בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Summary

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Abstract

ניתן בדוגמת הידרוג במייקרו בקנה המידה תוך שימוש בטכנולוגיות מייקרו-נוזליות או micropatterning לספק in vivo דמוי גיאומטריה רקמה תלת-ממדי (3D). בונה מבוססת הידרוג'ל 3D וכתוצאה מהסלולרית הוכנס כחלופה לניסויים בבעלי חיים ללימודים מתקדמים ביולוגיים, מבחני תרופתיים ויישומי השתלת איברים. למרות שיכולים להיות מפוברקים בקלות חלקיקים מבוסס הידרוג'ל וסיבים, קשה לתפעל אותם לשיקום רקמות. בסרטון הזה, אנו מתארים שיטת ייצור לגיליונות הידרוג'ל אלגינט micropatterned, יחד עם ההרכבה שלהם כדי ליצור מערכת תרבית תאי 3D מאקרו בקנה מידה עם מייקרו-סביבה סלולרית מבוקר. שימוש בטופס ערפל סוכן gelling סידן של, גיליונות הידרוג'ל דקים נוצרים בקלות עם עובי בטווח של 100 - 200 מיקרומטר, ועם micropatterns המדויק. אז יכולים להיות מתורבת תאים עם ההדרכה הגיאומטרית של גיליונות הידרוג'ל בתנאים בודד. יתר על כן, גיליונות הידרוג'ל ניתן להשפיע בקלות באמצעות micropipette עם קצה לחתוך הסוף, וניתן להרכיב למבנים רב שכבתיים על ידי לערום אותם באמצעות polydimethylsiloxane דוגמת מסגרת (PDMS). גיליונות אלה מודולרי הידרוג'ל, אשר יכול להיות מפוברק באמצעות תהליך קליל, יש יישומים פוטנציאליים של מבחני במבחנה סמים ומחקרים ביולוגיים, כוללים מחקרים פונקציונליים של מיקרו וmacrostructure ושיקום רקמות.

Introduction

הידרוג במיוחד מבטיח ביו-חומרים, וצפויים להיות חשוב בביולוגיה בסיסית, מבחני תרופתיים ורפואה. ¹ ​​Biofabrication של מבנים תאיים המבוסס על הידרוג'ל הוצע להפחית את השימוש בניסויים בבעלי חיים, ^2,3 להחליף רקמות להשתלה, ⁴ ולשפר מבחני מבוססי תאים. ^5,6 חומרים המכילים מים (הידרו) viscoelastic (ג ') לאפשר למספר גדול של תאים להיות כמוס ומתוחזק במבנה פיגום לשלוט microenvironment הסלולרי 3D. בשילוב עם ההדרכה של טכנולוגיות מייקרו-נוזליות או micropatterning, הגיאומטריה של מבני הידרוג'ל ניתן לשלוט באופן מדויק בקנה המידה הסלולרית. עד כה, מגוון צורות של הידרוג'ל, כוללים חלקיקים, ^{7 - 9} סיבים, ^{10 - 12} וגיליונות, ^13-15 שימשו כיחידות בנייה במלמטה למעלה approכואב לייצור של ארכיטקטורות רב-תאיות מאקרו בקנה מידה.

שני חלקיקים מבוססי הידרוג'ל וסיבים היו מפוברקים בקלות ובמהירות ליישומים כמו סביבות סלולריות מיקרו בקנה מידה, עם פקדי fluidic באמצעות מכשירי microfluidic. עם זאת, כיחידות הבסיסיות של רקמות מהונדסות, זה יהיה מסובך לסדר אותם מחדש ולהגדלת נפחם כמבני מאקרו בקנה מידה. ¹⁶ זה קשה יותר להשיג מבנים בקנה המידה מאקרו מאשר לייצר מודולים בסיסיים בגודל מיקרון. יחידות כמו גיליונות של מבנים מבוססי הידרוג'ל יכולות לשמש כדי להגביר את עוצמת הקול של פיגומים באמצעות תהליך הרכבה פשוט. Consequentially, שכבות שנערמו של גיליונות הידרוג'ל לספק לא רק גידול נפח אלא גם הארכה גיאומטרית בחלל 3D.

