות ובמגבלות של שיטה זו, לאור גישות חלופיות שפותחו בשנים האחרונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הטיפול והניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ובאישור ספציפי של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת סטנפורד.

1. יצירה ואפיון של תאי פיטום תרבותיים (BMCMCs) שמקורם במח העצם.

הערה: BMCMCs התורם צריך להיווצר מתאי מח עצם מאותו רקע גנטי כמו העכברים MC-לקוי הנמען. BMCMCs של תורמים שמקורם בגברים אינם מתאימים לחריטה של עכברים נקביים. BMCMCs של תורמים שמקורם בנשים ייחרטו בהצלחה במקבלי גברים ונשים כאחד.

  1. מיצוי מח עצם.
    1. יוצקים מלוחים סטריליים עם אגירת פוספט (PBS) ל-6 צלחת תרבות טובה (1 באר לעכבר) ומניחים על הקרח.
    2. משרים את מכשירי הניתוח ב-70% אתנול לחיטוי.
    3. המתת חסד עכברים תורמים על ידי פחמן דו חמצני (CO2)שאיפה ואחריו נקע בצוואר הרחם, ולאחר מכן לרסס את העכברים עם 70% אתנול באתרי מניפולציה.
    4. השתמש בכלי ניתוח סטריליים כדי לחלץ את עצמות עצם הירך, השוקה והשוקית מבלי לחתוך אפיפיזות בעצמות.
    5. בעת אבטחת העצמות עם מלקחיים, לגרד את כל הרקמות מעצמות (ולהשליך שוקית) באמצעות מספריים סטריליים (או להבי אזמל). מניחים עצמות PBS על קרח עד שכל העצמות נאספות.
    6. בצע את כל השלבים הנותרים במכסה המנוע של תרבית הרקמות הסטרילית. באמצעות מכשירים סטריליים, לאבטח עצמות עם מלקחיים לחתוך את שני epiphyses לחשוף את חלל medullary.
    7. שימוש במזרקים של 3 מ"ל ומחטי 30 ג'י, ובינוני שטיפה קר (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] בתוספת סרום עגל עוברי 10% [FCS, מומת בחום], 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פתרון אנטי-מיקרוטי אנטיביוטי, 50 מיקרומטר Β-mercaptoethanol), לשטוף את מח העצם האדומה לתוך צלחת פטרי.
    8. השתמש באותו מזרק כדי לנתק אשכולות תאי מח עצם סמוקים על ידי שאיפה עדינה חוזרת ונשנית ויציקה.
    9. מח עצם הירך והטיביאלי של הבריכה מכל עכבר לצינור צנטריפוגה אחד של 15 מ"ל. ממלאים את הצינור במדיום שטיפה קר כדי לשטוף תאי מח עצם וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. תרבות BMCMCs.
    1. הסר supernatant ולשחזר כדורי תאי מח עצם ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (DMEM בתוספת 10% סרום עגל עוברי [FCS, מומת בחום], 2 מ"מ ל-גלוטמין, 1% תמיסת אנטי-מיקרוטי אנטיביוטית, 50 מיקרומטר Β-mercaptoethanol ו-20% מדיום ממוזג בתאים WEHI-3 [כמקור של IL-3; לחילופין השתמש בעכבר רקומביננטי IL-3 ב-10 ng/ml]).
    2. מניחים תאים בבקבוק תרבית רקמות בגודל המתאים(למשל,T25 עבור עכבר אחד, T75 עבור 2 עכברים, וכו ').
    3. 1-2 ימים לאחר ציפוי תאים, להעביר תאים בינוניים ומתלים (משאיר פסולת ותאים חסידיים נדבק לתחתית הבקבוק) לבקבוק חדש ולהוסיף מדיום תרבות טרי (10 מיליליטר / עכבר).
    4. במהלך השבועות הבאים, להאכיל תאים כל 3-4 ימים (להוסיף 10 מ"ל של מדיום תרבות לכל עכבר). שמור על צפיפות תאים בין 2.5 x 105-1 x 106 תאים/מיליליטר. העבר תאים שאינם חסידים לבקבוקון חדש פעם בשבוע עד שלא קיימים תאים חסידיים בבקבוק התרבות. בדיקת הבשלות של תאים (ראה להלן) לפני השימוש במבחנה מבחנים או חריטה לתוך עכברים MC לקוי.
      הערה: הבחנה מלאה של BMCMCs תימשך 4-6 שבועות.
  3. הערכת הפירעון של BMCMC.
    1. שימוש בציטומטריית זרימה.
      1. לשטוף תאים (5 x 104-5 x10 5 תאים / מצב) עם מאגר FACS קר כקרח (PBS, 0.5% FCS) ב 5 מיליליטר פוליסטירן צינור תחתון עגול. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוף על טבעי.
      2. לדלל נגד עכבר CD16/32 (שיבוט 93 או 2.4G2) נוגדנים חד שבטיים 1:200 (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) במאגר FACS. הוסף 10 μl לכל גלולה ו resuspend על ידי מערבולת קצרה. דגירה 5 דקות על קרח כדי לחסום את כריכת Fc.
        הערה: הגן על דגימות מפני אור ישיר עבור כל השלבים הנותרים.
      3. לדלל phycoerythrin (PE) מצומד נגד עכבר Fc εRI α (שיבוט MAR-1) 1:200 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) ו פלואורסצנטין isothiocyanate (FITC) מצומד נגד עכבר KIT (CD117; שיבוט 2B8) 1:200 (2.5 מיקרוגרם /מיליליטר) ("פתרון כתמים"), או נוגדני בקרת isotype שכותרתו בהתאמה במאגר FACS ("פתרון בקרת isotype").
      4. לפצל מחצית התאים החסומים משלב 1.3.1.2) לתוך צינור עגול נוסף polystyrene התחתון ולהוסיף 20 μl של "פתרון כתמים" בצינור אחד ו 20 μl של "פתרון פקדי isotype" בצינור השני. דגירה 30 דקות על קרח.
      5. הוסיפו 3 מ"ל חיץ FACS קר כקרח וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך supernatant ו resuspend גלולה ב 300 μl FACS מאגר המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל propidium יודיד (PI, לזיהוי של תאים מתים). המשך לניתוח ציטומטריית זרימה (ראה איור 2A).
    2. באמצעות כתמים כחולים טולואידין.
      1. לשטוף 1 x 105 תאים פעם אחת עם PBS על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואז לשאוף ולהזרים מחדש תאים ב 200 μl של PBS.
      2. מעבירים את המתלה התא לתוך ציטופונל מוכן המחובר למגלשת מיקרוסקופ ולהמשיך עם ציטו-צנטריפוגה באמצעות cytocentrifuge (40 x g במשך 5 דקות).
      3. שקופיות יבשות אוויר במשך 10 דקות ולצייר עיגול שעווה סביב תאים באמצעות עט PAP. הוסף 0.1% פתרון כחול טולואידין כדי לכסות את התאים. דגירה במשך דקה. לשטוף שקופיות במי ברז זורמים במשך דקה אחת, ולאחר מכן שקופיות יבשות באוויר במשך 10 דקות.
      4. מכסה תאים באמצעות מדיום הרכבה. המשך לניתוח מיקרוסקופ אור (ראה איור 2B)

2. חריטה של עכברים תא התורן לקוי עם BMCMCs.

  1. חריטה באוזן על ידי הזרקה תוך עורית (i.d.).
    הערה: להעברה מאמצת של BMCMCs לתוך פיני האוזן של עכברים לקוי MC, אנו ממליצים לבצע שתי זריקות של 1 x 106 תאים כל אחד (עבור סך של 2 x 106 תאים) לכל פינה האוזן. תחריט תוך-עורי של BMCMCs לתוך פיני האוזן של עכברים לקויי MC שימש חוקרים רבים במספר מודלים, כולל מודלים של אנפילקסיס עורית פסיבית (PCA)24,27, הגנה מארחת מפניארסים 28, ורגישות יתר כרונית (CHS) תגובות29,30.
    1. ספור ושקע מחדש תאים ב- 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs / 25 μl) ב- DMEM קר. העברת פתרון BMCMCs לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד במחט 30 G. יש לשמור על הקרח עד להזרקה.
    2. יש להרדים עכברים בני 4-6 שבועות עם חסר MC באמצעות isoflurane (2.5% v/v). בדוק את עומק ההרדמה על ידי קמצוץ בוהן, להתאים isoflurane אם צוין ולהמשיך לפקח על הנשימה ואת תגובת צביטה בוהן לאורך כל ההליך. יש למרוח משחה עיניים עם קצה Q כדי למנוע יובש בעיניים.
    3. עם האצבע המורה, ליצור לחץ אנכי על הפנים הגבי של פינה האוזן לחשוף ולמתוח את הפנים הגחוניות.
    4. בצע שתי 25 μl i.d. זריקות של פתרון BMCMC לשני אתרים שונים של הפנים הגחוניות של פינה האוזן, הזריקה הראשונה באמצע האוזן ואת הזריקה השנייה לכיוון קצה הפינה האוזן. המתן 4-6 שבועות לאחר תחריט זהות לפני ביצוע ניסויים vivo.
      הערה: מניסיוננו, עד אז מספר MCs / mm2 של דרמיס בחלק המרכזי של פינה האוזן בדרך כלל דומה לזה במיקום המתאים בעכברים מסוג בר, ואילו המספרים של MCs / mm2 בפריפריה של פיני האוזן הם בדרך כלל נמוכים משמעותית מאלה בעכברים מסוג בר המקביל27,28. זה צריך לזכור בעת תכנון ניסויים עם עכברים חרוטים MC כזה(למשל,סוכנים עם השפעות אפשריות על הפונקציה MC צריך להיות מוזרק לחלק המרכזי של פיני האוזן, ואת הניתוח של ההשפעות של טיפולים כאלה צריך גם להתמקד באזור זה).
  2. חריטה של חלל הצפק על ידי הזרקה תוך-פריטונית (i.p. ).
    הערה: העברה מאמצת של BMCMCs לחלל הצפק של עכברים לקויי MC תדרוש זריקה אחת של 2 x 106 תאים לכל עכבר. זריקות i.p. כאלה של BMCMCs לעכברים MC לקוי שימשו קבוצות רבות כדי ללמוד את התפקידים של MCs הצפק במודלים שונים, כולל מודלים של הגנה מארחת נגדארסים 31 או אלח דם חיידקי32,33.
    1. ספור את מספר התאים המתאים והשקע מחדש ב- 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs / 200 μl) ב- DMEM קר. העברת פתרון BMCMCs לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד במחט 25 G. יש לשמור על הקרח עד להזרקה.
    2. בצע זריקה 1 של 200 μl BMCMCs פתרון לתוך חלל הצפק של עכברים 4-6 שבועות MC לקוי. המתן 4-6 שבועות לאחר חריטה i.p. לפני ביצוע ניסויים vivo.
  3. חריטה על ידי הזרקה תוך ורידי (i.v.).
    הערה: העברה מאמצת של BMCMCs על ידי i.v. הזרקה לעכברים MC לקוי ידרוש זריקה אחת של 5 x 106 תאים לכל עכבר. זריקות תוך ורידי (i.v.) של BMCMCs לעכברים MC לקוי שימשו קבוצות רבות כדי ללמוד את התפקידים של MCs במודלים שונים של מחלות, כולל מודלים של זיהום בשלפוחית השתן34,אסטמה 35, פיברוזיס ריאות36, ו דלקת מפרקים בתיווך נוגדנים37.
    1. ספור את מספר התאים המתאים והשקע מחדש ב- 2.5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) ב- DMEM קר. העברת פתרון BMCMCs לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד במחט 30 G. יש לשמור על הקרח עד להזרקה.
    2. יש להרדים עכברים בני 4-6 שבועות עם חסר MC באמצעות isoflurane (2.5% v/v). בדוק את עומק ההרדמה על ידי קמצוץ בוהן, להתאים isoflurane אם צוין ולהמשיך לפקח על הנשימה ואת תגובת צביטה בוהן לאורך כל ההליך. יש למרוח משחה עיניים עם קצה Q כדי למנוע יובש בעיניים.
    3. בצע זריקה אחת של 200 μl של פתרון BMCMC לתוך וריד הזנב (או, לחילופין, את הווריד רטרו מסלולית) של עכבר MC לקוי. המתן 12 שבועות לאחר תחריט i.v. לפני ביצוע ניסויים vivo.

3. ניתוח של עכברים חרוטים בתא התורן לקוי.

