JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İn vitro türevli mast hücrelerinin üretimi, mast hücresi eksikliği olan farelere işlenmeleri ve farklı anatomik bölgelerde fenotip, sayılar ve engrafted mast hücrelerinin dağılımının analizi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, masthücrelerinin işlevlerini değerlendirmek için kullanılabilir vivo .

Özet

Mast hücreleri (MCS) çeşitli dokularda bulunan hematopoetik hücrelerdir ve özellikle cilt, hava yolları ve gastrointestinal sistem gibi dış ortama maruz kalan bölgelerde bol miktarda bulunur. IgE'ye bağımlı alerjik reaksiyonlardaki zararlı rolleriyle bilinen MCS'ler, zehir ve istilacı bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında da önemli oyuncular olarak ortaya çıkmıştır. MC fenotip ve fonksiyonu anatomik konuma göre ve/veya immün yanıtların gelişim türüne veya evresine göre farklılık gösterebilecek mikroçevroronmental faktörlerden etkilenebilir. Bu nedenle, biz ve diğerleri MC işlevleri hakkında fikir edinmek için in vitro yöntemlere göre in vivo yaklaşımları tercih ettik. Burada, fare kemiğinden türetilmiş kültürlü MCC'lerin (BMCMC' ler) üretimi, genetik olarak MC eksikliği olan farelere benimsenen transferleri ve farklı anatomik bölgelerde benimsenen aktarılan MC'lerin sayılarının ve dağılımının analizi için yöntemleri açıklıyoruz. 'Mastcell knock-in' yaklaşımı olarak adlandırılan bu yöntem, son 30 yılda MCS ve MC türevi ürünlerin işlevlerini değerlendirmek için yoğun olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda geliştirilen alternatif yaklaşımlar ışığında bu yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

Giriş

Mast hücreleri (MCS) pluripotent kemik iliği progenitörlerinden kaynaklanan hematopoetik hücrelerdir1-3. Kemik iliği çıkışı sonrasında, MCS progenitörleri, lokal büyüme faktörlerinin etkisi altında olgun MC'lere dönüştükleri çeşitli dokulara göç ederler1-3. Doku bazlı MC'ler, dış hakaretlere karşı ilk savunma hattı olarak davrandıkları cilt, hava yolları ve gastrointestinal sistem gibi konak-çevre arayüzlerinde stratejik olarak bulunur3-6. MC'ler genellikle "temel" fenotipik özelliklerine ve anatomik konumlarına göre alt sınıflandırılır. Farelerde iki tür MC tanımlanmıştır: "bağ dokusu tipi" MCC'ler (CTMC'ler) ve mukozal MC'ler (MBC'ler)1-3,7,8. CTMC'ler genellikle venüles çevresinde ve sinir liflerinin yakınında bulunur ve serosal boşluklarda bulunurken, MPC'ler bağırsak ve solunum mukozasında intraepithelial konumları işgaleder 1-3.

MCs9-13'ünbiyolojik fonksiyonlarını incelemek için çok sayıda metodoloji uygulanmıştır. Birçok grup, hücre hatları (HMC1 14 veya LAD215,16 insan MC hatları gibi), in vitro türevliMC'ler(insan periferik kan türevliMC'ler 17veya fare kemik iliği gibi) kullanarak in vitro yaklaşımlara odaklanmıştır. türetilmiş kültürlü MCS [BMCMC'ler]18, fetal deri türevli kültürlü MC'ler [FSCMC'ler]19 ve periton hücre türevi MC'ler [PCMCs]20) veya farklı anatomik bölgelerden ex vivo izole PCC'ler. Tüm bu modeller, MC aktivasyonunda yer alan sinyal yolları gibi MC biyolojisinin moleküler ayrıntılarını incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, MCS biyolojisinin önemli bir yönü, fenotipik ve fonksiyonel özelliklerinin(örneğin,sitoplazmik granül proteaz içeriği veya farklı uyaranlara yanıt) anatomik konum ve mikroçevrim2,7ile modüle edilebilmesidir. Vivo ile karşılaşılan bu faktörlerin tam karışımı in vitro, VC işlevleri hakkında fikir edinmek için in vivo yaklaşımları kullanmayı tercih ediyoruz9.

Yaygın olarak kullanılan WBB6F1- Kit W/W-v veya C57BL/6-Kit W-sh/W-sh fareler gibi genetik MC eksikliği olan çeşitli fare suşları vardır. Bu fareler, ana MC büyüme faktörü kök hücre faktörü (SCF)21,22için reseptör olan KIT'in (CD117) ekspresyon ve /veya aktivitesinden yoksundur. Sonuç olarak, bu fareler derin bir MC eksikliğine sahiptir, aynı zamanda c-kit mutasyonları (WBB6F1-Kit W / W-v farelerde) veya azaltılmış c-kit ekspresyasyonu ile sonuçlanan büyük kromozomal inversiyonun etkileri ile ilgili ek fenotipik anormalliklere sahiptir (C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh farelerinde)9,10,12,23. Daha yakın zamanda, c-kit-bağımsız constitutive MC eksikliği olan birkaç fare türübildirilmiştir 24-26. Tüm bu fareler ve bazı yeni indüklenen MC eksikliği olan fare türleri son zamanlarda ayrıntılı olarak gözden geçirildi9,10,13.

Burada, fare kemiği iliği türevi kültürlü MC'lerin (BMCMC' ler) üretimi, MC eksikliği olan farelere benimsenen transferleri ve farklı anatomik bölgelerde benimsenen aktarılan MC'lerin sayılarının ve dağılımının analizi için yöntemleri açıklıyoruz. Bu sözde 'mast hücre vurma' yöntemi, MC'lerin ve MC türevi ürünlerin işlevlerini değerlendirmekiçin kullanılabilir. Son yıllarda geliştirilen alternatif yaklaşımlar ışığında bu yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneyleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergelerine uygun olarak ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin özel onayıyla gerçekleştirildi.

1. Kemik İliği Türevi Kültürlü Mast Hücrelerinin (BMCMC) Üretimi ve Karakterizasyonu.

Not: Donör BMCMC'ler, alıcı MC eksikliği olan farelerle aynı genetik arka plandaki kemik iliği hücrelerinden üretilmelidir. Erkek kökenli donör BMCMC'ler dişi farelerin engraftmenti için uygun değildir. Kadın kökenli donör BMCMC'ler hem erkek hem de kadın alıcılara başarıyla kazınacaktır.

  1. Kemik İliği Çıkarma.
    1. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) 6 kuyu kültür plakasına (fare başına 1 kuyu) dökün ve buza yerleştirin.
    2. Diseksiyon aletlerini sterilizasyon için% 70 etanolde ıslatın.
    3. Donör fareleri karbondioksit (CO2)soluma ve ardından servikal çıkık ile ötenazi edin, ardından farelere manipülasyon yerlerinde% 70 etanol püskürtün.
    4. Herhangi bir kemik epifizini kesmeden uyluk kemiği, kaval kemiği ve fibula kemiklerini çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın.
    5. Kemikleri bir kümesle sabitlerken, steril makas (veya neşter bıçakları) kullanarak tüm dokuyu kemiklerden kazıyın (ve fibulayı atın). Tüm kemikler toplanana kadar kemikleri PBS'ye buz üzerine yerleştirin.
    6. Steril doku kültürü davlumbazında kalan tüm adımları uygulayın. Steril aletler kullanarak, kemikleri epulps ile sabitleyin ve medüller boşluğu ortaya çıkarmak için her iki epifizi de kesin.
    7. 3 ml şırınga ve 30 G iğne ve soğuk yıkama ortamı (Dulbecco Modifiye Kartal Ortası [DMEM] ile desteklenmiş %10 fetal baldır serumu [FCS, ısı inaktive], 2 mM L-glutamin, %1 antibiyotik-antimycotic çözeltisi, 50 μM Β-mercaptoethanol), kırmızı kemik iliğini Petri kabına yıkayın.
    8. Tekrarlanan nazik aspirasyon ve fırlatma ile yıkanmış kemik iliği hücre kümelerini ayrıştırmak için aynı şırındıcı kullanın.
    9. Her fareden bir 15 ml santrifüj tüpüne havuz femoral ve tibial kemik iliği. Kemik iliği hücrelerini ve santrifüjleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da yıkamak için tüpü soğuk yıkama ortamıyla doldurun.
  2. BMCMC'ler Kültür.
    1. Süpernatantı çıkarın ve 10 ml kültür ortamında peletlenmiş kemik iliği hücrelerini kurtarın (DMEM% 10 fetal baldır serumu ile desteklenir [FCS, ısı inaktive], 2 mM L-glutamin, %1 antibiyotik-antimycotic çözelti, 50 μM Β-mercaptoethanol ve %20 WEHI-3 hücre şartlandırılmış ortam [IL-3 kaynağı olarak; alternatif olarak 10 ng/ml'de rekombinant fare IL-3 kullanın]).
    2. Hücreleri uygun boyutta doku kültürü şişesine yerleştirin(örneğin,1 fare için T25, 2 fare için T75, vb.).
    3. Hücreleri kapladıktan 1-2 gün sonra, orta ve süspansiyon hücrelerini (döküntü ve yapışkan hücreleri şişenin dibine yapışarak bırakarak) yeni bir şişeye aktarın ve taze kültür ortamı (10 ml / fare) ekleyin.
    4. Sonraki haftalarda, hücreleri her 3-4 günde bir besleyin (fare başına 10 ml kültür ortamı ekleyin). 2,5 x 105 -1x 106 hücre/ml arasında hücre yoğunluğunu koruyun. Yapışmayan hücreleri, kültür şişesinde yapışan hücre bulunmayana kadar haftada bir kez yeni bir şişeye aktarın. MC eksikliği olan farelere in vitro tahliller veya gravür için kullanmadan önce hücrelerin olgunluğunu test edin (aşağıya bakın).
      NOT: BMCMC'lerin tamamen farklılaşması 4-6 hafta sürecektir.
  3. BMCMC olgunluğunun değerlendirilmesi.
    1. Akış sitometrisi kullanarak.
      1. Hücreleri (5 x 104-5 x10 5 hücre/durum) buz gibi FACS tamponu (PBS, %0,5 FCS) ile 5 ml polistiren yuvarlak alt tüpte yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj. Aspirate süpernatant.
      2. Fare önleyici CD16/32 (klon 93 veya 2.4G2) monoklonal antikorları FACS tamponunda 1:200 (2.5 μg/ml) seyreltin. Her pelede 10 μl ekleyin ve kısa bir girdapla yeniden depolanın. Fc bağlamasını engellemek için buzda 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
        NOT: Kalan tüm adımlar için numuneleri doğrudan ışıktan koruyun.
      3. Seyreltik fitoerythrin (PE) konjuge anti-fare Fc φRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) ve floresan izotiyosiyanat (FITC) konjuge anti-fare KIT (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("boyama çözeltisi") veya FACS tamponunda ilgili etiketli izotip kontrol antikorları ("izotip kontrol çözümü").
      4. Engellenen hücrelerin yarısını adım 1.3.1.2)'den ek bir polistiren yuvarlak alt tüpe bölün ve bir tüpe 20 μl "boyama çözeltisi", diğer tüpe 20 μl "izotip kontrol çözeltisi" ekleyin. Buzda 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
      5. 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da 3 ml buz gibi FACS tamponu ve santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve peleti 1 μg/ml propidium iyodür (PI, ölü hücrelerin tanımlanması için) içeren 300 μl FACS tamponunda yeniden biriktirin. Akış sitometrisi analizine geçin (bkz. Şekil 2A).
    2. Toluidin mavisi lekeleme kullanarak.
      1. 1 x 105 hücreyi PBS ile bir kez oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme ile yıkayın, ardından 200 μl PBS'de hücreleri aspire edin ve yeniden depolayın.
      2. Hücre süspansiyonunu mikroskop slaydına bağlı hazırlanmış bir sitokunnale aktarın ve bir sitosantrifüj kullanarak sito-santrifüjleme ile devam edin (5 dakika boyunca 40 x g).
      3. 10 dakika boyunca hava kuru kaydıraklar ve pap kalem kullanarak hücrelerin etrafına balmumu daire çizin. Hücreleri kapsayacak şekilde% 0.1 Toluidin mavisi çözelti ekleyin. 1 dakika kuluçkaya yaslanın. Akan musluk suyundaki slaytları 1 dakika yıkayın, ardından 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.
      4. Montaj ortamını kullanarak kapak hücreleri. Işık mikroskobu analizine geçin (bkz. Şekil 2B)

2. Mast Hücre eksikliği olan Farelerin BMCMC'lerle engraftment.

  1. intradermal (i.d.) enjeksiyonu ile kulak gravür.
    NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin kulak pinnasına benimsenen transferi için, kulak pinna başına her biri 1 x 106 hücreden (toplam 2 x 106 hücre için) iki enjeksiyon yapmanızı öneririz. BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin kulak pinnaesine intradermal engraftasyonu, pasif kesesel anafilaksi (PCA)24,27modelleri, zehirlere karşı konak savunma 28 ve kronik aşırı duyarlılık (CHS) reaksiyonları29,30dahil olmak üzere birçok modelde birçok araştırmacı tarafından kullanılmıştır.
    1. Soğuk DMEM'de 4 x 107 BMCMC/ml'de (1 x 106 BMCMC/ 25 μl) hücreleri sayın ve yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 30 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.
    2. İzofluran kullanarak 4-6 haftalık MC eksikliği olan fareleri uyuşturmak (%2,5 v/v). Anestezinin derinliğini ayak parmağıyla kıstırın, belirtilmişse izofluranları ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. Göz kuruluğu önlemek için bir Q ucu ile oftalmik merhem uygulayın.
    3. İşaret parmağı ile ventral yüzü ortaya çıkarmak ve germek için kulak pinnasının dorsal yüzünde dikey basınç oluşturun.
    4. Kulak pinnasının ventral yüzünün iki farklı bölgesine iki adet 25 μl id. bmcmc çözelti enjeksiyonu, kulağın ortasına ilk enjeksiyon ve ikinci enjeksiyonu kulak pinna ucuna doğru gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.d. gravürden sonra 4-6 hafta bekleyin.
      Not: Deneyimlerimize göre, o zamana kadar kulak pinnasının orta kısmındaki MCs / mm2 dermis sayısı genellikle vahşi tip farelerde ilgili konumdakine benzerken, kulak pinnaesinin çevresindeki MCS / mm2 sayıları genellikle ilgili vahşi tip farelerdekilerden önemli ölçüde daha düşüktür27,28. Bu tür MC ile kaplanmış farelerle deneyler tasarlarken bu akılda tutulmalıdır(örneğin,MC işlevi üzerinde olası etkileri olan ajanlar kulak pinnaesinin orta kısmına enjekte edilmeli ve bu tür tedavilerin etkilerinin analizi de o alana odaklanmalıdır).
  2. İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile periton kavitesi gravür.
    NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelerin periton boşluğuna benimsenen transferi, fare başına 2 x 106 hücreden oluşan bir enjeksiyon gerektirecektir. MC eksikliği olan farelere BMCMC enjeksiyonları, zehirlere karşı konak savunma modelleri 31 veya bakteriyel sepsis32,33 de dahil olmak üzere çeşitli modellerde periton MC'lerin rollerini incelemek için birçok grup tarafından kullanılmıştır.
    1. Soğuk DMEM'de uygun sayıda hücre sayın ve 1 x 107 BMCMC/ml'de (2 x10 6 BMCMC/ 200 μl) yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 25 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.
    2. 4-6 haftalık MC eksikliği olan farelerin periton boşluğuna 200 μl BMCMC çözeltisinin 1 enjeksiyonunu gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.p. gravürden sonra 4-6 hafta bekleyin.
  3. İntravenöz (yani) enjeksiyon ile gravür.
    NOT: BMCMC'lerin MC eksikliği olan farelere enjeksiyon yoluyla benimsenen transferi, fare başına 5 x 106 hücrelik bir enjeksiyon gerektirecektir. MC eksikliği olan farelere BMCMC'lerin intravenöz (i.v.) enjeksiyonları, mesane enfeksiyonu34,astım35,akciğer fibrozis36ve antikor aracılı artrit37modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde MCC'lerin rollerini incelemek için birçok grup tarafından kullanılmıştır.
    1. Soğuk DMEM'de uygun sayıda hücre sayın ve 2,5 x10 7 BMCMC/ml'de (5 x10 6 BMCMC/200 μl) yeniden depolayın. BMCMC çözeltisini 30 G iğne ile donatılmış 1 ml şırıngaya aktarın. Enjeksiyona kadar buzda tutun.
    2. İzofluran kullanarak 4-6 haftalık MC eksikliği olan fareleri uyuşturmak (%2,5 v/v). Anestezinin derinliğini ayak parmağıyla kıstırın, belirtilmişse izofluranları ayarlayın ve işlem boyunca solunum ve ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. Göz kuruluğu önlemek için bir Q ucu ile oftalmik merhem uygulayın.
    3. MC eksikliği olan bir farenin kuyruk damarına (veya alternatif olarak retro-orbital damara) 200 μl BMCMC çözeltisinin bir enjeksiyonunu gerçekleştirin. In vivo deneyler yapmadan önce i.v. gravürden sonra 12 hafta bekleyin.

3. Engrafted Mast Hücre eksikliği Olan Farelerin Analizi.

  1. Kulak engraftment analizi.
    1. Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık.
    2. Kulak pinnae izole ve 4 °C gece boyunca% 10 (vol/vol) tamponlanmış formalin sabitlemek. Sabit kulak pinnae'yi parafin içine gömün, 4 μm kulak pinnae bölümlerini kesin ve cam slaytlara monte edin.
    3. Slaytları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 0.1 Toluidine mavi çözeltisi ile lekeleyin. Slaytları musluk suyunda 1 dakika yıkayın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.
    4. Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında, ardından hafif bir mikroskop kullanarak pinnae bölümleri başına engrafted MC sayısını sayın. Engrafted farelerin kulak derisindeki MCS'lerin yüzdesini ve dağılımını vahşi tip farelerle karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.
  2. Periton kavitesi gravür analizi.
    1. Periton boşluğundaki mast hücreleri sayısının değerlendirilmesi.
      1. Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık. Periton boşluğunu kırmadan farelerin ventral derisini dikkatlice çıkarın.
      2. 25 G iğne ile donatılmış 5 ml şırınga kullanarak periton boşluğuna 5 ml soğuk veya oda sıcaklığıNDA PBS enjekte edin. Periton hücrelerinin aktive olma riskini azaltmak için soğuk PBS kullanın (peritoneal MC degranülasyonunu veya periton lavaj sıvısındaki bazı MC türevli ürünlerin seviyelerini değerlendirirken bu çok önemlidir). Periton hücrelerini toplamak için 20 saniye boyunca karın masajı yapın.
      3. Periton lavajını 22 G iğne ile donatılmış 5 ml'lik bir şırınga kullanarak yavaşça emiş yapın. Emişli lavaj hacmini kaydedin (enjekte edilen hacmin% 80'ine kadar iyileşmeyi bekleyin).
      4. Periton lavaj sıvılarını 5 ml polistiren yuvarlak alt tüpe ve santrifüjü 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da aktarın. Aspirate süpernatant. Peleti 400 μl soğuk PBS'de geri kazan.
      5. Hemositometre odası kullanarak periton hücrelerinin toplam sayısını sayın. Periton boşluğundaki engrafted MC'lerin yüzdesini ve işaretleyici ifadesini değerlendirmek için hücre süspansiyonunun yarısını akış sitometri analizi için kullanın (adım 1.3.1'de açıklandığı gibi). Mutlak peritonEal GC sayısı elde etmek için toplam periton hücresi sayısını VC'lerin yüzdesiyle çarpın.
      6. 1.3.2.2 adımında açıklandığı gibi kalan hücrelerle bir sitosantrifüjasyon gerçekleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kuru kaydıraklar ve pap kalem kullanarak hücrelerin etrafına balmumu dairesi çizin.
      7. Filtrelenmemiş May-Grünwald Boyama solüsyonu ile hücreleri 5 dakika örtün, ardından PBS'de her ikisi de oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın. Giemsa lekeli hücreleri deiyonize su ile 1:20 seyreltin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırnın. Slaytları musluk suyunda 2 kez 1 dakika yıkayın, ardından havayla kuru slaytlar.
      8. Montaj ortamını kullanarak hücreleri kapsar ve ışık mikroskobu kullanarak (en az 400 toplam hücre sayarak) engrafted MCS'lerin yüzdesini hesaplar. Engrafted farelerin periton lavajındaki MCS'lerin yüzdesini vahşi tip farelerle karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.
    2. Mezenterik pencerelerdeki mast hücrelerinin değerlendirilmesi.
      1. 3.2.1 adımında açıklanan periton lavajını takiben, farelerin bağırsak sistemini açığa çıkarmak için periton zarını kesin. Fare başına 4 ila 5 mezenterik pencereyi bir slayda yerleştirin.
      2. Oda sıcaklığında Karnoy çözeltisinde (3:2:1 vol/vol/vol etanol, kloroform ve buzul asetik asit) slaytları 1 saat sabitleyin. Havayla kuru kayar ve bağırsağı çıkarın (sabit mezenterik pencereler slaytlara bağlı kalacaktır).
      3. Oda sıcaklığında 20 dk'ya kadar olan preparatları Csaba (Alcian blue/Safranin O) boyama solüsyonu ile lekelenin.
        1. 500 ml Csaba lekesi yapmak için, 100 ml 1 M sodyum asetat çözeltisini 120 ml 1 M HCl ile karıştırarak 500 ml asetat tamponu hazırlayın. Daha sonra, 90 mg Safranin [kırmızı 'olgun MC'leri tanımlar], 1,8 g Alcian mavisi [mavi 'olgunlaşmamış MC'leri tanımlar] ve 2,4 g ferrik amonyum sülfatNH 4Fe(SO4)2'yi 500 ml asetat tamponuna çözün.
      4. Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında, ardından hafif bir mikroskop kullanarak mezenterik pencere başına engrafted MCS sayısını sayın. Engrafted farelerin mezenterik pencerelerindeki MCS'lerin yüzdesini ve dağılımını vahşi tip farelere karşı karşılaştırarak engraftment verimliliğini değerlendirin.
  3. I.V. gravür analizi.
    1. Deneyin sonunda, fareleri CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık ve ilgili doku(örneğin akciğer, cilt veya dalak) hasat edin ve 4 °C'de% 10 (vol/ vol) tamponlu formalin'de bir gecede sabitlenin.
    2. Sabit dokuları parafin içine gömün, 4 μm bölüm kesin ve cam slaytlara monte edin. Slaytları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 0.1 Toluidine mavi çözeltisi ile lekeleyin. Slaytları musluk suyunda 1 dakika yıkayın, ardından 10 dakika boyunca hava kurusu slaytları yıkayın.
    3. Montaj ortamını kullanarak kapak kaydırağında bulunur ve ışık mikroskobu kullanarak doku bölümleri başına engrafted MCS sayısını ve dağılımını değerlendirir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

'Mast cell knock-in' yaklaşımına genel bir bakış Şekil 1'degösterilmiştir ve BMCMC'lerin neslini, MC eksikliği olan farelere (deneysel tasarıma göre belirtilirse sayı değişebilir) ve enjeksiyon bölgesine bağlı olarak engraftasyon ve deney arasındaki aralığı içerir (bu aralık belirtilirse değişebilir; örneğin,MC sitoplazmik granüllerde depolanan mediatörlerin içeriği zamanla sürekli artar38). Şekil 2'de IL-3 kaynağı olarak %2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İlk açıklamasından neredeyse30yıl sonra 38 , 'mast cell knock-in' yaklaşımı, MCS'lerin vivo olarak neler yapabileceği veya yapamayacağı hakkında değerli bilgiler sağlamaya devam ediyor. MCS'lerin işlevlerinin uzun zamandır alerjideki rolleriyle sınırlı olduğu düşünülüyordu. ' Mast cellknock-in' yaklaşımı kullanılarak oluşturulan veriler, MCS'lerin diğer işlevlerin yanı sıra, belirli patojenlere karşı konak savunmasında kritik roller oynayabileceğ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

N.G., Fransız "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" ve Philipp Vakfı'ndan burs alan; R.S., Lucile Packard Çocuk Sağlığı Vakfı ve Stanford NIH/NCRR CTSA ödül numarası UL1 RR025744 tarafından desteklenmektedir; Not: Max Kade Vakfı ve Avusturya Bilimler Akademisi'nden Max Kade Bursu ve Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF) Schröder Bursu tarafından desteklenmektedir: J3399-B21; S.J.G., Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin U19 AI104209, NS 080062 ve Kaliforniya Üniversitesi Tütünle İlgili Hastalık Araştırma Programı'ndan destek verdiğini kabul eder; L.L.R., Artrit Ulusal Araştırma Vakfı (ANRF) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi K99AI110645'in desteğini kabul ediyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Antibiotic-Antimycotic SolutionCorning cellgro30-004-Cl
3 ml SyringeFalcon309656
35 mm x 10 mm DishCorning cellgro430588
5 ml Polystyrene Round Bottom TubeFalcon352058
Acetic Acid GlacialFisher ScientificA35-500
Alcian Blue 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R CentrifugeBeckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) PurifiedeBioscience14-0161-81
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB SyringeBD Syringe309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) NeedlesBD Precision Glide Needle205155
BD 25 G 5/8 NeedlesBD Syringe305122
BD 30 G x 1/2 NeedlesBD Precision Glide305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical TubeFalcon352097
ChloroformFisher ScientificC298-500
Cytoseal 60 Mounting MediumRichard-Allan Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
DakoCytomation penDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
EthanolSigma AldrichE 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat InactivatedSigma AldrichF4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype ControleBioscience14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)eBioscience11-1171-82
FormaldehydeFisher ScientificF79-500
Giemsa Stain ModifiedSigma AldrichGS-1L
IsothesiaHenry Schein Animal Health29405
May-Grunwald StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6 well platesFalcon35 3046
Olympus BX60 MicroscopeOlympusNA
Paraplast Plus Tissue Embedding MediumFisher Brand23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype ControleBioscience12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)eBioscience12-5898-82
Propidium Iodide Staining SolutioneBioscience00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3Peprotech213-13
Safranin-o CertifiedSigma AldrichS8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
Toluidine Blue 1% AqueousLabChem-IncLC26165-2
Recombinant Mouse SCFPeprotech250-03

Referanslar

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 99c kitk k h cre fakt rFc RIimm noglobulin Efare modelievlat edinme transferiimm nolojialerji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır