Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos

Resumo

A procedure for the preparation of porous hybrid separation media composed of a macroporous polymer monolith internally coated by a high surface area microporous coordination polymer is presented.

Resumo

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous polymer monoliths. The developed approach is based on the preparation of a macroporous polymer containing carboxylic acid functional groups and the subsequent step-by-step solution-based controlled growth of a layer of a porous coordination polymer on the surface of the pores of the polymer monolith. The prepared metal-organic polymer hybrid has a high specific micropore surface area. The amount of iron(III) sites is enhanced through metal-organic coordination on the surface of the pores of the functional polymer support. The increase of metal sites is related to the number of iterations of the coating process.

The developed preparation scheme is easily adapted to a capillary column format. The functional porous polymer is prepared as a self-contained single-block porous monolith within the capillary, yielding a flow-through separation device with excellent flow permeability and modest back-pressure. The metal-organic polymer hybrid column showed excellent performance for the enrichment of phosphopeptides from digested proteins and their subsequent detection using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. The presented experimental protocol is highly versatile, and can be easily implemented to different organic polymer supports and coatings with a plethora of porous coordination polymers and metal-organic frameworks for multiple purification and/or separation applications.

Introdução

Polímeros de coordenação poroso (PCPS) são compostos de coordenação com base em centros metálicos ligados por ligantes orgânicos com repetição de entidades de coordenação que se estende em uma, duas ou três dimensões, que pode ser amorfa ou cristalina ^1-3. Nos últimos anos, esta classe de materiais porosos tem atraído a atenção geral devido à sua elevada porosidade, de largura tunability química, e a sua estabilidade. PCP têm sido explorados para uma gama de aplicações incluindo a armazenagem de gás, a separação de gás, e catálise ^3-6 e, muito recentemente, as primeiras aplicações analíticas de PCP têm sido descritos ^7.

Por causa de sua funcionalidade química e alta porosidade PCP avançados têm sido alvo de seu enorme potencial para a melhoria dos processos de purificação e separações cromatográficas, e uma série de relatórios sobre este assunto têm sido publicados ^7-13. No entanto, o desempenho de PCP não está neste momento a um equivalenível nt com materiais cromatográficos existentes provavelmente devido à rápida difusão através de grandes espaços vazios interpartículas em camadas preenchidas com estes sólidos devido às suas morfologias tipicamente de forma irregular de suas partículas ou cristais. Esta embalagem irregularmente distribuída leva a um desempenho inferior ao esperado, assim como contrapressões alta coluna e indesejáveis ​​morfologias formato de pico ^14,15.

A fim de resolver o problema da rápida difusão através dos espaços vazios entre partículas e concomitantemente aumentar o desempenho de PCP para aplicações analíticas, o desenvolvimento de um material híbrido baseado em um monólito de polímero macroporoso ¹⁶ que contém o PCP na superfície dos macroporos seria ser desejável. Monólitos de polímero são auto-suficientes, materiais de peça única que possam sustentar fluxo convectivo através de seus poros, o que os torna uma das alternativas mais eficientes para talão de embalagens e têm sido comercializados com sucesso por vários c ompanies ^17,18. Monólitos polímero poroso são geralmente baseados na polimerização de um monómero e um agente de reticulação na presença de porogénios, que são tipicamente misturas binárias de solventes orgânicos. Os materiais monolíticos obtidos têm uma estrutura microglobular e uma porosidade elevada e permeabilidade ao fluxo.

Uma abordagem simples para unificar destes materiais para preparar um monólito de polímero contendo um PCP baseia-se na adição directa de PCP tal como sintetizada na mistura de polimerização do monólito. Esta abordagem resultou em PCPs principalmente enterrado dentro de um andaime do polímero, e não estar ativo para a continuação da aplicação do material final ^14,15. Uma abordagem sintética diferente é claramente necessário, a fim de, por exemplo, desenvolver filmes uniformes de PCP, ou estruturas de metal-orgânicos cristalinos (MOF) onde a maioria dos poros contidos no interior do cristal são acessíveis a partir dos macroporos do monólito de polímero.