  1. ניתוח חריטה באוזן.
    1. בסוף הניסוי, המתת חסד עכברים על ידי שאיפת CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. לבודד את הפינה האוזן ולתקן 10% (vol / vol) אגירה פורמלין לילה ב 4 מעלות צלזיוס. להטביע פינה אוזן קבועה פרפין, לחתוך 4 μm חלקים של פיני האוזן ולהרכיב על שקופיות זכוכית.
    3. הכתימו את השקופיות בתמיסה כחולה של 0.1% טולוידין למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף מגלשות במי ברז במשך דקה אחת, ואז שקופיות יבשות לאוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. כיסוי שקופיות באמצעות מדיום הרכבה, ולאחר מכן לספור את מספר MCs חרוטים לכל מקטעי pinnae באמצעות מיקרוסקופ אור. להעריך את יעילות החריטה על ידי השוואת אחוז והתפלגות של MCs בעור האוזן של עכברים חרוטים לעומת עכברים מסוג בר.
  2. ניתוח חריטה של חלל הצפק.
    1. הערכה של מספר תאי פיטום בחלל הצפק.
      1. בסוף הניסוי, המתת חסד עכברים על ידי שאיפת CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. הסר בזהירות את העור הגחוני של העכברים מבלי לשבור את חלל הצפק.
      2. להזריק 5 מ"ל של קר או טמפרטורת החדר PBS בחלל הצפק באמצעות מזרק 5 מ"ל מצויד במחט 25 גרם. השתמש PBS קר כדי להפחית את הסיכון של הפעלת תאים הצפק (זה חשוב מאוד בעת הערכת degranulation MC הצפק או רמות של כמה מוצרים שמקורם MC בנוזל שטיפת הצפק). בצע עיסוי של הבטן במשך 20 שניות כדי לקצור תאים צפק.
      3. לאט לאט לשאוף את שטיפת הצפק באמצעות מזרק 5 מ"ל מצויד במחט 22 G. רשום את נפח שטיפת לשאוף (מצפה לשחזר עד 80% של נפח מוזרק).
      4. מעבירים נוזל שטיפת הצפק לצינור 5 מ"ל פוליסטירן עגול וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לשאוף על טבעי. לשחזר את גלולה ב 400 μl קר PBS.
      5. לספור את המספר הכולל של תאים הצפק באמצעות תא המוציטרומטר. השתמש במחצית מהשעיית התא לניתוח cytometry זרימה (כמתואר בשלב 1.3.1), כדי להעריך את ביטוי האחוז והסמן של MCs חרוטים בחלל הצפק. הכפל את המספר הכולל של תאים צפקים באחוז של בקרי MC כדי להשיג מספר מוחלט של בקרי MC הצפק.
      6. בצע cytocentrifugation עם התאים הנותרים כמתואר בשלב 1.3.2.2. שקופיות יבשות אוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולצייר מעגל שעווה סביב תאים באמצעות עט PAP.
      7. מכסים תאים בתמיסת צביעה מאי-גרונוולד לא מדוללת במשך 5 דקות, ולאחר מכן שטיפה ב- PBS במשך 5 דקות, שניהם בטמפרטורת החדר. לכסות תאים עם כתם Giemsa מדולל 1:20 עם מים deionized דגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף שקופיות 2 פעמים במי ברז במשך דקה אחת, ולאחר מכן שקופיות יבשות באוויר.
      8. מכסה תאים באמצעות מדיום הרכבה ומחשב את אחוז ה- MCs החרוטים באמצעות מיקרוסקופ אור (על-ידי ספירת לפחות 400 תאים בסך הכל). להעריך את יעילות החריטה על ידי השוואת אחוז MCs בשטיפת הצפק של עכברים חרוטים לעומת עכברים מסוג בר.
