הכנה ובדיקה של עכבה מבוססי biochips fluidic עם תאים RTgill-W1 טוב ההערכה המהירה של שתייה דגימות מים עבור רעילות

Summary

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Abstract

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

Introduction

המטרה הכללית הייתה לפתח שיטת תא הזריעה, האחסון ובחינת biochips fluidic ב biosensor ECIS. המטרה לפיתוח biosensor זה הייתה לפגוש מפרטי צבא ארה"ב עבור מכשיר נייד שדה שיכול לזהות זיהום אפשרי של אספקת מים לשתייה בשימוש על ידי חיילים. הדרישות עבור החיישן הרעיל היו שזה יכול לזהות קשת רחבה של תרכובות תעשייתיות רעילות במהירות (תוך שעה) בריכוזים רלוונטיים לבריאות אדם, כי מכשיר להיות שדה-נייד, ואת הרכיבים הביולוגיים יהיו חיי מדף של לפחות תשעה חודשים. קירור, אבל לא קפוא, של רכיבים מתכלים היו מקובלים.

מבחינה היסטורית, טכנולוגיות בדיקות מים ניידים שדה עם מרכיב ביולוגי אליהם (כגון נוגדנים, אנזימים, או חומצות גרעין) כבר אנליטי ספציפי ^1-3. החסרון לסוגים אלה של חיישנים ביולוגיים הוא שהם יהיו Only לזהות סוג של כימיקל אחד בכל פעם. חיישנים מרובים נדרשים אם הוא חשוד כי יותר מ כימי אחד קיים. אם חיישן ספציפי הוא לא ברפרטואר הבדיקה, מזהמים כימיים במים יכולים בקלות ללכת מבלי שיבחינו בו.

Broad מבוסס חיישנים רעילים, ומצד שני, יש הפוטנציאל למלא את פער הטכנולוגיה הזו. יש אלה בדרך כלל מרכיב הסלולר להם ^4-8. היתרונות של חיישנים ביולוגיים רעילות בקנה מידה רחב יהיו שיוכלו לזהות נוכחות של מגוון רחב של מזהמים כימיים, כולל תערובות אלמונים, בתוך פרק זמן קצר יחסית ^5,9,10.

הרעיון של שימוש במדידת עכבה חשמלית של monolayers התא כחיישן רעילות אפשרי, אשר ידוע גם בשם חישת עכבת תא מצע חשמלי (ECIS), תואר לראשונה על ידי Giaever ו Keese ^11. במהלך שני העשורים האחרונים הוכח להיות אינדיקטור רגיש של התא viab ility ו cytotoxicity. ביסודו של דבר, monolayer התא כי היא דבקת האלקטרודות על biochips חשוף בתדר גבוה ומתח נמוך אות הנוכחי amperage לסירוגין. בשכבה והמחוברת של תאים מעכבת את זרימת אלקטרונים. כאשר שלמות monolayer התא נפגעת (כגון כאשר חומר כימי רעיל הוא הציג), חיישן ECIS רושם שינוי העכבה החשמלית ^11-14. איור 1 מדגים את העיקרון של ECIS ביחס monolayer התא על biochip .

איור 1:.. עיקרון ECIS האיור של monolayer תא על biochip עם סכמטי חשמלי קורא ECIS פשוט אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

> בתחילה, שורות תאים יונקים היו זורעים ב biochips fluidic ושימשו בטכנולוגיה חיישן ECIS המתואר כאן ^12. תאים אלה לא היו מעשיים לשימוש בשטח, לעומת זאת, כי הם נדרשים שינויי תקשורת תכופה, היו חיי מדף מוגבלים, נדרשים סביבה מלאכותית CO ₂ ובטמפרטורת דגירת 37 מעלות צלזיוס. התגלה כי קו תא זמין מסחרי שמקורם בתאי האפיתל זימי פורל קשת (RTgill W-1 תאים) יכול להיבדק בטמפרטורת חדר סביבת CO _2, נוצר בשכבה ומחוברת של biochips, יכול להיות מאוחסן בטמפרטורה בקירור, ו הייתה תגובה מהירה (1 hr או פחות) לקשת רחבה של כימיקלים בריכוזים רלוונטיים לבריאות אדם ^12. יישומים של תאים RTgill-W1 ב טוקסיקולוגיה, וכן במחקר בסיסי, נבדקים על ידי Lee et al. ¹⁵

