Auslösen Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Vorderhirn Stab Injury

Zusammenfassung

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Zusammenfassung

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Einleitung

A major challenge for developing successful therapies to treat the injured CNS is an incomplete understanding of the complex multicellular events that are triggered by the trauma. Reactive astrocytes are gaining increasing recognition as a promising target for novel therapies¹. Though historically regarded as hostile to neural repair, reactive astrocytes are now recognized as critical components of a complex, multicellular neuroprotective response that includes attenuation of inflammatory processes and limiting secondary damage and neurodegeneration^2-6. Although the neuropathological characteristics of reactive gliosis have long been well defined, the cellular and molecular mechanisms regulating reactive gliosis, and the diverse array of downstream consequences remain poorly understood. Understanding the mechanisms that drive reactive gliosis, as well as the subsequent cellular and molecular events, is an important step towards developing strategies aimed at promoting the neuroprotective properties of reactive gliosis, while attenuating the detrimental effects.

Here we demonstrate a method to induce severe reactive astrogliosis in the forebrain of adult mice using a stab injury. In contrast to other traumatic brain injury (TBI) models, such as controlled cortical impact (CCI) or fluid percussion injury (FPI), which require specialized equipment to produce an injury, the forebrain stab requires only a stereotaxic device to stabilize the head and a No. 11 scalpel blade. Thus the forebrain stab lesion model is more broadly accessible to a wide range of laboratories that do not have access to the specialized devices necessary for creating an FPI or CCI injury. The method described here enables investigators to reliably and reproducibly trigger a robust gliosis response to investigate subsequent cellular and molecular events. Once recovered from surgery, animals that have received a forebrain stab injury can survive for prolonged periods without the need for specialized care and can be returned to the colony for acute, intermediate, or chronic studies. Though less clinically translatable than FPI or CCI models of TBI, a forebrain lesion produced by a stab injury serves as a simple yet useful experimental model to investigate basic biological mechanisms underlying reactive gliosis and other neuropathological events following trauma to the CNS.

Protokoll

Erwachsene (3-4 Monate alt) männlichen Mäusen auf eine gemischte C57BL / 6 Hintergrund wurden in diesem Protokoll verwendet. Die Tiere wurden auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus gehalten und freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Verfahren in diesem Protokoll durchgeführt wurden nach Protokollen, die von der Drexel University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt durchgeführt.

1. Vorbereitung OP-Bereich

1. Desinfizieren Sie OP-Tisch mit 70% Ethanol, dann decken die gesamte chirurgische Bank mit absorbierenden Kissen und vereinbaren chirurgische Instrumente neben stereotaktischen.
2. Up stereotaktischen Gerät ohne Manipulatorarmes gesetzt. Ordnen Sie das Heizkissen auf der stereotaktischen und auf 37 ° C eingestellt. Vermeiden Sie eine Überhitzung des Tieres, indem Sie ein kleines Stück Papiertuch oder einem chirurgischen Polster zwischen dem Tier und dem Heizkissen.
3. Verwendung autoklaviert Schere, geschnitten kleine Stücke autoklaviert Gelschaum in eine sterile Petrischale gegeben, die 0,9% steriler Kochsalzlösung, bis ready zum Einsatz.
   Hinweis: Halten Sie sterile Arbeitsumgebung durch die Verwendung autoklaviert Instrumente und sterile OP-Bedarf. Erneute Sterilisation chirurgischer Instrumente während des Eingriffs oder zwischen Tieren durch Eintauchen in eine Perle Sterilisator für 10-15 sec, je nach Bedarf. Pflegen Sie saubere Handschuhe während des gesamten Verfahrens durch Reiben Hände mit 70% Ethanol, bei Bedarf zu desinfizieren sein.

2. Prepping Maus für Chirurgie

1. Entfernen Sie Maus von zu Hause aus Käfig und wiegen (g).
2. Bewegen Sie die Maus in Isofluran Induktionskammer und setzen Sauerstoff zu 2 l / min und Isofluran Verdampfer bis 5, eine chirurgische Ebene der Anästhesie, etwa 3-5 min zu induzieren. Monitor für verlangsamte Atmung und Immobilisierung. Überprüfen Sie, ob die Maus ist komplett mit der Zehe Prise Reflex sediert.
3. Bei der Maus vollständig sediert wird, legen Sie in stereotaktischen Rahmen, sichern Sie die Nase in der Nasenkegel, der mit Schlauch an den Isofluran angebracht ist. Stecken Ohr Bars in den Gehörgang ein und ziehen Sie, die Gewährleistung der Kopf ist stabil.
4. Rasur des Kopfes von Ohr zu Ohr, und zwischen den Augen, um hinter den Ohren.
5. Sterilisieren der Haut mit abwechselnden Wischtücher aus Isopropylalkohol und Betadin Jodlösung jeweils 3 mal.
6. Künstliche Tränen für beide Augen, um sie vor dem Austrocknen während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.

3. Chirurgische Verfahren

1. Überwachung der Narkosetiefe durch Kneifen der Zehe oder Schwanz. Die Maus in die entsprechende chirurgische Ebene, wenn es keine Antwort gibt, und die Atmung ist langsam und gleichmäßig.
2. Machen Sie eine parasagittal Hautschnitt von gerade hinter den Augen, fast zwischen den Ohren in einer einzigen, festen Bewegung unter Verwendung eines Nr 11 Skalpellklinge. Bewegen Sie die Haut beiseite und Clip rechts mit Gefäßklemme.
3. Klar Schädel des darüberliegenden Membran mit der stumpfen Seite der No. 11 Skalpell und Wattestäbchen Applikatoren. Gegebenenfalls wischen Sie die Schädel mit Wattestäbchen in 0,9% Kochsalzlösung eingetaucht. Komplett trocknen lassen.
4. Unsing ein kleines Lineal, markieren Sie den vorderen Rand des Kraniotomie bei 1 mm kaudal der Kranznaht, und dem linken Rand des Kraniotomie bei 1 mm lateral der Pfeilnaht (Abbildung 1), mit einem wasserfesten Stift. Markieren das rechte und Schwanz Grenzen der Kraniotomie bei 4 mm von der sagittalen und koronalen Naht, bzw. (Abbildung 1).
5. Unter Verwendung einer 0,5 mm Bohrer, beginnen, Kraniotomie durch Bohren langsam nach dem Permanentmarker Umriss zu machen. Achten Sie darauf, durch den Schädel vollständig zu brechen. Drücken Sie vorsichtig auf den isolierten Stück Scheitelbein mit No. 5 Zangen, Schwachstellen werden bis zum Druck zu geben. Wenn die ausgedünnt Knochen ist im gesamten Umfang ausreichend schwach, ist die Knochenstück zum Ausbau bereit.
   HINWEIS: Wenn die Ermittler Erfahrungen Schwierigkeiten beim Entfernen der Knochen in einem Stück, bedeutet dies, dass Knochen nicht ausreichend beim Bohren ausgedünnt. Betrachten Sie weitere Bohren des Schädels in den Folge Tiere facilitate ein leichtes Entfernen des Knochenstück.
6. Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 23 G-Nadel ausgestattet, eine kleine Menge von 0,9% Salzlösung, um das isolierte Knochen gebohrt und Umgebung genießen.
7. Befestigen Sie den Manipulatorarm zu der stereotaktischen Geräte. Befestigen Sie eine neue Nummer 11 Skalpellklinge auf die Sondenhalter mit der scharfen Seite der Klinge gegen rostral.
   HINWEIS: Obwohl die rostral und Schwanzgewebe erleben Sie die scharfen und stumpfen Kanten der Klinge bzw. ist die mechanische Beschädigung durch den durchdringenden Verletzungen induziert in der gesamten Ausdehnung der Läsion vergleichbar. Wir beobachten keine nennenswerten Unterschiede in der Hauptmerkmale der reaktiven Gliose einschließlich Hochregulation von GFAP-Expression oder Proliferation, zwischen rostralen und kaudalen Abschnitte.
8. Halten Sie den Manipulatorarm aus dem Weg, heben Sie die isolierten Knochen mit 5/45 abgewinkelt Pinzette. Legen Sie die Spitze der Zange in die Seite des isolierten Knochen und Lift, mit Hebelwirkung, um das Knochenstück hinter einem ful links abziehenl Bewegung.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, um das Gehirn zu erstechen oder stören die Dura unter dem Schädel.
9. Nehmen Sie ein kleines Stück des getränkten resorbierbare Gel-Schaum und auf den freigelegten Gehirn, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern und genießen Sie kein Blut, die vorhanden sein könnten.
10. Sobald das Gel Schaum vorhanden ist, schwingen die Manipulatorarm in Stelle und passen Klinge Zentrum Kraniotomie über das Gel-Schaum. Entfernen Sie die Gel-Schaum und senken Sie die Klinge, bis die Spitze der Dura berührt, ohne Punktion der Dura. Mark dorsal / ventral Koordinaten unter Verwendung des Nonius auf der vertikalen Arm der stereotaktischen.
11. Unter Verwendung des Manipulatorarmes, langsam senken die Klinge genau 3 mm in das Gehirn. Dies wird mit Hilfe der Noniusskala Markierungen auf dem Manipulatorarm erreicht. Lassen Sie Messer, um im Platz für 5-10 sec bleiben. Bewegen Sie den stereotaktischen Arm mit Blattansatz rostral bis dreimal so das Blatt, um die rostralen und kaudalen Grenzen der Kraniotomie zu erreichen, bevor er nach dem Einspruch kaudalte Ende.
    HINWEIS: Die Dura wird nicht entfernt, bevor die Klinge eingesetzt wird. Im Gegensatz zur Ratten-Dura, das ist ca. 80 um Dicke ⁷ ist die Maus dura wesentlich dünner (nur wenige Zellschichten dick) und keinen nennenswerten Widerstand auf die Skalpellklinge während des Einsetzens erzeugen. Verwenden ein neues Skalpellklinge für jede Maus, um sicherzustellen, dass jedes Tier eine konsistente Verletzung.
12. Langsam heben die stereotaktischen Arm, das Entfernen der Klinge aus dem Gehirn. Nach dem Entfernen der Klinge, sofort mit einem weiteren Stück Gelschaum auf der Hirnoberfläche zu tanken überschüssige Blut oder Flüssigkeit.
13. In der Zwischenzeit, entfernen Sie den stereotaktischen Arm und entsorgen Sie die No. 11 Skalpellklinge. Sobald Blutung aufgehört hat, entfernen Sie die Gelschaum.
14. Schließen Sie die Wunde durch Naht der Haut mit nicht-resorbierbares Nahtmaterial, wie zum Beispiel Ethilon oder Prolene. Nähte sollten nach der Operation entfernt werden 9-10 Tage.
15. Rückflug die Maus, um seinen eigenen Käfig, und lassen Sie die Maus, um langsam auf einem heatin erholeng-Pad und Monitor für jegliche Anzeichen von Leiden. Erholung von Isofluran-induzierten Anästhesie tritt normalerweise innerhalb von 2-5 min nach Entnahme aus dem Isofluran. Stellen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es sternale Festliegen wiedererlangt.
16. Verabreichen 0,5-1 ml Ringer-Laktat-Lösung subkutan Hydratisierung sicherzustellen.

4. Post-OP-Pflege

1. Tiere nach der Operation genau zu überwachen, bis aus der Narkose vor der Rückkehr in die Kolonie.
   1. Um Schmerzen und Beschwerden nach der Operation zu reduzieren, zu verwalten 0,05-0,1 mg / kg Buprenorphin durch ip-Injektion unmittelbar nach dem Eingriff.
   2. Beobachten Sie Tiere für 2-3 Tage nach der Operation für schwere Anzeichen von Leiden, wie beschränkt Bewegungen, mangelnde Pflege oder Gewichtsverlust. Euthanize Tieren demonstriert jede dieser Anzeichen von Leiden und von der Studie zu entfernen.
2. Um Histopathologie der verletzten Gewebe zu untersuchen, einschläfern Tiere durch standard intrakardiale Perfusion.
   1. Kurz anästhesiert Tiere mit einer Überdosis an Ketamin / Xylazin, dann intrakardial mit 15-20 ml 0,9% NaCl perfundiert, oder bis die Leber von dem Blut eliminiert, gefolgt von 60 ml einer 4% Paraformaldehyd bei Abschluss des Experiments.
3. Sezieren Gehirne und post-fix für 2-4 Stunden in 4% Paraformaldehyd vor der Übertragung auf 30% Saccharose-Lösung. Abschnitt Gehirn auf einem Kryostaten bei 40-60 um und Prozess durch histologische Standard oder immunhistochemische Verfahren, oder wie in Garcia ^8,9 beschrieben.

Ergebnisse

Weil Tiere unterziehen dieses Verfahren benötigen keine spezielle postoperative Pflege, kurz- oder langfristige Überlebenszeitperioden lassen sich leicht in die Studie aufgenommen, je nach Notwendigkeit, akute oder chronische Pathologie nach der Verletzung zu untersuchen. Hauptmerkmale der reaktiven Gliose, wie Hochregulation von GFAP und Hypertrophie von Soma, kann so früh wie 2-3 Tage nach der Verletzung beobachtet werden. Die Hochphase der Proliferation für reaktive Astrozyten ist während der Tage 3-5 nach der V...

Diskussion

Es ist kritisch, daß der Schädel oder der zugrunde liegenden Dura nicht während des Bohrens beschädigt wird. Mit leichtem Druck während des Bohrens, um den Schädel zu gewährleisten wird nicht punktiert. Außerdem sollte darauf geachtet werden, beim Anheben der Schädelteil auf die Dura zu gewährleisten ist nicht mit dem Knochen abgehoben werden.

Das Vorderhirn Stichverletzung hier beschriebenen Modelle eine durchdringende Verletzungen des ZNS. Obwohl weniger klinisch übersetzbar als...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
High speed micro drill	Harvard Apparatus	724950
stainless steel scalpel blade, #11	MedVet	JOR581S
5/45 angled forceps	Fine Science Tools	11251-35
Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO	Z033429-2	Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence)
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution - 1:400 (bright-field)
Biotinylated rabbit anti-sheep	Vector Laboratories	BA-6000	Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A-11008	Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 568 donkey anti-sheep	Life Technologies	A-21099	Dilution - 1:1,000 (fluorescence)
DAPI Nucleic Acid Stain	Life Technologies	D3571	Dilution - 1:1,000 (fluorescence)
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042-10G	Dilution - 1% (bright-field)