    2. הערכה של תאי פיטום בחלונות המזנטרים.
      1. בעקבות שטיפת הצפק המתוארת בשלב 3.2.1, לחתוך לפתוח את קרום הצפק כדי לחשוף את מערכת העיכול של העכברים. סדר 4 עד 5 חלונות mesenteric לכל עכבר על שקופית.
      2. תקן את השקופיות במשך שעה בתמיסת קרנוי (3:2:1 vol / vol / vol של אתנול, כלורופורם, וחומצה אצטית קרחונית) בטמפרטורת החדר. שקופיות יבשות באוויר ולהסיר את המעי (החלונות mesenteric קבוע יישאר מחובר לשקופיות).
      3. הכתים את ההכנות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם Csaba (כחול אלסי / ספרנין O) פתרון מכתים.
        1. כדי להפוך 500 מ"ל של כתם Csaba, להכין 500 מ"ל של חיץ אצטט על ידי ערבוב 100 מ"ל של 1 M נתרן אצטט פתרון עם 120 מ"ל של 1 M HCl. לעשות עד 500 מ"ל עם מים deionized ולהתאים pH ל 1.42. לאחר מכן, להמיס 90 מ"ג ספרנין [מזהה 'בוגרת MCs' באדום], 1.8 גרם כחול אלקיאני [מזהה 'MCs בוגרים' בכחול] ו 2.4 גרם אמוניום ברזלי גופרתי NH4Fe(SO4)2 לתוך 500 מ"ל של חיץ אצטט.
      4. כיסוי שקופיות באמצעות מדיום הרכבה, ולאחר מכן לספור את מספר MCs חרוטים לכל חלון mesenteric באמצעות מיקרוסקופ אור. להעריך את יעילות החריטה על ידי השוואת האחוז וההתפלגות של MCs בחלונות mesenteric של עכברים חרוטים לעומת עכברים מסוג בר.
  3. ניתוח חריטה של איי.וי.
    1. בסוף הניסוי, המתת חסד עכברים על ידי שאיפת CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם, ורקמת הקציר של עניין(למשל ריאה, עור או טחול) ולתקן לילה ב 10% (vol / vol) אגירה פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. להטביע רקמות קבועות בפרפין, לחתוך 4 מקטעי מיקרומטר, ולהרכיב על שקופיות זכוכית. הכתימו את השקופיות בתמיסה כחולה של 0.1% טולוידין למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף מגלשות במי ברז במשך דקה אחת, ואז שקופיות יבשות לאוויר במשך 10 דקות.
    3. מכסה שקופיות באמצעות מדיום הרכבה ולהעריך את מספר והפצה של MCs חרוטים לכל מקטעי רקמה באמצעות מיקרוסקופ אור.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סקירה כללית של גישת 'חיקוי תא התורן' מוצגת באיור 1, וכוללת את הדור של BMCMCs, את מספר התאים שיש לחרוט i.p., i.d. או i.v. לעכברים חסרי MC (המספר יכול להיות מגוון אם צוין בהתבסס על העיצוב הניסיוני) ואת המרווח בין חריטה לניסוי בהתאם לאתר ההזרקה (מרווח זה גם יכול להשתנות, אם צוין; למשל, התוכ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כמעט 30 שנה לאחר תיאורו הראשוני38, הגישה 'תא התורן לדפוק ב' ממשיכה לספק מידע רב ערך על מה MCs יכול לעשות או לא יכול לעשות vivo. הפונקציות של MCs נחשבו זמן רב להיות מוגבל לתפקידם באלרגיה. נתונים שנוצרו באמצעות גישת 'תא התורן knock-in' שינו השקפה זו, על ידי מתן ראיות כי MCs יכול, בין היתר, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