יש לנו דיווח שיטה של בודה גיליונות הידרוג'ל micropatterned, ¹³ בעבר ^{- 15} יחד עם ההרכבה שלהם לרבים-שכבארכיטקטורות סלולריות אבודות של. הטכניקה מאפשרת micropatterning מורכבת ועיצוב המודולרי של מבנים תאיים באמצעות תהליך ערימה של מבנים רב שכבתיים. דרך הייצור של גיליונות מוערמים מודולרי הידרוג'ל, הmicropatterned, יכול להתממש מערכת תרבית תאי 3D עם מייקרו-סביבה סלולרית מאקרו בקנה מידה מבוקר. פרוטוקול וידאו זה מתאר שיטה פשוטה אך רבת עוצמה ייצור שיכול לשמש לבניית גיליונות הידרוג'ל מודולרי, המבוססים על קו הכבד האנושי תא קרצינומה (HepG2). אנו מדגימים זאת מניפולציה פשוטה של ​​גיליונות הידרוג'ל אלה בדוגמת מודולרי, וההרכבה שלהם לתוך מבנה רב-שכבתי.

Protocol

1. הכנת תבניות micropatterned והידרוג

1. לייצר דפוסי מיקרו בקנה מידה הרצויים באמצעות SU-8 photoresist על פני השטח של פרוסות סיליקון באמצעות ^15,17 טכניקת photolithography סטנדרטי שני שלבים לתבניות יציקת PDMS. הדוגמא המוצגת משתמשת דפוס כבד כמו lobule-רשת (איור 1).
2. לשקול את PDMS ופתרון סוכן ריפוי עם יחס של 1: 5 (כלומר, 12.5 גרם של PDMS ו -2.5 גרם של סוכן ריפוי).
3. מערבבים את g 15 של הפתרון ביסודיות, דגה הבועות בתא ואקום, ולאחר מכן להפיץ את הפתרון המעורב על גבי משטח micropatterned של פרוסות סיליקון באופן שווה בתוך צלחת ליהוק נייר כסף.
4. מניחים את פרוסות סיליקון על צלחת מחוממת 65 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות על משטח שטוח כדי לרפא את PDMS.
5. הסר את PDMS נרפא מצלחת הליהוק ופרוסות סיליקון.
6. חותך את הקצוות של PDMS ולמקם אותו על גבי צלחת פטרי 100 מ"מ קוטר עםבצד עד micropatterned.
7. שטוף את micropatterned PDMS נרפא בצלחת פטרי באמצעות אתנול 70% ומים מזוקקים לעיקור ראשוני. לאחר מכן, לייבש אותם לחלוטין במשך 10 דקות בתנור על 65 מעלות צלזיוס.
8. ממיסים ומערבבים O / N 3 גרם של חומרים פעילי שטח nonionic אבקה במים מזוקקים 100 מיליליטר, יצירת 3% (w / v) פתרון ציפוי.
9. מניחים את תבניות PDMS micropatterned בשואב פלזמה ולנקות אותם דקות 1 (85 W, 0.73 mbar) כדי ליצור משטח הידרופילי, כדי להקל על התוספת של נוזלים מימיים. לאחר מכן, מעיל פני השטח של PDMS עם פתרון 100 מיליליטר השטח לפחות 3 שעות (Oro / N) באמצעות נדנדה מעבדה.
10. שטוף את הפתרון פעילי שטח מתבניות PDMS ולייבש אותם לחלוטין בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, לעקר כל עובש micropatterned על ידי חשיפה לקרינת אולטרה סגולה (UV) מעל 30 דקות.

