Точная и фенола свободной ДНК Sexing дня 30 свиней эмбрионов с помощью ПЦР

Резюме

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Аннотация

Исследование пренатального программирования в свинье показало, что пол развивающегося эмбриона или плода могут влиять на процесс развития. Таким образом, способность определять пол эмбриона является необходимым во многих экспериментах, особенно в отношении раннего развития. Настоящий Протокол демонстрирует недорогой, быстрый и нетоксичный препарат геномной ДНК свиньи для использования с PCR. День 30 эмбрионов должны быть гуманно собраны в соответствии с руководящими принципами, установленными институциональной политики животных и комитетов благосостояния для настоящего протокола. Получение всей эмбриона для этого основанного ПЦР методики Sexing просто включает измельчения замороженного эмбриона до тонкого порошка с использованием предварительно охлажденного ступку и пестик. ПЦР-качество ДНК высвобождается из небольшого количества эмбрионов порошка путем подачи горячей инкубацию в щелочным реагентом для лизиса. Далее, ДНК-раствор смешивают с нейтрализации буфера и использовали непосредственно для ПЦР. Два пары праймеров генерируются в DETECт удельная секс определении области хромосомы Y- (SRY) и ZFX области хромосомы X- с высокой точностью и специфичностью. Же протокол может быть применен к другим удлиненных эмбрионов (день 10 до 14-й день) раньше, чем День 30. Также, этот протокол может быть осуществлена ​​с 96-разгораются пластин при скрининге большого количества зародышей, что делает его возможным для автоматизации и высокой пропускная секс печатать.

Введение

Домашняя свинья стала фундаментальной предметом исследования в развитии, генетики и питания в обоих человека и животноводческих отраслей. Потенциал свиней в качестве биомедицинских моделей для человеческого исследования можно отнести к их физиологических сходств. В животноводстве, манипулирование соотношение полов может повысить эффективность отбора и генетического улучшения ^{программ 1.} Sexing отдельные эмбрионов является фундаментальным инструментом, используемым во многих экспериментальных исследований, включая, но не ограничиваясь генотипа, эпигенетике и X инактивации половой диморфизм во время раннего развития эмбриона ^2.

Исследования на мышах показывают, что материнская диета и другие факторы могут привести к половым дисбалансом ^3. У свиней, причины соотношение полов дисбаланс включают отцовской породы ^4, емкость матки ^5, и метаболический состояние свиноматки ^6. Поскольку различия, наблюдаемые у эмбрионов и пометов могут влиять SEальными диморфизм, исследователи должны быть осведомлены о эмбриона пола и соотношения полов, прежде чем делать выводы относительно их исследований. Развитие эффективных инструментов и протоколов для определения пола эмбрионов свиньи на 30 день развития будут обсуждаться здесь.

Различные методы полового печатать были разработаны для генетических исследований в модельных организмов и скота. В частности, в скота, выявлении мужского и женского ранних эмбрионов является очень распространенной практикой для повышения генетического отбора для селекционных программах. Ранние эмбрионы кариотипирование в свинью использованием Гимза ⁷ или интенсивную флуоресценцию ^8,9 методы были использованы для секса печатать. Тем не менее, эти методы являются трудоемким и не подходит для скрининга большого числа зародышей быстро и точно.

Наиболее эффективный метод пола набрав амплификации ДНК с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и пары праймеров. определение пола ДНК методом ПЦР является более конкретным, быстрый и чувствительный, оолько требующих незначительное количество клеточных материалов. Первой ПЦР на основе эмбриона определение пола была выполнена на людях ^10, а позже у мышей ^11, крупного рогатого скота ^12, буйволы ¹³ и овец ¹⁴ предимплантационной эмбрионов. В свиньи, самый ранний ДНК секс метод набрав был создан для преимплантационных эмбрионов с помощью одной пары Y-хромосомы праймеров, специфичных ДНК ^15. Тем не менее, наиболее распространенные ПЦР-праймеры для определения пола были отобраны из Y-хромосомы у мужчин специфического гена SRY ¹⁶ и без секса дискриминационного области гена цинка пальца, расположенного по адресу Х и Y ^{хромосомы 17.} Впоследствии эти праймеры были применены к определить пол День 30 эмбрионов в этом исследовании с улучшенной специфичностью праймеров для обнаружения только X- хромосому гена цинк-пальцем.

Геномную ДНК из свиных эмбрионов предимплантационной могут быть извлечены путем воздействия интактной бластоцисты в буфер с proteinas^ К ¹⁶ либо путем биопсии нескольких клеток от индивидуального начале расщепления эмбрионов ^{15 и} использовать их для прямого ПЦР. Тем не менее, выпуск ДНК из свиной крови, волос, тканей или большой зародыш в течение нескольких сантиметров в размере не эффективно осуществляется с помощью протеиназы метод K. Методы экстракции ДНК для этих материалов были созданы с использованием либо трудоемких фенол / хлороформ протоколы ^{6 или} основанные дорого колонка комплекты ^18. Во избежание использования потенциально токсичных химических веществ, наблюдается тенденция развивать недорогой, простой и фенолов в методы выделения ДНК. Этот тип протокола для выделения ПЦР-качества геномной ДНК из мышей ¹⁹ и данио ²⁰ тканей была создана с использованием горячего гидроксида натрия и трис (HotShot). Это исследование обеспечивает протокол для получения ДНК с модифицированными HotShot и переработан пары праймеров дуплекс для ПЦР пола набрав непосредственно из клеточных лизатов Дня 30 свиных эмбрионов свысокая точность.

протокол

В соответствии с Канадским советом по принципов ухода за животными и с одобрения политики факультета животноводства и Комитета благосостояния - поголовье Университета Альберты, беременных свиноматок были умерщвлены по подготовленных штабами приблизительно 30 день беременности и эмбрионов были собраны. Используйте чистые перчатки во все времена во время процедур.

1. Отбор проб и образцов для хранения

1. Эвтаназии свиноматку с использованием плен болт с последующим кровопусканием. Носите чистые перчатки, чтобы собрать половых путей и эмбрионов от каждого эвтаназии свиноматки.
   Примечание: быстрый сбор образцов и эмбрионов трансфертных сухой лед или жидкий азот приведет к увеличению тканей качества для других молекулярных работ, таких как микрочипов и КПЦР.
2. Рассеките матку и осторожно отделить все эмбрионы в своих внеэмбриональные плацентарных мембран от основной стенки матки ^21. Убедитесь, что нет является загрязнение материнской ткани нет.
3. редлина шнура и вес всех жизнеспособных эмбрионов перед замораживанием.
4. Собрать каждую отдельную эмбрион и сразу завернуть в алюминиевую фольгу, прежде чем оснастки замораживание жидким азотом.
5. Передача замороженных эмбрионов из жидкого азота непосредственно к -80 ° C морозильнике.

2. Шлифовальные Эмбрионы

1. Этикетка все пробирки с образцами (15 мл) с образцом ID необходимой для числа анализируемых образцов.
2. Заполните тепловой контейнер с сухим льдом, чтобы наполовину и вставьте предварительно помечены пробирку в сухом льду.
3. Носите зимние перчатки с другой парой смотровых перчаток на вершине для передачи предварительно охлажденные растворы и пестики от -80 ° C морозильник, чтобы сухой лед контейнер.
4. Поместите замороженные эмбрионы внутри раствора на сухом льду.
5. Налейте достаточное жидкий азот, чтобы покрыть эмбрион и растереть его с пестиком в тонкий порошок.
6. Перенести порошок эмбриона на заранее помечены пробирку с MICRospatula (Рисунок 1) и поместите пробирку в C морозильнике -80 °.
7. Используйте чистую предварительно охлажденной ступку и пестик для каждого эмбриона и изменить смотровые перчатки после измельчения каждого эмбриона, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.

3. геномную ДНК Получение использованием модифицированного гидроксида натрия Метод

1. Этикетка все микроцентрифужных трубки (1,5 мл), необходимые для числа анализируемых образцов.
2. Передача пробирок для проб эмбриона порошок от -80 ° C морозильнике в контейнер с сухим льдом до начала.
3. Пипетировать 180 мкл 50 мМ NaOH (гидроксид натрия) в каждую предварительно меченных микроцентрифужных трубки.
4. Включите инкубатор и предварительный нагрев до 95 ° C.
5. Используйте зубочистку, чтобы передать необходимое количество эмбрионов порошка (около 5-10 мг) (рисунок 2) из пробирки в предварительно помечены микроцентрифужных пробирку, содержащую раствор 50 мМ NaOH.
6. Потяните Uр то же зубочисткой медленно визуализировать лизат ДНК в виде плотной клейкой, белый прозрачный подобные вещества (рисунок 3).
7. Перенесите микроцентрифужных пробирок с лизата ДНК в предварительно нагретой инкубаторе при 95 ° С в течение пяти минут. Сразу передачи трубки для пенополистирола ящик, наполненный льдом.
8. Добавить 20 мкл 1 М Трис-HCl непосредственно в пробирку микроцентрифужных и смешать его аккуратным постукиванием трубки. Используйте индикаторную бумагу, чтобы обеспечить рН приблизительно 8,0 (фиг.4) перед центрифугированием.
   Примечание: При работе с большим количеством опытных препаратов, это приемлемо для случайным образом выбирать несколько образцов для проверки рН.
9. Центрифуга трубки с лизата ДНК при 2,000 мкг в микроцентрифуге в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы удалить мусор нерастворенного тканей.
10. Передача 150 мкл верхнего прозрачного супернатанта в новую пробирку или 96-луночные планшеты.
    Примечание: Прозрачный лизат ДНК готова к использованию в качестве матрицы в ПКРеакцию R и она стабильна при температуре 4 ° С в течение двух недель, или оно может храниться при температуре -20 ° С в течение года.

4. Конструкция Пол-специфической ПЦР праймеры

1. Получить инвентарными номерами для свиней секс определения область Y (SRY) (NM_214452.3) и и белковые цинковый палец с Х-хромосомой (ZFX) гены (XM_005673501.1) с сайта NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /.
2. Скопируйте и вставьте эти цифры вступлении NCBI к онлайн инструмент проектирования грунтовка.
   Примечание: Лучший праймеры информация, включая длину, Tm и GC%, а также размер продукта ПЦР (ВР) будет генерироваться на экране компьютера (рис 5).
3. Подтвердить специфику этих праймеров с использованием программы нуклеотид Blast (BLASTN) против нынешнего свиного геномной базе 104, чтобы обеспечить эти последовательности находятся только на X и Y хромосомы для SRY и ZFX соответственно (рисунок 6).

5. геномную ДНК ПЦР Непосредственно из ДНК лизатов

1. использованиетолько 1 мкл лизата ДНК в качестве матрицы для 15 мкл ПЦР-реакции.
   Примечание: высокая пропускная способ скрининга на 96-луночных планшетах ПЦР может быть выполнена аналогичным образом с использованием многоканальной пипетки.
2. Выполните следующие действия только для первой ПЦР: подготовить один ПЦР трубки для не шаблона отрицательного контроля и две дополнительные трубы для положительного контроля путем добавления 1 мкл (0,5 нг) коммерчески полученного известно секс свиного геномной ДНК. Позже, включают пробу из последнего успешного анализа Sexing в качестве положительного контроля и запустить вместе с новым ПЦР для определения пола.
3. Использование любого HotStart готовой смеси ПЦР фермент и подготовить мастер смеси путем добавления праймеров и нуклеазному свободную воду в зависимости от общего количества реакций ПЦР. Добавить 1 мкл лизата ДНК в предварительно существующего ПЦР-пробирку с 14 мкл мастер смеси ПЦР. Добавить праймеров таким образом, что конечная концентрация праймеров из двух генов половых конкретных составляет 0,3 мкм общей сложности 15 мкл ПЦР гeaction.
4. Настройка следующую программу ПЦР в амплификатор: 95 ° С в течение 3 мин, 35 циклов друг с шагом 20 сек плавления 98 ° C, с последующей стадией отжига 15 сек при 65 ° С, с последующей стадией элонгации 15 сек при 72 ° С. На заключительном этапе, инкубировать реакции в течение 1 мин при 72 ° С и продолжают инкубировать при температуре 4 ° С до удаления трубки ПЦР для верификации гель-электрофореза для определения пола.
   Примечание: условия и оптимизация ПЦР соответствии с инструкцией к набору ПЦР упомянутого в таблице материалов.
5. Добавить соответствующее количество нетоксичного зелено-флуоресцентной SYBR гель ДНК пятна при подготовке 2% TBE агарозном геле.
   Примечание: бромистый этидий может быть заменен на зеленый-флуоресцентным красителем, если он не доступен.
6. Добавить 1,5 мкл загрузочного красителя (10x) в ПЦР-пробирку и хорошо перемешать с помощью пипетки реакционного буфера ПЦР вверх-вниз.
7. Нагрузка 10 мкл образца в лунку и тип агарозный гель с соответствующими настройками напряжения (малый гель Устройство при 100 V, 96-а аппарат гель при 150 V до полосы красителя работает на полпути через гель).
8. Наблюдайте и регулировать интенсивность групп не под обстановке флуоресцентного света с помощью лазерного сканера и захватить изображение геля. Примечание: Общие тепловизора гель может быть заменен на геле бромистым этидием.
9. Определить пол свиных эмбрионов путем выявления эмбрионов с одной полосы, как самки и двух групп, как мужчины (рис 7).

Результаты

Представитель результат определения пола из 345 ДНК скрининга лизатов ПЦР показано на рисунке 7 и в таблице 1.

Как можно видеть на фигуре 7, температура отжига праймеров при 65 ° С является оптимальной условием ?...

Обсуждение

Большинство существующих протоколов, связанных с свиного эмбрионы ДНК секс набрав пригодны только для ранней стадии предимплантационной стадии ^15,16. Мы успешно разработали протокол, подходящий для свиней скрининга эмбрионов в конце беременности. Основываясь на исследованиях с ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.