חינם מדויק פנול DNA זיהוי מין של יום 30 חזירים העוברים על ידי PCR

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

מחקר לתוך תכנות טרום לידתי של חזיר הוכיח כי מינו של העובר המתפתח או העובר יכול להשפיע על תוצאות התפתחותיות. לכן, היכולת לקבוע מין העובר יש צורך בניסויים רבים במיוחד לגבי טיפוח מוקדם. הפרוטוקול הנוכחי מדגים הכנה זולה, מהירה ולא רעילה של הדנ"א הגנומי חזיר לשימוש עם PCR. יש לאסוף בצורה הומאנית 30 עוברים יום בהתאם להנחיות שקבע מדיניות בבעלי חיים מוסדיים וועדות הרווחה עבור הפרוטוקול הנוכחי. הכנת העובר כולו בזכות טכניקת זיהוי מין באמצעים מבוסס זה PCR פשוט כרוכה שחיקה העובר הקפוא לאבקה דקה בעזרת מכתש מראש צוננת ועליי. PCR באיכות DNA משתחרר כמות קטנה של אבקה העובר על ידי החלת דגירה חמה מגיב תמוגה אלקליין. בשלב הבא, את פתרון ה- DNA מעורבב עם חיץ נטרול ושימשו במישרין לצורך פעילות PCR. שני זוגות פריימר נוצרות כדי detect ספציפי מין בקביעה באזור של כרומוזום א- (Sry) ו ZFX באזור של כרומוזום ה- X עם דיוק וספציפי גבוהים. באותו פרוטוקול יכול להיות מיושם על עוברים מוארכים אחרים (יום 10 עד יום 14) לפני יום 30. כמו כן, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם צלחות 96-נקוו כאשר הקרנת מספר גדול של עוברים, מה שהופך את זה אפשרי עבור אוטומציה גבוהה הקלדת מין תפוקה.

Introduction

החזיר המקומי הפך להיות נושא מחקר בסיסי בפיתוח, גנטיקה ותזונה הן במגזרים האדם ואת בעלי החיים. הפוטנציאל של חזירים כמודלים ביו למחקר אנושי ניתן לייחס הדמיון הפיזיולוגי שלהם. ב בעלי חיים, מניפולציה של יחס מינים יכולים לשפר את האפקטיביות של תוכניות בחירה ושיפור גנטי ^1. זיהוי מין העוברים הפרט הוא כלי בסיסי המשמש בחקירות ניסיוני רבים, כולל אך לא מוגבל גנוטיפ, אפיגנטיקה X איון של dimorphism מינית במהלך ההתפתחות העובר המוקדם ^2.

מחקרים בעכברים מראים כי דיאטה אימהית וגורמים אחרים עלולים לגרום חוסר איזון בין מיני ^3. חזירים, הגורם לחוסר איזון יחס מינים כוללים גזע אבהי ^4, רחם קיבולת ^5, ותנאי המטבולית של החזירה ^6. מאז ההבדלים שנצפו עובר המלטות יכולים להיות מושפע sedimorphism xual, החוקרים צריכים להיות מודעים מין העובר ויחסי מין בהסקת מסקנות לגבי המחקר שלהם. פיתוחם של הכלים ופרוטוקולים יעילים זיהוי מין עובר חזיר יום 30 של פיתוח יידון כאן.

שיטות שונות של הקלדת מין פותחו למחקרים גנטיים באורגניזמים מודל ובעלי חיים. בעיקר בעלי חיים, זיהוי עובר זכר ונקבה מוקדם הוא נוהג נפוץ מאוד כדי לשפר את הבחירה גנטית תוכניות רבייה. עובריים מוקדם karyotyping ב חזיר באמצעות Giemsa ⁷ או טכניקות ^8,9 הקרינה האינטנסיבית שמש במשך הקלדת מין. עם זאת, שיטות אלו זמן רב ולא מתאים להקרנה מספר גדול של עוברים במהירות ובאופן מדויק.