2. מכין את ההשעיה התא מבשר Hydrogel

1. ללהכין מבשר הידרוג'ל, לפזר 0.1 גרם של אבקת אלגינט נתרן ב 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS), יצירת 1% (w / v) מבשר אלגינט. לפזר את האבקה לחלוטין, דגירה ולערבב אותם O / N.
2. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מחובר למזרק 1 מיליליטר.
3. תרבות תאי HepG2 בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי 1% פניצילין, סטרפטומיצין על צלחת תרבית רקמה קונבנציונלית עד 70% - מפגש 80% בחממה humidified 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס .
4. לשטוף את התאים באמצעות פעם PBS, ולאחר מכן trypsinize על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של 0.05% טריפסין- EDTA במשך 4 דקות ב5% CO ₂ באינקובטור humidified על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים שנקטפו מצלחת התרבות ב 250 XG במשך 3 דקות וגלולות באמצעות 1 מיליליטר של PBS לאחר הסרת supernatant.
5. לספור את מספר התאים מופצים אחת בPBS באמצעות תא אוטומטידֶלְפֵּק.
6. בעקבות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 3 דקות והסרת PBS, להוסיף 1 מיליליטר של 1% (w / v) של פתרון אלגינט נתרן לתא גלולה שנותרו ולערבב אותם בעדינות באמצעות pipetting. צפיפות הזריעה הסופית של התאים צריכה להיות 5 x ¹⁰ יוני - 10 יולי תאים / מיליליטר. דגירה ההשעיה התא / הידרוג'ל בחממה humidified 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס.

3. טעינה וcross-linking של תא / השעיה Hydrogel

1. ממיסים 1.47 גרם של סידן כלורי ליבש בשל DDH ₂ O 100 מיליליטר לייצר מגיב cross-linking (כלומר, 100 מ"מ CaCl ₂ · 2H ₂ O בDDH ₂ O).
2. יש לשטוף את הפנים של אדים עם מתמר קולי באמצעות אתנול 70%, ולמלא אותו עם 200 מיליליטר של מגיב cross-linking. מכשיר האדים הוא 110 מ"מ רחב, ארוך 300 מ"מ ו -170 מ"מ עמוק (כלומר, 110 מ"מ x 300 מ"מ x 170 מ"מ (ר x H x D)).
3. מניחים את PDMS micropatternedתבניות בשואב פלזמה ולנקות אותם דקות 1 ב 85 W כדי ליצור משטח הידרופילי.
4. בהתמדה לטעון 7.2 μl של ההשעיה התא / הידרוג'ל המעורב היטב בקצה micropattern בעובש. הדוגמא המוצגת משתמשת דפוס כבד כמו lobule-רשת (איור 1). הנפח של ההשעיה תלויה בדפוס הטופוגרפי.
5. כדי להשיג gelation של ההשעיה התא / הידרוג'ל, להדליק את מכשיר האדים ולוודא שמכשיר האדים מייצר ערפל של מגיב cross-linking. לרסס את מגיב cross-linking על מבשר הידרוג'ל למשך 5 דקות, מכסה את פני השטח הטופוגרפיים של תבניות PDMS בטווח של 5 סנטימטר.
   הערה: מרחקים ארוכים יותר וקצר יותר מאשר 5 סנטימטר יכול לגרום gelation שלמה ואחידה, בהתאמה. ודא שיש לו את מכשיר האדים שיעור ריסוס של 250 מיליליטר / שעה, ייצור 20 מיליליטר של ערפל של המגיב cross-linking ב5 דקות.
6. בעקבות תהליך cross-linking, לכבות את מכשיר האדים ולמלא את מו PDMSLDS עם PBS.

4. טיפול בגיליונות בודד מודולרי Hydrogel

1. לנתק את כל גיליון הידרוג'ל קשוח מתבניות micropatterned באמצעות pipetting PBS בעדינות סביב גיליון הידרוג'ל באמצעות קצה פיפטה 200 μl.
2. להרים כל גיליון הידרוג'ל צף באמצעות קצה קצה פיפטה 1,000 μl-לחתוך סוף. לכל גיליון הידרוג'ל כבד כמו lobule-רשת ממדים של 8 מ"מ x 8.7 מ"מ, ולהיות 100 - 200 מיקרומטר עבה.
3. העבר את שכבה יחידה של גיליון הידרוג'ל ל1 מיליליטר של DMEM בצלחת 12-היטב, ותרבות התאים במבחנה באופן צף באמצעות הידרוג'ל לבנות כמרכיב יחידה בצלחת 12 גם יותר משבוע ב5 % CO ₂ humidified חממה ב 37 מעלות צלזיוס. להחליף את התרבות בינונית בכל יום אחר.