שיטות זריעה, אחסון ובחינת biochips fluidic המכיל monolayers של תאים RTgill-W1 על biochips fluidic בתוך biosensor ECIS מתוארים כאן. Biochips fluidic ניתן לאחסן עד 9 חודשים במצב בקירור ניתן להעבירה במיכל בקירור, לבדיקה של SUPPLIES.THE מי השתייה המלווה הקוראים ECIS, או יחידות הבדיקה, נשלחים בנפרד. Biochips יש שני מרכיבים אליהם; שכבת פוליקרבונט עליונה עם שני ערוצים נוזלים נפרדים, ושכבה אלקטרונית נמוכה המכילה ארבע כריות אלקטרודה לכל ערוץ עבור חישת עכבה. ישנם 10 אלקטרודות עבודה לכל כרית; אלקטרודה כל הוא 250 מיקרומטר קוטר. Biochips התאספו להם קשרים אלקטרודה זהב לרכישת קריאות עכבה כאשר מוכנס לתוך יחידת מבחן ECIS. כל אחד מהערוצים בצורת U fluidic שני סגורים יקיימו 2 מיליליטר של השעית תא RTgill-W1. איור 2 מראה biochip fluidic בקורא ECIS עם גדלה של תאים ומחובר על אלקטרודה חישה יחידה.

= "Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
איור 2:.. Biochip fluidic ב ECIS Reader אזור מוגדל תערוכות בשכבה ומחוברת של תאי RTgill-W1 על אלקטרודה חישה יחידה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

1. הכנת חומרי מבחן

הערה: כדי להכין את biochips לבדיקה, כמה צלוחיות ומחוברות של תאי RTgill-W1 צריך להיות מוכן. הערכה טובה של מספר צלוחיות שצריכות זה בקבוק אחד ומחוברות T175 במשך 16 biochips להיות זורע.