שיטת הקלדת מין היעילה ביותר היא ההגברה DNA באמצעות DNA פולימרז יציבה חום זוג פריימרים. זיהוי מין באמצעים DNA בשיטת PCR הוא יותר ספציפי, מהיר ורגיש, only הדורשים כמות זעירה של חומרים הסלולר. זיהוי מין באמצעים העובר PCR מבוסס הראשונה בוצעה על בני אדם ^10, ומאוחר יותר בעכברים ^11, בקר ^{12, 13} תאו וכבשים ¹⁴ בעוברים בשלב טרום ההשתלה. ב החזיר, שיטת הקלדת DNA המין המוקדמת הוקמה עבור בעוברים בשלב טרום השתלה באמצעות זוג אחד של פריימרים DNA הספציפיים Y כרומוזום ^15. עם זאת, פריימרים PCR הנפוצים ביותר לקביעת מין נבחרו מתוך ה- Y כרומוזום של גן Sry ספציפי זכר ¹⁶ ובאזור המפלה שאינו המין של גן אבץ-אצבע הממוקם הוא X ו- Y כרומוזום ^17. בהמשך לכך, פריימרים אלה יושמו כדי לקבוע את המין של יום 30 עוברים במחקר זה עם סגוליות משופרים של פריימרים לזהות רק כרומוזום ה- X של גן אבץ-אצבע.

הדנ"א הגנומי מעוברת טרום השרשה חזירית ניתן לחלץ באמצעות חשיפת הבלסטוציסט שלם למאגר עם proteinasדואר K ¹⁶ או על ידי לקיחת ביופסיה של כמה תאים מן המחשוף מוקדם בודדים עוברים ¹⁵ והשימוש בהם עבור ישירה PCR. עם זאת, שחרור של דנ"א מהדם חזירי, שיער, רקמות או conceptus גדול על פני כמה סנטימטרים בגודל לא נעשה ביעילות בשיטת K proteinase. חילוץ שיטות DNA עבור חומרים אלה הוקמו באף זמן רב פרוטוקולי פנול / כלורופורם ⁶ או ערכות יקרות בהתבסס עמודה ^18. על מנת למנוע את השימוש בכימיקלים רעילים, קיימת מגמה לפתח שיטות מיצוי DNA זול, קל פנול-חינם. סוג זה של פרוטוקול לבידוד של הדנ"א הגנומי PCR באיכות מהעכבר ¹⁹ ו דג הזברה ²⁰ רקמות כבר נקבעה באמצעות נתרן הידרוקסידי חם טריס (hotshot). מחקר זה מספק פרוטוקול להשיג DNA עם זוגות פריימר דופלקס מאצ ו מחדש שונה לסקס PCR להקליד ישירות lysates התא של יום 30 עוברים חזירי עםדיוק גבוה.

Protocol

בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים באישור מדיניות Animal הפקולטה והרווחה - בעלי חיים מאוניברסיטת אלברטה, זורע בהריון היו מורדמים על ידי הצוותים מאומנים בכ יום 30 של ההריון עוברים נאספו. יש להשתמש בכפפות בדיקה בכל עת במהלך ההליכים.

1. איסוף לדוגמא אחסון מדגם

1. להרדים לזרוע באמצעות בורג בשבי ואחריו exsanguination. יש להשתמש בכפפות בדיקה כדי לאסוף את שטחי הרבייה עוברת מכל חזירה מורדמת.
   הערה: אוסף מהיר של דגימות והעברה עוברת להתייבש קרח או חנקן נוזלי יגרום רקמות באיכות גבוהות לעבודות מולקולריות אחרות כגון microarray ו qPCR.
2. לנתח הרחם בעדינות להפריד את כל העוברים בתוך ממברנות השליה extraembryonic שלהם מדופן הרחם הבסיסית ^21. ודא שאין זיהום ברקמה האמהית.
3. מִחָדָשׁאורך כבל ומשקל של כל עוברי הקיימא לפני ההקפאה.
4. אסוף כל העובר הפרט ומיד לעטוף אותו באופן רדיד אלומיניום לפני פקיעה הקפאה עם חנקן נוזלי.
5. מעבירים את העוברים קפוא מן חנקן נוזלי ישירות במקפיא -80 ° C.

2. עוברים גריסה

1. לייבל כל דוגמיות (15 מ"ל) עם מזהה המדגם הדרוש עבור מספר דגימות להיות מנותח.
2. מלאו מיכל תרמי עם קרח יבש לחצי מלא להכניס את הצינור מדגם מראש שכותרתו בקרח יבש.
3. תלבש כפפות חורף עם עוד זוג כפפות בדיקה על גבי להעברת המרגמות מראש מצונן העליים מ -80 ° C במקפיא להתייבש מיכל קרח.
4. מניח את העובר הקפוא בתוך המרגמה על הקרח היבש.
5. יוצקים חנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את העובר ואת לטחון אותו עם העלי לאבקה דקה.
6. מעביר את האבקה העובר לצינור מדגם מראש שכותרתו עם microspatula (איור 1) ובמקום צינור במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
7. השתמש מראש צונן ובמכתש נקי עבור כל עובר ולשנות את בדיקת הכפפות לאחר שחיקה כל עובר כדי למנוע זיהום צולב בין הדגימות.

3. הכנת הדנ"א הגנומי באמצעות שינוי שיטת נתרן הידרוקסידי

1. לייבל כל צינורות microcentrifuge (1.5 מ"ל) הדרושים במספר דגימות להיות מנותח.
2. העברת צינורות המדגם המכיל אבקת עובר מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס למכל עם קרח יבש לפני שמתחיל.
3. פיפטה 180 μl של 50 מ"מ NaOH (סודיום הידרוקסיד) לתוך צינור אחד microcentrifuge מראש שכותרתו.
4. הפעל באינקובטור-חום מראש עד 95 מעלות צלזיוס.
5. השתמשו בקיסם כדי להעביר את הסכום הנכון של אבקת העובר (5-10 מ"ג) (איור 2) מהצינור מדגם לתוך צינור מראש שכותרתו microcentrifuge המכיל את 50 פתרון מ"מ NaOH.
6. משוך up באותו קיסם לאט כדי להמחיש את lysate DNA כחומר דביק, דביק, לבן שקוף דמוי (איור 3).
7. העברת צינורות microcentrifuge עם lysate DNA אל האינקובטור מחומם מראש על 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מיד להעביר את צינור לעבר קופסת קלקר מלא קרח.
8. הוסף 20 μl של 1 M טריס- HCl ישירות לתוך הצינור microcentrifuge ולערבב אותו על ידי הקשה על הצינור בעדינות. השתמש בנייר pH כדי להבטיח את ה- pH הוא כ 8.0 (איור 4) לפני צנטריפוגה.
   הערה: כאשר מתמודדים עם מספר רב של הכנות מדגמות, מקובל דגימות לאסוף כמה באקראי כדי לבדוק את רמת חומציות.
9. צנטריפוגה צינור עם lysate DNA XG ב 2000 ב microcentrifuge לשתי דקות בטמפרטורת חדר כדי להסיר שאריות רקמה שלא נמס.
10. העברת 150 μl של supernatant ברור העליון לתוך צינור חדש או 96 צלחות היטב.
    הערה: lysate DNA הברור מוכן לשימוש כתבנית ב PCR תגובה היא היציבה ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועות, או יכול להיות כל זמן זה ב -20 מעלות צלזיוס למשך שנה.

4. עיצוב מין ספציפי Primers PCR

1. השג מספרי הצטרפות עבור אזור בקביעת מין חזירי Y (Sry) (NM_214452.3) ו וחלבון אבץ אצבע צמוד X (ZFX) גנים (XM_005673501.1) מאתר צמח שדה http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. העתק והדבק מספרים ההצטרפות צמח השדה אלה לכלי עיצוב פריימר באינטרנט.
   הערה: המידע פריימרים הטובים כולל אורך, TM ו% GC וכן גודל המוצר PCR (נ"ב) יופק על מסך המחשב (איור 5).
3. אמת את הספציפיות של פריימרים אלה באמצעות תוכנית הפיצוץ נוקלאוטיד (Blastn) מול מסד הנתונים הגנומי חזירי הנוכחי 104 כדי להבטיח רצפים אלה ממוקמים רק על X ו- Y כרומוזום עבור Sry ו ZFX בהתאמה (איור 6).

5. הדנ"א הגנומי PCR ישירות מ- DNA Lysates

1. לְהִשְׁתַמֵשׁרק 1 μl של lysate DNA כתבנית לתגובה PCR 15 μl.
   הערה: שיטת הקרנת תפוקה גבוהה עבור PCR 96-גם צלחות יכול להתבצע באופן דומה באמצעות פיפטה רבה.
2. בצע את הפעולות הבאות פשוט עבור PCR הראשון: להכין צינור PCR אחת עבור כל שליטה תבנית שלילית ושני צינורות נוסף עבור בקרות חיוביות על ידי הוספת 1 μl (0.5 ng) של הדנ"א הגנומי חזירי מין ידוע שהושג באופן מסחרי. מאוחר יותר, כולל מדגם מניתוח זיהוי המין באמצע המוצלח האחרון כביקורת חיובית ולהפעיל יחד עם תגובת PCR החדשה לקביעת מין.
3. השתמש בכל שילוב HotStart מוכן אנזים PCR ולהכין תערובת אמן על ידי פריימרים הוספה במים nuclease חינם בהתאם למספר הכולל של התגובות PCR. הוסף 1 μl של lysate DNA לתוך צינור PCR קיים מראש עם 14 μl של מיקס מאסטר PCR. להוסיף פריימרים כך הריכוז הסופי של פריימרים משני גנים מין ספציפי הוא 0.3 מיקרומטר בסך הכל של 15 μl PCR reaction.
4. הגדר את תכנית ה- PCR הבא Cycler תרמית: 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 35 מחזורים כל אחד עם צעד היתוך 20 שניות 98 ° C, ואחריו צעד חישול 15 שניות על 65 מעלות צלזיוס, ואחריו צעד התארכות 15 שניות על 72 מעלות צלזיוס. בצעד סופי, דגירת תגובות דקות 1 ב 72 ° C ולהמשיך לדגור על 4 מעלות צלזיוס עד הסרת צינור PCR עבור אימות ג'ל אלקטרופורזה כדי לקבוע את המין.
   הערה: תנאי PCR ואופטימיזציה הנם בהתאם במדריך של ערכת ה- PCR המוזכרים לוח החומרים.
5. מוסיף את הכמות המתאימה של כתם ג'ל DNA SYBR הניאון ירוק רעיל בעת הכנת ג'ל agarose 2% TBE.
   הערה: ברומיד Ethidium ניתן להחליף כתם בירוק ניאון אם היא אינה זמינה.
6. הוסף 1.5 μl של צבע הטעינה (10x) לתוך הצינור PCR ומערבבים היטב על ידי pipetting למאגר תגובת PCR ו- up- למטה.
7. 10 טענו μl של מדגם לתוך באר run הג'ל agarose עם הגדרות מתח מתאים (מנגנון ג'ל קטן ב -100 V, מנגנון ג'ל 96-גם ב 150 V עד הלהקה לצבוע רץ חצי דרך ג'ל).
8. הקפד להתאים את עוצמות להקות תחת ההגדרה אור ניאון באמצעות סורק לייזר ללכוד תמונה של הג'ל. הערה: תרמי ג'ל נפוצה ניתן להחליף את הג'ל ברומיד ethidium.
9. לקבוע את המין עובר החזיר ידי זיהוי עובר עם להקה אחת כנקבה ושתי להקות כזכר (איור 7).

תוצאות

תוצאת נציג של קביעת הזוויג מ 345 הקרנת lysates DNA על ידי PCR מוצגת באיור 7 ו מסוכמת בטבלת 1.

כפי שניתן לראות בתרשים 7, טמפרטורת החישול פריימרים על 65...

Discussion

רוב הפרוטוקולים קיימים הקשורים הקלדת מין DNA העוברי חזירית מתאימים רק בשלב טרום-השתלה בשלבים מוקדמים ^15,16. פתחנו בהצלחת פרוטוקול מתאים להקרנה עובר חזירי במהלך ההריון מאוחר. בהתבסס על מחקרים עם שלבי התפתחות דומות של עוברים ממחקרים קודמים ^6,18, בפרוטוקול הנוכח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.