הכנת תיאום מאוד נקבובי פולימר ציפויים על מונוליתים פולימר Macroporous להעשרה משופרת של Phosphopeptides

Summary

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Abstract

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.

The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

Introduction

פולימרים נקבוביים תיאום (PCPs) הם תרכובות המבוססים על תיאום מרכזי מתכת מקושרים על ידי ligands האורגני עם חוזר גופי תיאום הארכה ב 1, 2 או 3 ממדים שיכולים להיות אמורפי או גבישי ^1-3. בשנים האחרונות, המעמד הזה של חומרים נקבוביים משך תשומת לב נרחבת בשל הנקבוביות שלהם גבוהות, tunability הכימי הרחב, והיציבות שלהם. PCPs נחקר עבור מגוון של יישומים, כולל אחסון גז, הפרדת גז, וקטליזה ^3-6, ומאוד לאחרונה, היישומים אנליטיים הראשונים של PCPs תוארו ^7.

בגלל PCPs פונקציונלי כימית והנקבובי גבוהים משופר שלהם היו ממוקד לפוטנציאל העצום שלהם לשיפור תהליכי טיהור והפרדות chromatographic, ומספר הדיווחים הנוגעים לנושא זה פורסמו ^7-13. עם זאת, הביצועים של PCPs אינם נמצאים כעת בequivaleרמת NT עם חומרי chromatographic קיימים הנראה בשל דיפוזיה מהירה דרך החללים interparticle גדולים במיטות צפופות של מוצקים אלה בשל המורפולוגיות בדרך כלל בצורה לא סדירה שלהם של החלקיקים או הגבישים שלהם. אריזה הופצה באופן בלתי סדיר זה מובילה לביצועים נמוכים מהצפוי, כמו גם backpressures גבוה טור ומורפולוגיה צורת שיא רצויות ^14,15.

כדי לפתור את הבעיה של דיפוזיה מהירה דרך החללים בין-חלקיקים ובו זמנית לשפר את הביצועים של PCPs עבור יישומים אנליטיים, הפיתוח של חומר היברידי המבוסס על פולימר מונולית macroporous ¹⁶ המכיל את PCP על פני השטח של macropores היית רצוי. פסלי פולימר הם עצמאיים, חומרים חד-חתיכה שיכולה לקיים זרימת הסעה דרך הנקבוביות שלהם, מה שהופך אותם אחת החלופות היעילה ביותר לחרוז אריזה וכבר ממוסחרים בהצלחה על ידי מספר ג ompanies ^17,18. פסלי פולימר נקבוביים מבוססים בדרך כלל על פילמור של מונומר וcrosslinker בנוכחות porogens, אשר בדרך כלל תערובות בינאריות של ממסים אורגניים. יש חומרים מונוליטי מתקבלים מבנה microglobular וחדירות נקבוביות וזרימה גבוהות.

גישה פשוטה לאחד חומרים אלה כדי להכין מונולית פולימר המכילה PCP מבוססת על התוספת הישירה של PCPs כ- מסונתז בתערובת של פילמור מונולית. גישה זו הביאה לPCPs בעיקר נקברה בתוך פיגום פולימרים, ולא להיות פעיל ליישום נוסף של החומר הסופי ^14,15. גישה סינתטית שונה יש צורך בבירור כדי, למשל, לפתח סרטים אחידים של PCPs, או מסגרות מתכת אורגנית גבישים (MOFs) שבו רוב הנקבוביות בתוך הגביש נגישים מmacropores של מונולית הפולימר.

לא "> בזאת אנו מדווחים פרוטוקול פשוט להכנת חומר מתכת אורגנית היברידי פולימר (MOPH) המבוסס על פולימרי תמיכת macroporous עם קבוצות מתאימות פונקציונליות להתקשרות של PCPs, אשר יכולה להיות מיושמות בקלות כאחד עצמאי מונולית פולימר -piece בפורמט טור עם תכונות אופטימליות ליישומי זרימה דרך. הליך סינתזת הפולימר ואחריו מבוסס פתרון טמפרטורת חדר פשוט   שיטה לגדול ציפוי PCP על פני השטח הפנימיים של הנקבוביות של מונולית ^19-20. כדוגמא הראשונה, אנו מתארים את הכנת סרט פולימר תיאום benzenetricarboxylate ברזל (III) (FeBTC) בתוך פולי macroporous מונולית (חומצת סטירן divinylbenzene-methacrylic). שיטה זו יעילה להכנת אבקות בתפזורת כמו גם עמודות נימים והפרוטוקול המתוארים הוא בקלות ישים לPCPs האחר. כדוגמא לפוטנציאל של MOPHs כחומרים פונקציונליים לזרימת throuיישומי GH, אנחנו מוחלים MOPH FeBTC פיתח המכיל ציפוי צפוף של Fe (III) מרכזים להעשיר phosphopeptides מתערובות חלבון מתעכלים ניצול הזיקה המחייבת של phosphopeptides לפה (III). הפרוטוקול פיתח ²¹ מורכב משלושה חלקים עיקריים: הכנת תמיכת מונולית פולימר אורגני macroporous; צמיחה של ציפוי PCP על פני השטח של הנקבוביות של מונולית; בקשה להעשרת phosphopeptides.

Protocol

הערה: לפני תחילת, סמן את כל הגיליונות הרלוונטיים חומר נתונים (MSDSs). כמה מהכימיקלים המשמשים בתהליכים סינטטיים ויישום הם רעילים. אנא עקוב אחר כל נהלי הבטיחות המתאימים ולהשתמש בציוד מגן מתאים (חלוקה, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות הבוהן, משקפיים בטיחות, כפפות). אנא להשתמש בכל ציוד מגן האישי קריוגני בעת טיפול בחנקן נוזלי למדידות ספיחת חנקן (כפפות מבודדים, מגן פנים).

1. נקבובי פולימר מונולית הכנה בפורמט טור גורף ונימים

1. פולימר מונולית גורפת לאפיון
   1. לטהר סטירן, divinylbenzene וחומצת methacrylic דרך טור של אלומינה הבסיסית, על מנת להסיר את מעכבי פילמור. מקום 10 גרם של אלומינה הבסיסית במזרק 25 מיליליטר פלסטיק חד פעמי עם תקע של סיבי צמר זכוכית ארוזים בקצה המזרק. לחלחל כ 10 מיליליטר של מונומר דרך העמודה.
   2. טען את מונומרים (50 מ"ג סטירן, divinylbenzene מ"ג 100 ו -50 מ"ג חומצת methacrylic) וסוכנים הנקבוביות להרכיב (300 מ"ג ו -300 טולואן isooctane מ"ג) בבקבוקון זכוכית 1 מיליליטר. הוסף את יוזם פילמור, 4 מ"ג של 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN, 1% ביחס למונומרים).
   3. Homogenize ידי sonication במשך 10 דקות. הסר חמצן מומס במבעבע חנקן הנוזלי באמצעות למשך 10 דקות. חותם את כובע הבקבוקון עם סרט פרפין ולמקם אותו באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות לפלמר התערובת.
   4. להתקרר לטמפרטורת חדר ולשבור את הבקבוקון בזהירות. העבר את מונולית הפולימר לאצבעון חילוץ תאית. מניחים את אצבעון החילוץ לתא חילוץ Soxhlet ולהרכיב אותו בבקבוק עגול תחתון המכיל נפח של מתנול, שהוא לפחות שלוש פעמים בנפח של תא החילוץ. להרכיב הקבל לחלקו העליון של תא החילוץ. לבצע חילוץ Soxhlet על ידי הרתחת מתנולבמשך 16 שעות, על מנת להבטיח את הסרת מונומרים unreacted המלאה ונקבוביים להרכיב סוכנים.
   5. הלילה יבש בתנור ואקום ב 60 ° C. לאשר את קיומן של קבוצות פונקציונליות קרבוקסיליות לצרף PCP ידי Fourier Transform אינפרא אדום ספקטרוסקופיה (FT-IR). למדוד את שטח פנים על ידי porosimetry ספיחת חנקן.
2. Functionalization של סיליקה נימים להכנת עמודות מונוליטי
   1. חותך 2 מ 'של נימי סיליקה התמזגה 100 מיקרומטר id מצופה polyimide. לחבר אותו למזרק זכוכית 0.25-.50 מ"ל ולשטוף את הנימים עם אצטון. הסר את אצטון על ידי שטיפה במי הנימים.
   2. על מנת להפעיל את הציפוי הפנימי של סיליקה הנימים, השתמש משאבת מזרק לזרום פתרון NaOH 0.2 M המימי ברמה של 0.25 μl / דקה למשך 30 דקות. לשטוף עם מים עד לשפכים הוא ניטראליים.
   3. להשתמש ברצועות נייר pH כדי לבדוק pH בשפכים. כדי protonate קבוצות silanol של הנימים, לשאוב aqueo 0.2 Mפתרון HCl דרך הנימים ברמה של 0.25 μl / דקה למשך 30 דקות. לשטוף עם מים עד לשפכים הוא ניטראליים. לשטוף עם אתנול.
   4. לשאוב 20% (w / w) פתרון אתנול של 3 (trimethoxysilyl) methacrylate propyl (pH 5 מותאמים עם חומצה אצטית) בשעה 0.25 μl / דקה לשעה 1. בשלב זה, נימי סיליקה היא פונקציונליות עם קבוצות ויניל כדי לצרף מונולית הפולימר למשטח הפנימי הנימים.
   5. לשטוף עם אצטון, יבש בזרם חנקן ומשאירים בטמפרטורת חדר למשך הלילה לפני השימוש. חותך את הנימים לחתיכות קצרות של 20 סנטימטרים אורך.
3. הכנת עמודות מונוליטי נימים
   1. הכן תערובת פילמור זהה למונולית פולימר התפזורת (סעיף 1.1) בבקבוקון זכוכית 1 מיליליטר עם מחיצת גומי. להוסיף יוזם 1% AIBN ביחס למונומרים. Homogenize ידי sonication במשך 10 דקות.
   2. לטהר את תערובת פילמור עם חנקן על ידי צימוד נימי סיליקה שאינן פונקציונליותלזרם חנקן.
      1. הכנס את נימי זרם חנקן דרך מחיצת הגומי של הבקבוקון ולטבול אותו לתוך תערובת פילמור כך שחנקן בועות באמצעות הנוזל. השאר את כובע הבקבוקון הרופף מעט, כדי למנוע לחץ יתר. לטהר במשך 10 דקות.
      2. הרם את נימי זרם חנקן מתערובת פילמור לאמיץ של הבקבוקון, ולסגור היטב את המכסה. הכנס נימים פונקציונליות באמצעות המחיצה לתוך תערובת פילמור. עודף הלחץ שנוצר לתוך הנימים באמצעות החנקן מוזרק לתוך אמיץ משאבות תערובת פילמור דרך הנימים פונקציונליות.
      3. לאסוף כמה טיפות של תערובת פילמור מהשפכים של הנימים על מנת להבטיח כי הוא מלא לחלוטין ולסגור אותו עם מחיצת גומי. קח את הנימים מתוך הבקבוקון מאוד בזהירות ולסגור את הכניסה של הנימים עם מחיצת גומי.
   3. פלמר התמהילture הכלול בנימים באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. מגניב בטמפרטורת חדר ולחתוך כמה מילימטרים של שני הקצוות של הנימים. הסר מונומרים unreacted וסוכנים נקבוביות ויוצר על ידי שטיפת העמודה עם אצטוניטריל באמצעות משאבת HPLC 3 μl / דקה למשך 30 דקות. בדוק backpressure של טור הנימים.

2. צמיחה של הברזל-benzenetrycarboxylate PCP (FeBTC)

1. צמיחה של MOPH FeBTC על פולימרי מונולית גורפת לאפיון
   1. טוחנים את מונולית מיובשת בעבר באמצעות מכתש ועלי.
   2. לטבול באבקת מונולית 100 מ"ג ב 5 מיליליטר של 2 מ"מ FeCl ₃ · 6H ₂ O באתנול במשך 15 דקות. מסנן אבק באמצעות מסנן ניילון (0.22 מיקרומטר) ולשטוף את האבקה עם אתנול. לטבול את אבקת מונולית ב 5 מיליליטר של חומצת 2 מ"מ 1,3,5-benzenetricarboxylic (BTC) באתנול במשך 15 דקות. מסנן אבק באמצעות מסנן ניילון (0.22 מיקרומטר) ולשטוף את האבקה עם אתנול.
   3. מספר חזור על שלב 2 כרצוי. הצמיחה של ציפוי המתכת אורגנית הסופי תוגדר במספר המחזורים מיושמים. בדרך כלל, בין 10 ל 30 מחזורים מבוצעים. לאשר את קיומו של הנקבוביות חדשות על ידי porosimetry ספיחת חנקן. למדוד את כמות אתרי מתכת נוספות על ידי ניתוח טרמוגרווימטריים (TGA).
2. צמיחה של MOPH FeBTC על עמודת מונוליטי נימים להעשרת phosphopeptides
   1. באמצעות משאבת מזרק. לשטוף את מונולית הנימים עם 2 מ"מ FeCl ₃ · 6H ₂ O באתנול במשך 15 דקות ב -2 μl / דקה. לשטוף עם אתנול במשך 15 דקות ב -2 μl / דקה. לשטוף את מונולית הנימים עם מ"מ BTC 2 באתנול במשך 15 דקות ב -2 μl / דקה. לשטוף עם אתנול במשך 15 דקות ב -2 μl / דקה.
   2. חזור על שלב 1 כרצוי. הצמיחה של ציפוי המתכת אורגנית הסופי תוגדר במספר המחזורים שבוצעו.

3. חלבון עיכול ו- Enrichment של Phosphopeptides

1. עיכול חלבון
   1. ממיסים 0.5 מיליליטר של חלב דל שומן ב 1 מיליליטר של מים ולחלק אותו לשברי 200 μl.
   2. לעיכול החלבון להוסיף 160 μl M 1 אמוניום ביקרבונט ו -50 μl 45 dithiothreitol מ"מ לכל חלק, על מנת לדבוק אג"ח דיסולפיד. לדגור על 50 מעלות צלזיוס בthermomixer במשך 15 דקות.
   3. הוסף 50 בהדרגה μl של תמיסה מימית של iodoacetamide 100 מ"מ, ואילו הפתרון התקרר לטמפרטורת חדר. Iodoacetamide ימנע ההיווצרות של אג"ח דיסולפיד החדש.
   4. דגירה בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 1 מיליליטר deionized מים. הוסף 2 מיקרוגרם טריפסין ולעכל חלבונים בthermomixer על 37 מעלות צלזיוס במשך 14 שעות.
   5. לסיים עיכול על ידי החמצה עם 10 μl של 1% חומצת trifluoroacetic, ולמקם אותו בthermomixer במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. אחסן את החלבונים מתעכלים ב -20 מעלות צלזיוס.
2. העשרת phosphopeptides באמצעות טור MOPH נימים.
   1. לשטוף את העמודה עם של 4 100 μl: תערובת 1 של אצטוניטריל המכיל 0.1% חומצת trifluoroacetic במשך 10 דקות בקצב זרימה של μl 1 / דקה. לשאוב את עיכול החלבונים באמצעות הטור ב 2 μl / דקה למשך 30 דקות.
   2. לשטוף את פפטידים אינם phosphorylated שוב עם 4: 1 תערובת של אצטוניטריל המכיל 0.1% חומצת trifluoroacetic במשך 10 דקות בקצב זרימה של μl 1 / דקה. לשטוף עם מים במשך 10 דקות בקצב זרימה של μl 1 / דקה.
   3. phosphopeptides Elute באמצעות פתרון חיץ 250 מ"מ pH 7 פוספט נשאב בμl 1 / דקה במשך 15 דקות. לאסוף את eluent בבקבוקון וdesalt הפתרון באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ^19. הכן חומצה / מיליליטר 2,5-dihydroxybenzoic 2 מ"ג להשתמש בו כמטריצה ​​לספקטרומטריית desorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס הזמן של בריחה ההמונית (MALDI-TOF-MS). נמשך 2 μl של חומצת 2,5-dihydroxybenzoic לקצה לelute phosphopeptides ולזהות אותם ישירות לצלחת MALDI.
   4. נתח את הנקודות על ידי MALDI-TOF-MS ולהתחדש הטור על ידי שטיפה יסודית עם מים ולאחר מכן מתנול.

תוצאות

איור סכמטי של צמיחת PCP על פני השטח הנקבובית של מונולית הפולימר האורגנית מוצג באיור 1. בנתון זה, אנו ממחישים ראשוניים פה (III) אטומים שמרו על פני השטח הנקבובית של מונולית הפולימר המקורית המתואמות לקבוצות פונקציונליות קרבוקסיליות . באמצעות הפרוטוקול מתואר יגנד א...

Discussion

מונולית הפולימר המקורית מכילה קבוצות פונקציונליות קרבוקסיליות מסוגלת להיקשר למתכות. תיאום אתרי מתכת הראשוניים בחומר המקורי, אנו יכולים לגדול ציפוי PCP (איור 1 א), בשילוב מספר אתרי מתכת נוספים בעיצוב רשת microporous. זה הופך את חומרי MOPH הציגו אטרקטיביים לנוהלי מיצו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyimide-coated capillaries	Polymicro Technologies	TSP100375	100 μm i.d.
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%	Sigma-Aldrich	440159
Styrene, 99%	Sigma-Aldrich	W323306	Technical grade
Divinylbenzene, 80%	Sigma-Aldrich	414565
Methacrylic acid, 98%	Mallinckrodt	MK150659
Toluene, ≥99.5%	EMD chemicals	MTX0735-6
Isooctane, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	650439
2,2'-azobisisobutyronitrile, 98%	Sigma-Aldrich	441090
Aluminium oxide (basic alumina)	Sigma-Aldrich	199443
Iron (III) chloride hexahydrate, 97%	Sigma-Aldrich	236489
1,3,5-benzenetrycarboxylic acid, 95%	Sigma-Aldrich	482749
Acetonitrile, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	360457
Ammonium bicarbonate, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Trifluoroacetic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	302031
Ethanol, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	2854
Iodoacetamide, ≥99%	Sigma-Aldrich	I1149
Dithiothreitol, ≥99%	Sigma-Aldrich	43819
Monobasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71505
Dibasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71643
Phosphoric acid, ≥85%	Sigma-Aldrich	438081
2,5-dihydroxybenzoic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	85707
Trypsin	Sigma-Aldrich	T8003	Bovine pancreas
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905	Bovine milk
ZipTip pipette tips	Merck Millipore	ZTC18S096	C18 resin