1. בצע את השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגי שני בכיתה (biohood) באמצעות טכניקה מזוהמת. השתמש 70% אתנול עבור חיטוי biohood וכל חומר להציב את מכסה המנוע.
   1. כן מצע פיברונקטין עבור biochips fluidic על ידי הפשרת בקבוקון 1 מ"ג של פיברונקטין והדילול ב 100 מיליליטר של 15 L תקשורת סטריליים בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. להקפיא ב 40 aliquots מ"ל צינורות פוליפרופילן סטרילי 50 מ"ל חרוטי ב -20 ° C. להפשיר בכמה שעות בטמפרטורת החדר לפני זריעת biochips. לאחר מופשר, אל תקפיאו.
   2. הכן התקשורת תרבית תאים על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום שור העובר, 5 מ"ל של 200 מ"מ sup L-alanyl-L- גלוטמיןplement, ו -5 מ"ל של פתרון פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יחידות פניצילין / מ"ל ​​ו -10,000 מיקרוגרם סטרפטומיצין / מ"ל) המניה ל -500 מ"ל של L-15 מדיה. זו תניב 560 מיליליטר של תרבית תאי תקשורת המכילה סרום 9%. לְקַרֵר.
      הערה: זו תהיה תקשורת תרבית תאים המלאה המשמשת צלוחיות תרבות biochips.
2. בקבוקי מדיה אבקה
   1. הכן מראש 0.1 DRAM בקבוקוני snap-כובע המכילים 60 מ"ג ± 0.5% של אבקת L-15ex באמצעות מתקן אבקה אוטומטית. לייבל צלוחיות עם התאריך האבקה היה מרוקן בקבוקוני במקרר (בכמויות של 50) בשקיות פולי metalized recloseable; כל חבילות התייבשות שלוש 1 גרם סיליקה ג'ל המכיל.
      הערה: תקשורת בקבוקוני אבקת L-15ex יכולים להתבצע לאחסן עד 9 חודשים מראש של בדיקות.
3. בצע פתרון של 100 מ"ל 20% אקונומיקה על ידי דילול אקונומיקה ביתית עם מים ללא יונים (DI). מעריכים כי 5 מ"ל של תמיסת אקונומיקה יהיה צורך עבור כל דוochip.
4. הפוך מכלולים צינורות biochip ידי חיתוך 27 סעיפי מ"מ של צינורות ביולוגיים autoclavable (2 סעיפים לכל biochip להיות זורעים) ולהשתלב בשני הקצוות של הצינור עם אבזרי luer תלושים פוליקרבונט. מניח מכלולי צינורות בתוך שקית חיטוי autoclavable במשך 8 דקות ב 134 מעלות צלזיוס. כמו כן תקעי biochip חיטוי (2 לכל biochip) בשקית נפרדת אותן ההגדרות.
5. מי חיטוי DI במשך 30 דקות at121 ° C.
   הערה: מים זה ישמש עבור שטיפת biochips לאחר הזריעה. מעריכים כי 10 מ"ל יהיה צורך עבור כל biochip.
   הערה: היקף בפועל של כל ערוץ biochip הוא 2 מיליליטר, אבל 5 מיליליטר של מים סטריליים הוא שטף דרך כל ערוץ לאחר הסרת פתרון אקונומיקה.
6. הפוך מכלולים צינורות הזרקת מזרק על ידי חיתוך 27 סעיפי מ"מ של צינורות ביולוגיים מצרף אבזרי luer התלוש זכר בשני הקצוות של הצינור. מניח מכלולי צינורות בתוך כיס עיקור בחום חותם נייר חיטוי במשך 8 דקות ב 134 &# 176; ג.

נוהל 2. מתזמן biochip fluidic

הערה: בצע את כל הנהלים שבו biochips או התקשורת מתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה באמצעות טכניקה מזוהמת.

1. עשרים וארבע שעות לפני זריעה מתוכננת, להסיר את biochips מאריזה יצרנית של biohood ומקום במקרי מכשיר פלסטיק מעוקר.
2. לעקר את biochips באמצעות פתרון אקונומיקה 20% כדלקמן
   הערה: היסטורי, הליך הלבנה זו מנע גידול פטרייתי של biochips במהלך האחסון לטווח ארוך במקרה כי עיקור הפלזמה של biochips נעשה על ידי היצרן לא היה יעיל.
   1. באמצעות מזרק 20 מ"ל סטרילי עם צינורות הזרקה במזרק המצורף הרכבה ועבודה של biohood, להזריק 2 מ"ל של פתרון אקונומיקה 20% לתוך כל ערוץ של biochip. אפשר biochips לשבת במשך שעה 1 עם פתרון האקונומיקה.
   2. לאחר שעה, asp ואקוםנזעם פתרון האקונומיקה משני הערוצים באמצעות הרכבת luer התלוש זכר סטרילי המצורפת צינורות ואקום היניקה. השתמש באחת הרכבות צינורות biochip כביוב כאשר שטיפת biochips.
   3. באמצעות מזרק 20 מ"ל סטרילי מחוברת הרכבה הזרקת מזרק סטרילי, שטוף כל ערוץ של השבב עם 5 מ"ל של מים סטריליים, המאפשר את המים העודפים להתנקז לתוך המיכל biohood. ואז ואקום לשאוב את המים כפי שתואר על האקונומיקה ומקום biochips בחזרה במקרי מכשיר פלסטיק ולהשאיר את biohood עד זורעים עם תאים למחרת.
3. שישים דקות לפני זריעת biochips, להזריק 2 מ"ל של פתרון פיברונקטין 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​לתוך כל ערוץ של biochip. השאירו את biochips ב biohood למשך 60 דקות, ולאחר מכן לשאוב לשאוב את פיברונקטין (כמתואר בשלב 2.2.3) לפני זריעת biochip עם תאים. מניח שני קטעים של מכלולי צינורות biochip סטרילי (עייןסעיף 1.4) על היציאות של biochips.
4. Trypsinize בקבוק T175 אחד ומחוברות RTgill-W1 על כל 16 biochips באמצעות הנהלים המפורטים באוסף התרבות האמריקאית סוג גיליון תיאור המוצר (ATCC) ^16.
   1. לשאוב את התקשורת מהבקבוק והמחובר (ים) של תאים.
   2. יש לשטוף את שכבת התאים עם 15 מ"ל של PBS ולאחר מכן לשאוב את.
   3. הוסף 6 מ"ל של טריפסין / EDTA אל שכבת התאים בכל בקבוק T175 ולאפשר לתאים trypsinize עבור ~ 5 דקות.
   4. הוסף 15 מ"ל של התקשורת תרבות שלמה L-15 תא בקבוק אחד להפסיק trypsinization.
   5. מערבב את מתלי התא במכל חד פעמי סטריליות.
      הערה: גודל מיכל יכול לנוע בין 150-500 מ"ל, תלוי במספר biochips להיות זורעים. מעריכים כי 5 מ"ל של תרחיף תאים יהיה צורך לכל biochip.
5. הסר ~ 1 מיליליטר של השעית התא ומקום לתוך צינור microcentrifuge עבור ספירה. באמצעות מיקרוסקופ brightfield עם objecti 10Xve ו hemocytometer, סופרות aliquot 10 μl של תאים ולחשב את היקף התקשורת L-15 תא תרבות שלמה הדרוש להשגת השעיה תא של 2.5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל.
   הערה: אם אתה משתמש השעית תא זרע צלוחיות להמשיך התרבות, זו תהיה הנקודה לעשות זאת. התאם את ריכוז תא השעיה באמצעות תרבית תאי תקשורת מלאה L-15.
6. באמצעות syringeattached 20 מיליליטר סטרילי לאסיפת צינורות הזרקת מזרק סטרילי (ראה סעיף 1.6), להזריק 2.5 מיליליטר של השעית התא ליציאה החיצונית של כל ערוץ של biochip (כלומר, את היציאות אין להם את הצינורות מחוברים), המאפשר חלק ההשעיה תא נוסף לזרום החוצה של הצינור לתוך מיכל פסולת של biohood.
   הערה: פעולה זו תבטיח כי הערוץ כולו הצינור מחובר יהיה מלאים השעית התא.
   1. צור לולאה סגורה עבור כל ערוץ biochip ידי הוספת את הקצה החופשי של הצינור עם fitti luerng לתוך השקעים החיצוניים עבור כל ערוץ.
   2. נגב כל מדיה עודפת הנחה של הלולאות הסגורות עם מגבת נייר טבולה 70 אתנול% ומקום biochips בחזרה בתיבת הפלסטיק C חמם 20 °. תנו לכל biochip מספר זיהוי ייחודי.
7. בימים 4 ו -7, להסיר את biochips מן החממה 20 ° C ומלא את התקשורת בכל biochips עם תקשורת תרבית תאי L-15 שלמה-equilibrated טמפרטורה. בצע את אותו התהליך כמו בשלב 2.6 למעט שימוש רק מדיה תרבית תאי L-15 במקום (לא השעית תא). מניחים את biochips בחזרה בחממה 20 ° C לאחר שההנקה 4 יום.
   1. לאחר האכלה 7 יום, להסיר ולסלק את הצינורות מן שבבי והכנס את פקקי הניקוז autoclaved ב biochips.
   2. מניחים את biochips בקופסה C חממה 6 ° עד בשימוש לבדיקה.
      הערה: השבבי ניתן לאחסן בטמפרטורה בקירור עד 9 חודשים והם עדיין מעשיים עבור i בדיקותn הקוראים ECIS.

3. בדיקת ECIS עם biochips

1. כן כימיקלי מבחן אם משתמש. (ראה ברנן, et al., 2012 ⁷ להכנת כימיקלים מבחן).
2. סר קורא ECIS ואספקת בדיקה מתוך תיק הנשיאה. הסרת biochip מוכן מן החממה C 6 °. מניחים את biochip על מגבת נייר. הפעל את הקורא ECIS.
3. באמצעות 10 מ"ל מזרקים, להפריש 10 מ"ל מים מלאים לתוך צנצנת מלאת פלסטיק שקוף 0.5 אונקיה שכותרתו 10 מיליליטר של מדגם הבדיקה לצנצנת בדיקת פלסטיק שקוף 0.5 אונקיה שכותרתו.
   הערה: 1) הקפד להסיר בועות עבור מדידה מדויקת. 2) מזרקים וצנצנות מקודדים באמצעות צבע; כחול לבקרה אדומה עבור בדיקה.
4. סור שני בקבוקוני תקשורת אבקה מן שקיות נייר הכסף. אחד פתוח צלוחיות תקשורת האבקה (כלי רב שימוש במידת צורך) ויוצקים כל תוכן של בקבוקון אחד לתוך הצנצנת במים מלאים, שומט את הבקבוקון כולו לתוךהפתרון גם כן. חזור על הליך זה עם צנצנת הבדיקה. שווי ולנער את הצנצנות על מנת להבטיח כי האבקה היא מומסת.
5. ממלאים כל של מזרקים 10 מ"ל בצבע עם 9 מ"ל של או מלאה (מזרק כחול) או מבחן (מזרק אדום) פתרונות מן בקבוקונים בהתאמה. הסר בועות אוויר מזרקים.
6. הסר את המצתים מנמלי biochip ולצרף לטמיון.
7. מניחים את biochip למגש פלסטיק נשלף בקורא ECIS ולסגור את המכסה.
8. צרף מזרקים מלאים ליציאות biochip החיצוניות ולצרף את הבוכנה במזרק.
9. מהמסך הראשי, בחר "הבא" כדי ליזום בדיקה מקדימה.
   הערה: תוכנת Reader תבדוק עכבות. אם עכבות נמצאות בטווח המוגדר על ידי המשתמש (בדרך כלל בין 1,000 ל -3,000 אוהם) המסך ירשום "מחסנית העבר" כמצוין באיור 3, ולהורות למשתמש לבחור "הבא" ואת התוכנה תהיה המשך לשלב 3.10). אם עכבות והם אינם מצוייםבטווח סט בגלל biochip פגום או חיבור לקוי של biochip לקורא (בדרך כלל עקב חוסר תיאום בין אלקטרודות), ואז המסך ירשום "מחסנית נכשל" ואת תהיה למשתמש אפשרות או "בטל" או "אמת" במבחן.
   1. בחר "בטל" כדי לחזור לשלב 3.9). בחר "אמת" כדי להמשיך לשלב 3.10) לאחר הקבלה "מחסנית העבר" הודעה ובחירה "הבא".
      הערה: עדיף לקחת את biochip החוצה חזותית לבדוק בו פגמים או דולף אם "מחסנית נכשל" ההודעה התקבלה לפני שתמשיך עם biochip חדש.

איור 3:. ECIS Reader תמונת מסך של biochip עם קריאות עכבה קבילות בצילום מסך פרטי קריאות עכבה ראשוניות אוהם של כל אחת השיתוף 4אלקטרודות ntrol (CE) ו -4 אלקטרודות בדיקה מדגמית (SE) בתוך biochip fluidic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

10. כאשר יתבקש על ידי הקורא, זן המידע המדגם באמצעות מקלדת רכה ולאחר מכן בחר 'קבל' בסיום.
    הערה: התוכנה הקוראת ECIS אוטומטי תחתים כל נתונים עם התאריך, השעה ומידע נוסף שזין המשתמש; כגון מספר biochip, ואת סוג חומר כימי והריכוז. שני דק של נתוני עכבה ייאסף מן biochip מוכנס טיימר על מסך יספור-פעם למטה.
11. אחרי שתי דקות כאשר תתבקש לעשות זאת לפי ההוראות על המסך כי הם הברקה בתוך תיבה אדומה, פגע "הבא". כשתתבקש קופסה ירוקה מהבהבת כדי "להזריק דגימות עכשיו", להזריק מלאה התקשורת הבדיקה מן מזרקים מחוברים בו זמנית לתוך biochip channאלס. השאר את המזרקים במקום על biochips בסיום.
    הערה: ערכי עכבה ייאספו אחת לדקה למשך 60 דקות. אם תוכנת קורא ECIS קובעה כי ערוץ הטיפול שונה סטטיסטית מהערוץ המלא בכל נקודה בין 10 ל 60 דקות לאחר תחילת בדיקה, ולאחר מכן התצוגה על מסך תציין כי המדגם הוא "מזוהם". אם הטיפול אינו שונה מערוץ שליטה, אז המסך יציין "אין זיהום זוהה" בסוף של הפעלה נסיונית.
12. תוצאות הבדיקה קלט כ מזוהם או לא מזוהמות עבור כל דגימה.
13. בסוף בטווח הבדיקה, להסיר ולסלק biochip. לשטוף ואוויר-לייבש את מזרקים, מבחנות הבדיקה מגש פלסטיק נשלף בו שכנו biochip במהלך הבדיקות.
    הערה: קורא ECIS יש 4 GB של אחסון משולב עבור התוכנה המבצעית, מודלים מלאי קבצי הבדיקה מופקים הפעלת בדיקה. זה מאפשר מספר הקבצי הבדיקה ousand להיות מאוחסן על הקורא. קבצים ניתן לאחזר עם כונן USB לקפוץ והועברו למחשב לניתוח נוסף למטרות מחקר אם ירצו בכך.

תוצאות

טכנולוגית ECIS המתואר במאמר זה עבר בדיקה בסוכנות להגנת הסביבה בארה"ב (USEPA) -sponsored בדיקת טכנולוגית תכנית ההערכה (TTEP). שלושה עשרה כימיקלים נבחרו לבדיקה כנציגי קשת רחבה של תרכובות תעשייתיות רעילות שעלולה להיות מזהמים אפשריים של מי שתייה. במהלך בדיקה, 9 של 13 התגלו על ידי ECIS בתוך שעות בריכוזים שרלוונטיים לבריאות האדם ^8. טבלה 1 מציגה את תוצאות בדיקת זיהום זה. איור 4 הוא נציג של איזו תוצאה "מזוהמים" תיראה על המסך הקורא ECIS. על פי רוב, עכבות הסלולר ירד עבור דגימות מזוהמות בהשוואה לקבוצת ביקורת. לפעמים, תרכובות מסוימות עשויות לגרום לעליית עכבה.

כמו כן מוצג בטבלה 1 הוא בדיקות מים נקיים. ארבעים דגימות מים נקיים נוהלו ואין זיהום זוהה בכל הדגימות (ראה איור 5) עבור צילום מסך נציג "זוהה זיהום לא".

איור 4: ECIS Reader תמונת מסך של דגימת מים "מזוהמת" דוגמא גרפיקת תוצאות עכבה מנורמלות ממדגם מים כי היה מזוהם.. קווים כחולים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות השליטה; קווים אדומים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות מדגם בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: מסך Reader ECIS של "זיהום זוהה לא" דגימת מי דוגמא גרפיקת תוצאות עכבה מנורמלות ממדגם מים שלא היה מזוהם.. קווים כחולים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות השליטה; קווים אדומים מייצגים עכבות מנורמלות של כל אחת האלקטרודות מדגם בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קטגוריה	המזהם	ריכוז נבדק (מ"ג / ליטר) 1			זוהה ≤1 שעה n = 4/4 שבבי
דברה	Aldicarb	0.17			לא
	ארסן ic (arsenite נתרן)	4.5			כן
	אזיד (אזיד הנתרן)	46.7			כן
	Fenamiphos	0.56			לא
	Methamidophos	1.4			לא
	parathion מתיל	33.6			כן
	Paraquat (dichloride)	4.6			לא
	Pentachlorophenate (נתרן)	71.9			כן
כימיקלים תעשייתיים	אַמוֹנִיָה	924			כן
	נחושת (נחושת גופרתית II)	103			כן
	ציאניד (נתרן)	כן
	מרקורי (כלוריד)	24.7			כן
	טולואן	444			כן
מים נקיים 2	אף לא אחד	NA			לא
1 ריכוזים הנבדקים זהים בכתב היד על ידי וידר, et al. (2014).
2 40 דגימות מים נקיים נוהלו ללא זיהום.

3 "> 14

טבלה 1: מזהמים בדגימות מים זוהה על ידי ECIS.

Discussion

הטכנולוגיה ECIS ביצועים טובים במעבדה הגדרה והיה מסוגל לזהות מזהמים מים פוטנציאל בריכוזים שרלוונטיים לבריאות האדם. ניידות ואריזה של הטכנולוגיה עושה את זה תורמת השימוש בשטח.

צעדים קריטיים בפרוטוקול להצלחת הטכנולוגיה הם כדלקמן: 1) לשמור על תנאים מזוהמים במהלך התרבות, זריעה, והאכלה של biochips, 2) שמור על biochips זרע בתנאים בקירור עד מוכן לבדיקה מאז תאי RTgill-W1 לא ישרוד זמן רב מאוד ברגע שהם חשופים לטמפרטורות מעל 25 ° C, 3) מדויקים לשקול את L-15ex צלוחיות תקשורת האבקה למדוד במדויק את דגימות מים כדי למנוע הפקת תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיגרם על ידי תזוזה osmolality של התקשורת ולא רעילות מדגם, 4) פעל לפי ההוראות המשתמש במסך ECIS להרצת בדיקות. התוכנה אצל הקורא יתריע למשתמש אם מדינה דוochip אינה מקובלת לבדיקה (המבוססת על קריאות עכבה ראשוניות) כאשר biochip מוכנס ראשון לתוך הקורא. אם רמות העכבה אינן מקובלות לבדיקה, התוכנה לא תאפשר למשתמש להמשיך עם בדיקות עד biochip חדש משמש. סיבות קריאות עכבה מקובלות בדרך כלל עקב חוסר תיאום קל של אלקטרודות biochip עם סיכות קורא ECIS או דליפת נוזל לאורך אחד הקצוות הדבקים של biochip.

יש כמה מגבלות על הטכנולוגיה הזו בגלל חיישן ECIS נבדק רק עם מי שתייה ולא עם מים עיליים. התאים RTgill-W1 כי הם על biochip לא יכול לסבול הקפאה או טמפרטורות הרבה מעל 25 מעלות צלזיוס למשך פרק זמן ממושך (מסגרת הזמן יכול להיות משעות ימים תלוי בטמפרטורה. Biochips לתפקד בצורה הטובה ביותר בתחום טמפרטורות מ בקירור בטמפרטורת החדר ^7. הם מוכנים לשימוש מיידי, עם זאת, מיד לאחר להיות removed מ בקירור. מכולות בקירור ניידות משמשות כיום על ידי אנשי צבא בתחום אספקה ​​רגישה לטמפרטורה. מכולות אותו אלה יכולים לשמש לתחבורה biochip זרע.

עוד גבול טכנולוגיה זו הוא כי גם אם היא חיישן רעיל בפס רחב, זה לא מגיב היטב, אם בכלל, כדי תרכובות עיכוב cholinesterase, כגון חומרי הדברה מסוימים. למילוי זה פער יכולות, חיישן ECIS נועד לשמש בשילוב עם assay מבחן הדברה מהירה זמין מסחרי כאשר בודקים דגימות מים כדי לספק את המשתמש עם מגוון רחב יותר של בדיקות רעילות. ההערכה היא assay האנזימטית מהירה נועדה לזהות חומרי דברת organophosphate ו carbamate תוך 30 דקות.

חיישן ECIS משלים את WQAS-PM (ניתוח מערכות איכות מי - רפואה מונעת) מערכת בדיקת מים בתנאי שדה, המשמשת כיום על ידי אנשי רפואה מונעת צבאיים לזהות, ארסןic, עופרת, או ציאניד דגימת מים לשתייה. למרות חיישן ECIS לא יזהה מה חומר המזהם הוא, זה יציין אם מתכות מסוימות או תרכובות אורגניות נוכחות, המציין כי המים לא יכולים להיות מתאימים לצריכה אנושית. תוצאות בדיקת ECIS זמינות בתוך שעה. דגימות המים אז יכולות להישלח החוצה לניתוח נוסף לזיהוי של הזיהום אם יש תוצאה חיובית בבדיקה.

כפי שתואר לעיל, הקורא ECIS נועד להיות חלק ממערכת הכוללת ערכת ACE האנזימטית נפרד כדי לכסות ספקטרום רחב של גילוי מזהמים. שני קוראים אלה שצריכים לארוז בתיק חסון לתחבורת שדה לשימוש בשדה ידי חיילים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).
Fibronectin, bovine plasma	EMD Millipore Corp.   www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips.
L-15 media without L-glutamine	Lonza  www.lonzabioscience.com	12-700F	Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C.
L-15ex powdered media with phenol red	US Biological        www.usbio.net	L1501	Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips.
PBS, w/o Ca2+ or Mg2+	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-516F	Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.
Trypsin, EDTA	Lonza  www.lonzabioscience.com	CC-5012	Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.
T175 culture flasks	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Used for culturing RTgill-W1 cells.
Bleach	Chlorox                                 www.chlorox.com		Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.
70% ethyl alcohol			For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)	American Type Tissue Culture Collection            www.atcc.org	CRL-2523	Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM	Lonza  www.lonzabioscience.com	35050-061	Store at room temperature.  Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-602E	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Pharmed BPT tubing	U.S. Plastic Corp.      www.usplastic.com	57317	Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies	Value Plastics	MTLS210-9	Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.
20 ml syringes, slip-tip	VWR Scientific      us.vwr.com	BD302831	Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials	Bottles Jars and Tubes, Inc.   www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS     medidose.com	IB701	Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13”	CardinalHealth        www.cardinalhealth.com	90713	Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.
Quantos automated powder dispenser	Mettler Toledo       www.mt.com	QB5	Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.
ECIS reader	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.
3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags	Uline                 www.uline.com	S-16893	Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.
Leatherman squirt ps4	Amazon          www.Amazon.com		Used to open powdered media vials.
1 g silica gel desiccant packets	Uline                 www.uline.com	S-3902	Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.
Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C or E	Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.
Plugs for biochips	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C.
Drains for ECIS biochips	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader.  Allows for excess media to drain from channels during test injections.
Hemocytometer	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.
Brightfield microscope w/ 10X objective	Leitz Labovert		Any brightfield microscope is acceptable.
Class II biological safety cabinet			Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.
Microcentrifuge tubes, 0.6 ml	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells.
Slip 10 cc red syringes	Procedure Products, Inc.       www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip.
Slip 10 cc blue syringes	Procedure Products, Inc.       www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip.
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps	SKS Bottle & Packaging, Inc.        www.sks-bottle.com	0605-30	Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing.
50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes	Fisher Scientific     www.fishersci.com	12-565-269	Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C.
NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test	ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com	ACE-400	Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water