t "> Aqui relatamos um protocolo simples para a preparação de um material híbrido de polímero orgânico-metálico (MOPH) com base num suporte de polímero macroporosas com grupos funcionais adequados para a ligação do PCP, que podem ser facilmente implementados como um auto-contido única monólito de polímero -Peça num formato de coluna com propriedades óptimas para aplicações de escoamento. O procedimento de síntese do polímero é seguida por uma solução com base em temperatura ambiente simples   método para crescer um revestimento PCP sobre a superfície interna dos poros do monólito ^19-20. Como primeiro exemplo, descreve-se a preparação de uma película de polímero de coordenação de ferro (III) benzenotricarboxilato (FeBTC) dentro de um poli macroporosa (estireno-ácido metacrílico-divinilbenzeno) monólito. Este método é eficaz para a preparação de pós a granel, bem como a coluna capilar e o protocolo descrito é facilmente exequível a outros PCP. Como um exemplo do potencial de MOPHs como materiais funcionais para o fluxo atra-aplicações gh, aplicou-se o desenvolvido FeBTC MOPH que contém um revestimento denso de Fe (III) para enriquecer fosf centros de misturas de proteínas digeridas que exploram a afinidade de ligação de fosfopéptidos a Fe (III). O protocolo desenvolvido ²¹ compreende três partes principais: Preparação do suporte macroporous monólito de polímero orgânico; crescimento do revestimento PCP sobre a superfície dos poros do monolito; aplicação para o enriquecimento de fosfopeptídeos.

Protocolo

NOTA: Antes de começar, verifique todas as fichas de dados de materiais relevantes (MSDSs). Muitos dos produtos químicos usados ​​nos procedimentos de síntese e de aplicação são tóxicos. Por favor, siga todas as práticas de segurança apropriadas e utilizar equipamentos adequados de proteção (jaleco, calças compridas, sapatos fechados, óculos de segurança, luvas). Por favor, use todos os equipamentos de protecção individual criogênico ao manusear nitrogênio líquido para as medições de adsorção de nitrogênio (luvas isolantes, protetor facial).

1. Porous Polymer Monolith Preparação em massa e Capilar formato de coluna

1. Massa de polímero Monolith para Caracterização
   1. Purifica-se o estireno, divinilbenzeno e ácido metacrílico através de uma coluna de alumina básica, de modo a remover os inibidores de polimerização. Colocar 10 g de alumina básica em 25 ml de uma seringa de plástico descartável com um tampão de lã de vidro embalado na ponta da seringa. Fazer passar cerca de 10 ml do monómero através da coluna.
   2. Carregar os monómeros de estireno (50 mg, 100 mg de divinilbenzeno e 50 mg de ácido metacrílico) e os agentes de formação de poros (300 mg de tolueno e 300 mg de isooctano) em um frasco de vidro de 1 ml. Adicionar o iniciador da polimerização, 4 mg de 2,2'-azobisisobutironitrilo (AIBN, 1% em relação aos monómeros).
   3. Homogeneizar a mistura por ultra-sons durante 10 min. Remover o oxigénio dissolvido por borbulhamento de azoto através do líquido durante 10 min. Fecha-se o frasco com tampa de película de parafina e colocá-lo num banho de água a 60 ° C durante 6 horas para polimerizar a mistura.
   4. Arrefecer à temperatura ambiente e quebrar o frasco cuidadosamente. Transferir o monólito de polímero em um cartucho de extracção de celulose. Colocar o dedal de extracção para uma câmara de extracção de Soxhlet e montá-lo para um balão de fundo redondo que contém um volume de metanol, que é pelo menos três vezes o volume da câmara de extracção. Montar um condensador para a parte superior da câmara de extracção. Realizar a extração Soxhlet fervendo o metanoldurante 16 h, assegurando a completa remoção dos monómeros que não reagiram e agentes de formação de poro.
   5. Secar durante a noite numa estufa de vácuo a 60 ° C. Confirmar a presença de grupos funcionais carboxílicos para anexar o PCP por Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Medir a área de superfície por adsorção de porosimetria de azoto.
2. Funcionalização da sílica Capilares para a preparação de colunas monolíticas
   1. Corte de 2 m de uma ID de 100 uM capilar de sílica fundida revestido com poliimida. Ligue-o a uma seringa de vidro de 0,25-0,50 ml e lava-se o capilar com acetona. Remover a acetona por lavagem da coluna capilar com água.
   2. A fim de activar o revestimento de sílica interno do capilar, utilizar uma bomba de seringa a fluir uma solução aquosa de NaOH 0,2 M em 0,25 mL / min durante 30 min. Lavar com água até o efluente estar neutro.
   3. Use tiras de papel de pH para verificar efluente pH. Em ordem para protonar os grupos silanol do capilar, uma bomba aqueo 0,2 Msolução de HCl-nos através do capilar em 0,25 mL / min durante 30 min. Lavar com água até o efluente estar neutro. Enxágüe com etanol.
   4. Bombear a 20% (w / w) de uma solução de etanol 3- (trimetoxisilil) metacrilato de propilo (pH 5 ajustado com ácido acético) a 0,25 mL / min durante 1 hora. Neste passo, o capilar de sílica funcionalizado com grupos de vinil, a fim de fixar o monólito de polímero para a superfície interior dos capilares.
   5. Lavar com acetona e seco numa corrente de azoto e deixar à temperatura ambiente durante a noite antes da utilização. Corte o capilar em pedaços mais curtos de comprimento 20 cm.
3. Preparação das colunas capilares Monolithic
   1. Prepara-se uma mistura de polimerização idêntico para o monólito de polímero a granel (secção 1.1), num frasco de vidro de 1 ml com um septo de borracha. Adicionar iniciador AIBN 1% em relação aos monómeros. Homogeneizar a mistura por ultra-sons durante 10 min.
   2. Purgar a mistura com azoto polimerização por acoplamento de um capilar de sílica não-funcionalizadoa um fluxo de azoto.
      1. Inserir o capilar corrente de azoto, através do septo de borracha do frasco e mergulhá-lo na mistura de polimerização, de modo que o azoto bolhas através do líquido. Deixe a tampa do frasco levemente solto para evitar excesso de pressão. Purgar para 10 min.
      2. Levantar o capilar corrente de azoto a partir da mistura de polimerização para o espaço superior do frasco, e fechar firmemente a tampa. Inserir um capilar funcionalizada através do septo para dentro da mistura de polimerização. O excesso de pressão gerada no capilar através do azoto injectado na câmara de expansão bombeia a mistura de polimerização através do capilar funcionalizado.
      3. Recolha algumas gotas de mistura de polimerização a partir do efluente do capilar para assegurar que ele está completamente cheio e fechá-lo com um septo de borracha. Aqui o capilar para fora do frasco com muito cuidado e fechar a entrada do tubo capilar com um septo de borracha.
   3. Polimerizar o mixtura contido no capilar em um banho de água a 60 ° C durante 6 h. Arrefecer à temperatura ambiente e corte de alguns milímetros de ambas as extremidades do capilar. Remover os monómeros não reagidos e agentes de formação de poros através de lavagem da coluna com acetonitrilo utilizando uma bomba de HPLC em 3 mL / min durante 30 min. Verifique contrapressão da coluna capilar.