N.G. הוא מקבל מלגות מן הצרפתית "פונדציה לשפוך la Recherche Médicale FRM" וקרן פיליפ; R.S. נתמך על ידי קרן לוסיל פקארד לבריאות הילדים ופרס סטנפורד NIH / NCRR CTSA מספר UL1 RR025744; נ.ב. נתמך על ידי מלגת מקס קייד של קרן מקס קייד והאקדמיה האוסטרית למדעים ומלגת שרודינגר של קרן המדע האוסטרית (FWF): J3399-B21; S.J.G. מכיר בתמיכה של המכונים הלאומיים לבריאות מעניק U19 AI104209, NS 080062 ומהתוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק באוניברסיטת קליפורניה; L.L.R. מכיר בתמיכה של קרן המחקר הלאומית דלקת פרקים (ANRF) ומכוני הבריאות הלאומיים מענק K99AI110645.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Antibiotic-Antimycotic SolutionCorning cellgro30-004-Cl
3 ml SyringeFalcon309656
35 mm x 10 mm DishCorning cellgro430588
5 ml Polystyrene Round Bottom TubeFalcon352058
Acetic Acid GlacialFisher ScientificA35-500
Alcian Blue 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R CentrifugeBeckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) PurifiedeBioscience14-0161-81
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB SyringeBD Syringe309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) NeedlesBD Precision Glide Needle205155
BD 25 G 5/8 NeedlesBD Syringe305122
BD 30 G x 1/2 NeedlesBD Precision Glide305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical TubeFalcon352097
ChloroformFisher ScientificC298-500
Cytoseal 60 Mounting MediumRichard-Allan Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
DakoCytomation penDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
EthanolSigma AldrichE 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat InactivatedSigma AldrichF4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype ControleBioscience14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)eBioscience11-1171-82
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Giemsa Stain ModifiedSigma AldrichGS-1L
IsothesiaHenry Schein Animal Health29405
May-Grunwald StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6 well platesFalcon35 3046
Olympus BX60 MicroscopeOlympusNA
Paraplast Plus Tissue Embedding MediumFisher Brand23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype ControleBioscience12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)eBioscience12-5898-82
Propidium Iodide Staining SolutioneBioscience00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3Peprotech213-13
Safranin-o CertifiedSigma AldrichS8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
Toluidine Blue 1% AqueousLabChem-IncLC26165-2
Recombinant Mouse SCFPeprotech250-03

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

99c kitFc RIE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved