מפעילה תגובתי דבקה<em&gt; In vivo</em&gt; על ידי המוח הקדמי דקירת פגיעה

Summary

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Abstract

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Introduction

A major challenge for developing successful therapies to treat the injured CNS is an incomplete understanding of the complex multicellular events that are triggered by the trauma. Reactive astrocytes are gaining increasing recognition as a promising target for novel therapies¹. Though historically regarded as hostile to neural repair, reactive astrocytes are now recognized as critical components of a complex, multicellular neuroprotective response that includes attenuation of inflammatory processes and limiting secondary damage and neurodegeneration^2-6. Although the neuropathological characteristics of reactive gliosis have long been well defined, the cellular and molecular mechanisms regulating reactive gliosis, and the diverse array of downstream consequences remain poorly understood. Understanding the mechanisms that drive reactive gliosis, as well as the subsequent cellular and molecular events, is an important step towards developing strategies aimed at promoting the neuroprotective properties of reactive gliosis, while attenuating the detrimental effects.

Here we demonstrate a method to induce severe reactive astrogliosis in the forebrain of adult mice using a stab injury. In contrast to other traumatic brain injury (TBI) models, such as controlled cortical impact (CCI) or fluid percussion injury (FPI), which require specialized equipment to produce an injury, the forebrain stab requires only a stereotaxic device to stabilize the head and a No. 11 scalpel blade. Thus the forebrain stab lesion model is more broadly accessible to a wide range of laboratories that do not have access to the specialized devices necessary for creating an FPI or CCI injury. The method described here enables investigators to reliably and reproducibly trigger a robust gliosis response to investigate subsequent cellular and molecular events. Once recovered from surgery, animals that have received a forebrain stab injury can survive for prolonged periods without the need for specialized care and can be returned to the colony for acute, intermediate, or chronic studies. Though less clinically translatable than FPI or CCI models of TBI, a forebrain lesion produced by a stab injury serves as a simple yet useful experimental model to investigate basic biological mechanisms underlying reactive gliosis and other neuropathological events following trauma to the CNS.

Protocol

למבוגרים עכברים (ישנים 3-4 חודשים) גבריים על C57BL / 6 רקע מעורב שמשו בפרוטוקול זה. בעלי חיים הוחזקו בשעתי אור 12 / מחזור כהה, ואפשרו גישה חופשית למזון ומים. כל הפרוצדורות שבוצעו בפרוטוקול זה נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת דרקסל האוניברסיטה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש.

1. הכנת אזור ניתוח

1. לחטא שולחן כירורגית עם 70% אתנול, ואז לכסות את הספסל כירורגית כל עם רפידות סופגים ולארגן מכשירי ניתוח בסמוך לstereotaxic.
2. הגדר את ציוד stereotaxic ללא זרוע מניפולטור. מסדרים את כרית החימום על stereotaxic ומוגדר 37 מעלות צלזיוס. למנוע התחממות יתר של בעלי החיים על ידי הצבת חתיכה קטנה של נייר מגבת או כרית כירורגית בין בעלי החיים וכרית החימום.
3. בעזרת המספריים autoclaved, לחתוך לחתיכות קטנות של gelfoam autoclaved לתוך צלחת פטרי המכילה סטרילי תמיסת מלח 0.9% סטרילי עד Ready לשימוש.
   הערה: לשמור על סביבת עבודה סטרילית ידי שימוש במכשירי autoclaved ואספקת ניתוח סטרילי. מחדש לעקר מכשירי ניתוח במהלך ההליך או בבעלי החיים בין על ידי טבילה למעקר חרוז במשך 10-15 שניות, בהתאם לצורך. לשמור על כפפות נקיות לאורך כל ההליך על ידי שפשוף ידיים עם 70% אתנול, במידת צורך, כדי לחטא.

2. prepping עכבר לכירורגיה

1. הסר עכבר מכלוב בבית ולשקול (ז).
2. עכבר מקום לתא אינדוקציה isoflurane וחמצן מוגדר 2 ליטר / דקה ומאדה isoflurane עד 5 כדי לגרום למטוס של הרדמה כירורגית, כ 3-5 דקות. לפקח על נשימה וחוסר תנועה מואטת. בדוק שהעכבר מסומם באופן מלא באמצעות רפלקס קמצוץ הבוהן.
3. כאשר עכבר מסומם לחלוטין, למקם במסגרת stereotaxic, לאבטח את האף בחרטום, אשר מצורף עם צינורות לisoflurane. הכנס ברים אוזן לתוך תעלת אוזן ולהדק, הבטחת הראש היא יציבה.
4. לגלח את ראשך מאוזן לאוזן, ומבין העיניים למאחורי האוזניים.
5. לעקר את העור עם מגבונים לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל ותמיסת יוד בטאדין, 3 פעמים כל אחד.
6. החל דמעות מלאכותיות לשתי העיניים כדי למנוע מהם מהתייבשות במהלך ההליך הכירורגי.

3. נוהל כירורגי

1. צג עומק ההרדמה על ידי צובט את הבוהן או זנב. העכבר הוא במישור הניתוחי המתאים כאשר אין תגובה, והנשימה איטית ואפילו.
2. לעשות חתך בעור parasagittal מרק מאחורי העיניים לכמעט בין האוזניים בתנועה אחת, חברה אחת באמצעות סכין אזמל מס '11. הזז עור בצד וקליפ צד ימין עם hemostat.
3. גולגולת ברורה של קרום שמעליה באמצעות הצד הקהה של אזמל מס '11 וכותנה הטתה applicators. לחלופין, למחוק את הגולגולת עם מוליך כותנה שקצהו טבול בשיעור של 0.9% תמיסת מלח. לאפשר לו להתייבש לחלוטין.
4. שלנוing שליט קטן, לסמן את הגבול הקדמי של פתיחת הגולגולת בזנב 1 מ"מ לתפר העטרה, והקצה השמאלי של פתיחת הגולגולת ליום 1 במ"מ לרוחב תפר sagittal (איור 1), עם סמן קבע. לאחר מכן לסמן את הזכות וגבולות הזנב של פתיחת הגולגולת ב 4 מ"מ מתפרי sagittal ו עטרה, בהתאמה (איור 1).
5. באמצעות מקדח 0.5 מ"מ, מתחיל לעשות craniotomy על ידי קידוח לאט הבא המתווה סמן הקבועה. הקפד שלא לפרוץ את הגולגולת לחלוטין. לחץ בעדינות על פיסת העצם הקודקודית עם מס '5 מלקחיים המבודדים, אזורים של חולשה ייתן דרך הלחץ. כאשר העצם דליל חלש מספיק לאורך ההיקף, חתיכת העצם מוכנה להסרת.
   הערה: אם קושי חוויות חוקר הסרת העצם בחתיכה אחת, זה מצביע על כך שהעצם לא היה דליל מספיק במהלך קידוח. שקול קידוח הגולגולת נוספת בבעלי חיים לאחר facilitaהסרה קלה te של חתיכת העצם.
6. באמצעות מצויד במחט G 23 מזרק 10 מיליליטר, למרוח כמות קטנה של תמיסת מלח 0.9% להשרות את העצם המבודד ואזור שנקדח.
7. צרף את זרוע מניפולטור לציוד stereotaxic. צרף להב סכין מנתחים מס '11 חדש לבעל הבדיקה עם הצד החד של הלהב מול rostrally.
   הערה: למרות שהרקמות מקורי ואת הזנב לחוות את הקצוות החדים ובוטים של הלהב, בהתאמה, הנזק המכני הנגרם על ידי הפציעה החודרת דומה בכל רחבי היקף הנגע. אנו צופים אין הבדלים משמעותיים במאפיינים עיקריים של דבק תגובה כוללים upregulation ביטוי GFAP או הפצה, בין חלקים מקורי ואת הזנב.
8. שמירת מהדרך זרוע מניפולטור, להרים בזהירות את העצם המבודד באמצעות 5/45 מלקחיים זווית. הכנס את קצה המלקחיים לצד של העצם והרמה המבודדים, שימוש במינוף למשוך את פיסת העצם שנשארה באחד פולתנועת l.
   הערה: היזהר שלא לדקור את המוח או להפריע הדורה מתחת לגולגולת.
9. קח חתיכה קטנה של קצף ג'ל נספג הספוג ומניח על המוח החשוף כדי למנוע ממנו להתייבש ולספוג את כל דם שעלולה להיות נוכח.
10. ברגע שקצף ג'ל הוא במקום, הנדנדה זרוע מניפולטור למקום ולהב להסתגל למרכז craniotomy מעל קצף ג'ל. הסר את קצף ג'ל ולהוריד את הלהב עד הקצה נוגע הדורה ללא ניקוב הדורה. מארק גב / קואורדינטות הגחון תוך שימוש בסולם ורניה על הזרוע האנכית של stereotaxic.
11. באמצעות זרוע מניפולטור, לאט לאט להוריד את הלהב 3 מ"מ בדיוק לתוך המוח. זו מושגת על ידי שימוש בסימונים בקנה מידה ורניה על זרוע מניפולטור. לאפשר להב להישאר במקום במשך 5-10 שניות. הזז את זרוע stereotaxic עם קובץ מצורף מקורי להב הזנב שלוש פעמים מאפשרות את הלהב כדי להגיע לגבולות מקורי ואת הזנב של פתיחת הגולגולת, לפני שעברתי לopposiסוף te.
    הערה: הדורה לא יוסר לפני החדרת הלהב. בניגוד לדורת החולדה, שהוא ~ 80 מיקרומטר בעובי ^7, הדורה העכבר היא משמעותי יותר רזה (רק כמה שכבות תאים עבים) ולא לייצר התנגדות ניכרת ללהב סכין המנתחים בכניסה. השתמש בלהב סכין מנתחים חדש עבור כל עכבר כדי להבטיח שכל חיה מקבלת פגיעה עקבית.
12. לאט לאט להעלות את זרוע stereotaxic, הסרת הלהב מהמוח. לאחר ההסרה של הלהב, מקום מייד חתיכת gelfoam אחרת על פני השטח של המוח כדי לספוג את כל דם או נוזלים עודפים.
13. בינתיים, להסיר את זרוע stereotaxic ולהשליך את להב סכין המנתחים מס '11. ברגע שהדימום נפסק, להסיר את gelfoam.
14. לסגור את הפצע על ידי תפירת העור עם תפר שאינו נספג, כגון ethilon או prolene. תפרים יש להסיר 9-10 ימים לאחר ניתוח.
15. החזר את העכבר לכלוב בבית שלה, ולאפשר העכבר כדי להתאושש לאט על חימוםכרית גרם ולפקח על כל סימני מצוקה. התאוששות מהרדמה מושרה isofluorane מתרחשת בדרך כלל בתוך 2-5 דקות לאחר ההסרה מisofluorane. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהוא חזר recumbancy sternal.
16. לנהל 0.5-1 מיליליטר של תת עורי תמיסה הרטמן כדי להבטיח לחות.

טיפול 4. לאחר ניתוח

1. באופן הדוק לפקח בעלי חיים שלאחר ניתוח עד להחלמה מהרדמה לפני ההחזרה למושבה.
   1. כדי להפחית את הכאב ואי נוחות לאחר ניתוח, לנהל 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות על ידי הזרקת IP ביצוע ההליך באופן מיידי.
   2. תצפיות על בעלי חיים במשך 2-3 ימים לאחר ניתוח לסימני מצוקה קשים כגון תנועות מוגבלות, חוסר הטיפוח, או ירידה במשקל. להרדים בעלי חיים מפגינים כל סימני מצוקה אלה ולהסיר מהמחקר.
2. כדי לבחון histopathology של רקמות פצועות, להרדים בעלי חיים על ידי סטןזלוף intracardial dard.
   1. בקצרה, להרדים חיות עם מנת יתר של קטמין / xylazine, אז perfused intracardially עם 15-20 מיליליטר של 0.9% NaCl, או עד שהכבד מתנקה מדם, ואחריו 60 מיליליטר של paraformaldehyde 4% בסיומו של הניסוי.
3. לנתח את מוח ולאחר תיקון-2-4 שעות בparaformaldehyde 4% לפני העברה לתמיסת סוכרוז 30%. מוח סעיף על cryostat ב40-60 מיקרומטר, ותהליך על ידי נהלים היסטולוגית או immunohistochemical סטנדרטיים, או כפי שמתואר בגרסיה ^8,9.

תוצאות

בגלל בעלי חיים שעברו הליך זה אינו דורשים תקופות הישרדות מיוחדות טיפול שלאחר ניתוח, קצרות או זמן ארוך טווח משולבים בקלות לתוך המחקר, בהתאם לצורך לחקור פתולוגיה אקוטית או כרונית בעקבות פציעה. תכונות עיקריות של דבק תגובתי, כגון גברת ביטוי של GFAP והיפרטרופיה של סומה, ניתן ...

Discussion

זה קריטי, כי הגולגולת או דורה שבבסיסם לא ניזוקו במהלך הקידוח. השתמש לחץ קל בעת קידוח על מנת להבטיח את הגולגולת לא ניקב. בנוסף, יש להקפיד בעת הרמת חתיכת הגולגולת כדי להבטיח את הדורה לא המריא עם העצם.

פציעת דקירת המוח הקדמי מתוארת כאן...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
High speed micro drill	Harvard Apparatus	724950
stainless steel scalpel blade, #11	MedVet	JOR581S
5/45 angled forceps	Fine Science Tools	11251-35
Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO	Z033429-2	Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence)
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution - 1:400 (bright-field)
Biotinylated rabbit anti-sheep	Vector Laboratories	BA-6000	Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A-11008	Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 568 donkey anti-sheep	Life Technologies	A-21099	Dilution - 1:1,000 (fluorescence)
DAPI Nucleic Acid Stain	Life Technologies	D3571	Dilution - 1:1,000 (fluorescence)
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042-10G	Dilution - 1% (bright-field)