2. Crescimento da Ferro-benzenetrycarboxylate (FeBTC) PCP

1. Crescimento do FeBTC MOPH em um polímero Monolith massa para Caracterização
   1. Moer o monólito previamente seca utilizando um almofariz e pilão.
   2. Imergir 100 mg do pó monólito em 5 ml de 2 mM de FeCl ₃ .6H ₂ O em etanol durante 15 min. Filtro de vácuo utilizando um filtro de nylon (0,22 um) e lava-se o pó com etanol. Mergulha-se o pó monólito em 5 ml de mM de ácido benzeno- 1,3,5-2 (BTC) em etanol durante 15 min. Filtro de vácuo utilizando um filtro de nylon (0,22 um) e lava-se o pó com etanol.
   3. Repita o passo número 2 como desejar. O crescimento do revestimento orgânico-metálico final será definido pelo número de ciclos aplicados. Normalmente, entre 10 e 30 ciclos são realizados. Confirmar a presença de novos poros por porosimetria de adsorção de azoto. Medir a quantidade de locais adicionais de metal por análise termogravimétrica (TGA).
2. Crescimento do FeBTC MOPH numa coluna capilar monolítico para o enriquecimento de fosfopéptidos
   1. Utilizando uma bomba de seringa. Lavar o monólito capilar com 2 mM de FeCl ₃ .6H ₂ O em etanol durante 15 minutos a 2 uL / min. Lava-se com etanol durante 15 minutos a 2 uL / ​​min. Lavar o monólito capilar com uma BTC 2 mM em etanol durante 15 minutos a 2 uL / ​​min. Lava-se com etanol durante 15 minutos a 2 uL / ​​min.
   2. Repita o passo 1 se o desejar. O crescimento do revestimento orgânico-metálico final será definido pelo número de ciclos realizados.

3. Proteína A digestão e Enrichment de Fosfopeptídeos

1. A digestão de proteínas
   1. Dissolve-se 0,5 ml de leite não gordo em 1 ml de água e dividi-lo em fracções de 200 uL.
   2. Para a digestão de proteínas adicionar 160 ul de 1 M de bicarbonato de amónio e 50 ul de 45 mM de ditiotreitol a cada fracção, a fim de clivar as ligações dissulfureto. Incubar a 50 ° C num Thermomixer durante 15 min.
   3. Adicionar gradualmente 50 mL de uma solução aquosa de iodoacetamida 100 mM, enquanto que a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente. Iodoacetamida irá evitar a formação de novas ligações dissulfureto.
   4. Incubar no escuro durante 15 min à temperatura ambiente. Adicionar 1 ml de água desionizada. Adicionar 2 mg de tripsina e digerir proteínas num termomisturador a 37 ° C durante 14 h.
   5. Terminar a digestão por acidificação com 10 ul de ácido trifluoroacético a 1% e colocando-o no termomisturador durante 5 min à temperatura ambiente. Armazenar as proteínas digeridas a -20 ° C.
2. Enriquecimento de fosfopéptidos usando uma coluna capilar MOPH.
   1. Lavar a coluna com 100 mL de uma mistura 4: 1 de acetonitrilo contendo um ácido trif luoroacético a 0,1% durante 10 min a um caudal de 1 mL / min. Bombear a digestão da proteína através da coluna a 2 mL / min durante 30 min.
   2. Lavar os peptídeos não fosforilados novamente com uma mistura 4: 1 de acetonitrilo contendo um ácido trif luoroacético a 0,1% durante 10 min a um caudal de 1 mL / min. Lava-se com água durante 10 min a um caudal de 1 mL / min.
   3. Fosfopéptidos eluir usando uma solução tampão de pH 7 fosfato 250 mM bombeada a 1 mL / min durante 15 min. Recolhe-se o eluente num frasco e dessalinizar a solução utilizando um protocolo padrão ^{de 19.} Preparar um ácido / ml 2,5-di-hidroxibenzóico 2 mg a usá-lo como a matriz para a espectrometria de massa de laser assistida por matriz dessorção / ionização de tempo-de-voo (MALDI-TOF-MS). Tirado 2 ul de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico em ponta para eluir o phosphopeptides e identificá-los diretamente sobre a placa MALDI.
   4. Analisar as manchas por MALDI-TOF-MS e regenerar a coluna por lavagem com água e em seguida com metanol.

Resultados

Uma ilustração esquemática do crescimento PCP sobre a superfície dos poros do monólito de polímero orgânico é mostrado na Figura 1. Nesta figura, ilustra-se o inicial de Fe (III) átomos retido sobre a superfície dos poros do monólito de polímero original é coordenado com grupos funcionais carboxílicos . Utilizando o protocolo descrito aqui ligando orgânico adicional e iões Fe (III) são adicionados à superfície, formação de uma rede de coordenação porosa dentro do monólito de pol?...

Discussão

O monólito de polímero original contém grupos funcionais carboxílicos capazes de ligar-se a metais. Coordenando os locais de metal iniciais sobre o material original, somos capazes de crescer um revestimento PCP (Figura 1A), que incorpora uma série de sites de metal adicionais moldando uma rede microporosa. Isso faz com que os materiais apresentados MOPH atraentes para os procedimentos de extracção ou purificação, onde estão envolvidas as espécies metálicas, tais como a técnica de cromatogr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyimide-coated capillaries	Polymicro Technologies	TSP100375	100 μm i.d.
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%	Sigma-Aldrich	440159
Styrene, 99%	Sigma-Aldrich	W323306	Technical grade
Divinylbenzene, 80%	Sigma-Aldrich	414565
Methacrylic acid, 98%	Mallinckrodt	MK150659
Toluene, ≥99.5%	EMD chemicals	MTX0735-6
Isooctane, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	650439
2,2'-azobisisobutyronitrile, 98%	Sigma-Aldrich	441090
Aluminium oxide (basic alumina)	Sigma-Aldrich	199443
Iron (III) chloride hexahydrate, 97%	Sigma-Aldrich	236489
1,3,5-benzenetrycarboxylic acid, 95%	Sigma-Aldrich	482749
Acetonitrile, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	360457
Ammonium bicarbonate, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	9830
Trifluoroacetic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	302031
Ethanol, ≥99.8%	Sigma-Aldrich	2854
Iodoacetamide, ≥99%	Sigma-Aldrich	I1149
Dithiothreitol, ≥99%	Sigma-Aldrich	43819
Monobasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71505
Dibasic sodium phosphate dihydrate, ≥99%	Sigma-Aldrich	71643
Phosphoric acid, ≥85%	Sigma-Aldrich	438081
2,5-dihydroxybenzoic acid, ≥99%	Sigma-Aldrich	85707
Trypsin	Sigma-Aldrich	T8003	Bovine pancreas
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905	Bovine milk
ZipTip pipette tips	Merck Millipore	ZTC18S096	C18 resin