5. גיליונות Hydrogel עצרת של רב שכבתיות

1. חזור על שלבים 1.1-1.5 לייצר מסגרת PDMS עם ממדים של 18 מ"מ x 18 מ"מ x 4 מ"מ (x Wx D H), ואשר מכיל מבני 170 מיקרומטר-גבוה עמוד במשטח נמוך יותר. השתמש 42 גרם של התערובת של PDMS וסוכן ריפוי, עם אותו היחס כמו בשלב 1.2. מניחים תבנית פוליקרבונט מיוחדת על פרוסות סיליקון למסגרת PDMS ליצור מסגרת פנימית עם ממדים של 8 מ"מ x 9 מ"מ x 2 מ"מ (ר x H x D).
2. לעקר את מסגרת PDMS וניירות לסנן ניילון 180 מיקרומטר-נקבוביות שקועות במים ופינצטה מזוקקים בחיטוי במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
3. הנח את המסגרת מעוקרת PDMS על רבע מפיסת נייר סינון ניילון (בקוטר של 5 סנטימטרים) בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ.
4. העבר את גיליון הידרוג'ל מודולרי לתוך הפנים של מסגרת PDMS באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl-לחתוך סוף. גיליונות הידרוג'ל המשמשים להרכבה צריכים להיות מתורבת לפחות יום אחרי שהם היו מפוברקים.
5. יישר את הקצה של כל גיליון הידרוג'ל מודולרי עם מסגרת PDMS באמצעות קצה פיפטה 200 μl ריק.
6. חזור על שלבים 5.4 ו -5.5 שימוש בגיליונות הידרוג'ל מודולרי כדי ליצור ערימה של 4 - 6 שכבות.
7. הסר את מדיום התרבות על ידי זורם אותו דרך מבני העמוד בתחתית מסגרת PDMS. לאחר מכן להוסיף 2 μl של פתרון אלגינט (2% w / v) בפינה של המבנה רב שכבתי.
8. ריסוס ערפל של מגיב cross-linking למשך 30 שניות על המבנה רב שכבתי לצרף את הקצוות של כל שכבה עם אלה של אחר. השתמש 2 מיליליטר של ערפל של מגיב cross-linking (בשיעור ריסוס של 250 מיליליטר / שעה).
9. יש לשטוף את המבנה רב שכבתי בעדינות עם 400 μl DMEM ולהסיר את מסגרת PDMS באמצעות פינצטה.
10. לנתק את המבנה רב-שכבתי מנייר הסינון בעדינות על ידי ניגוב עם תא המרים הבא התוספת של 4 מיליליטר של DMEM.
11. העבר לבנות לצלחת 6-היטב המכילה 3 מיליליטר של DMEM באמצעות נייר סינון, ותרבות התאים במבחנה באופן צף, עם הידרוג'ל לבנות כרב שכבתיפיגום רב היקף סלולארי בצלחת 6-גם יותר משבוע בחממה humidified 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס. להחליף את התרבות בינונית בכל יום אחר.

תוצאות

יש לנו תיארנו את הייצור ומניפולציה של גיליונות בודדים הידרוג'ל סלולריים. כפי שניתן לראות באיור 1, אנו מפוברקים תבניות PDMS micropatterned, והידרוג'ל המכיל תאים הועמס על גבי משטח הידרופילי של תבניות אלה ושימוש במכשיר אדים כדי ליצור ערפל תרסיס של g...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה של ​​בודה גיליונות הידרוג'ל מודולרי, והרכבתם כדי ליצור פיגומים סלולריים 3D.

לבנות מבני אלגינט דוגמת ברור בזמן קצר, אנחנו צריכים לזהות תהליך cross-linking שיכול ליצור מבנים קשיחים מספיק כדי לשמור על micropatterns...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Powdered nonionic surfactant
Alginic acid sodium salt, low viscosity	Alfa Aesar	B25266
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonic humidifier	MediHeim	MH-2800	Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
Polycarbonate mold			Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern