Préparation et essai d'impédance basée sur biopuces fluidiques avec des cellules RTgill-W1 pour l'évaluation rapide des échantillons d'eau potable pour la toxicité

Résumé

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.

Résumé

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either "Contamination Detected" or "No Contamination Detected" within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.

Introduction

L'objectif global était de développer une méthode pour l'ensemencement des cellules, le stockage et le test de biopuces fluidiques dans le biocapteur ECIS. L'objectif pour le développement de ce biocapteur était de répondre aux spécifications de l'armée américaine pour un appareil portable sur le terrain qui pourrait détecter une éventuelle contamination de l'approvisionnement en eau potable utilisée par les soldats. Les exigences pour le capteur de toxicité étaient qu'il pourrait détecter un large spectre de composés industriels toxiques rapidement (en une heure) à des concentrations pertinentes pour la santé humaine, que le dispositif soit champ portable, et les composants biologiques aurait une durée de vie de au moins neuf mois. Réfrigération, mais pas le gel, des composants périssables était acceptable.

Historiquement, les portables technologies de test de l' eau sur le terrain avec une composante biologique pour les (tels que des anticorps, des enzymes, ou des acides nucléiques) ont été ^1-3 spécifique de l' analyte. L'inconvénient de ces types de biocapteurs est qu'ils ONLy détecter un type de produit chimique à la fois. Plusieurs capteurs sont nécessaires si l'on soupçonne que plus d'un produit chimique est présent. Si un capteur spécifique est pas dans le répertoire de test, les contaminants chimiques dans l'eau pourraient facilement passer inaperçus.

capteurs de toxicité à base large, d'autre part, ont le potentiel pour combler cette lacune de la technologie. Ceux - ci ont généralement un composant cellulaire pour les ^{4 à 8.} Les avantages de biocapteurs de toxicité à base élargie sont qu'ils peuvent détecter la présence d'un large éventail de contaminants chimiques, y compris les mélanges et inconnues, dans une période relativement courte de temps ^5,9,10.

Le concept d'utiliser la mesure de l' impédance électrique des monocouches de cellules en tant que capteur de toxicité possible, ce qui est également connu comme substrat cellulaire électrique de détection d' impédance (ECIS), a été décrite par Giaever et ¹¹ Keese. Au cours des deux dernières décennies, il a été montré comme un indicateur sensible de la cellule viabilité et la cytotoxicité. Fondamentalement, la monocouche cellulaire qui adhère aux électrodes sur les biopuces est exposée à haute fréquence et à basse tension et l'intensité signal de courant alternatif. La monocouche confluente de cellules empêche l'écoulement des électrons. Lorsque l'intégrité de la monocouche cellulaire est compromise ( par exemple, quand un produit chimique toxique est introduit), le capteur ECIS enregistre une variation de l'impédance électrique ^14/11. La figure 1 illustre le principe de l' ECIS par rapport à la monocouche de cellules sur la biopuce .

Figure 1:.. Principe de ECIS Illustration d'une monocouche cellulaire sur une biopuce avec lecteur de ECIS simplifié schéma électrique S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans un premier temps , les lignées cellulaires de mammifères ont été ensemencées dans des biopuces et fluidiques ont été utilisés dans la technologie du capteur décrit ci - ECIS ^12. Ces cellules ne sont pas pratiques pour une utilisation sur le terrain, cependant, parce qu'ils nécessité des changements fréquents des médias, a eu une durée de vie limitée, et a nécessité un CO ₂ environnement artificiel et une température d'incubation C 37 °. Il a été découvert qu'une lignée cellulaire disponible dans le commerce provenant de cellules épithéliales truite arc maillants (RTgill W-1 cellules) pourrait être testé à la température ambiante au CO ambiant _2, formé une monocouche confluente dans les biopuces, pourraient être conservés à des températures de réfrigération, et eu une réponse rapide (1 h ou moins) à un large éventail de produits chimiques à des concentrations pertinentes pour la santé humaine ^12. Applications de cellules RTgill-W1 en toxicologie, ainsi que dans la recherche fondamentale, sont examinés par Lee et al ^15.

Méthodes pour l'ensemencement, le stockage et le test de biopuces fluidiques contenantmonocouches de cellules RTgill-W1 sur biopuces fluidiques dans un biocapteur de ECIS sont décrites ici. Les biopuces fluidiques peuvent être stockés pendant jusqu'à 9 mois dans un état réfrigéré et peuvent être transportés dans un conteneur de stockage à froid, pour les tests de l'eau potable supplies.The accompagnant les lecteurs de ECIS, ou unités de test, sont expédiés séparément. Les biopuces ont deux composantes à eux; une couche de polycarbonate supérieure avec deux canaux de fluide séparés, et une couche inférieure électronique qui contient quatre plots d'électrodes par canal pour une impédance de détection. Il y a 10 électrodes de travail par bloc; chaque électrode est de 250 um de diamètre. Les biopuces assemblées ont des connexions d'électrodes d'or pour l'acquisition de lectures d'impédance lorsqu'il est inséré dans l'unité de test de ECIS. Chacun des deux canaux fluidiques fermés en forme de U va contenir 2 ml de la suspension cellulaire RTgill-W1. La figure 2 montre une biopuce fluidiques dans le lecteur ECIS avec un grossissement d'un cellules confluentes sur une seule électrode de détection.

Figure 2:.. Biopuces fluidiques dans ECIS lecteur zone Magnified montre une monocouche confluente de cellules RTgill-W1 sur une seule électrode de détection S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocole

1. Préparation du matériel de test

NOTE: Afin de préparer les biopuces pour les essais, plusieurs flacons confluentes de cellules RTgill-W1 doivent être prêts. Une bonne estimation du nombre de flacons nécessaires est l'un confluentes T175 flacon pour 16 biopuces à ensemencer.

1. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de classe II biologique de sécurité (biohood) en utilisant une technique aseptique. Utiliser 70% d'éthanol pour désinfecter l'biohood et tous les matériaux placés dans le capot.
   1. Préparer le substrat de fibronectine pour les biopuces fluidiques en décongelant un flacon de 1 mg de fibronectine et dilution dans 100 ml de solution stérile L-15 supports pour une concentration de 10 pg / ml. Congeler dans 40 ml aliquotes dans 50 ml tubes en polypropylène coniques stériles à -20 ° C. Décongeler à la température ambiante pendant plusieurs heures avant l'ensemencement des biopuces. Une fois décongelé, ne pas recongeler.
   2. Préparer un milieu de culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal, 5 ml de 200 mM d'un sup L-alanyl-L-glutaminecomplément, et 5 ml d'une solution de pénicilline / streptomycine (10.000 unités de pénicilline / ml et 10.000 pg de streptomycine / ml) de bouillon à 500 ml de L-15 médias. On obtiendra alors 560 ml de milieu de culture cellulaire contenant 9% de sérum. Réfrigérer.
      Remarque: Ce sera le milieu complet de culture cellulaire utilisée pour les flacons de culture et les biopuces.
2. Poudres médias Flacons
   1. Préparer à l'avance flacons 0,1 dram snap-bouchon contenant 60 mg ± 0,5% de poudre L-15ex en utilisant un distributeur de poudre automatisé. Etiqueter les flacons avec la date de la poudre a été distribué et flacons réfrigérer (en quantités de 50) dans refermables poly sacs métallisés; chacun contenant trois paquets de dessication de gel de silice 1 g.
      Remarque: les flacons L-15ex médias en poudre peuvent être fabriqués et stockés jusqu'à 9 mois à l'avance des tests.
3. Faire une solution de 100 ml de 20% l'eau de Javel en diluant l'eau de Javel avec (DI) de l'eau déminéralisée. Estimation que 5 ml de solution d'eau de Javel seront nécessaires pour chaque biochip.
4. Faire des assemblages de tubes de biopuce en coupant 27 sections mm de tube biocompatible autoclavable (2 sections pour chaque biopuce à ensemencer) et monter les deux extrémités du tube avec raccords Luer en polycarbonate de glissement. Placez les assemblages de tubes dans un sac autoclavable et autoclave pendant 8 min à 134 ° C. Aussi bouchons autoclave de biopuces (2 par biopuce) dans un sac séparé aux mêmes paramètres.
5. Autoclave eau DI pendant 30 min at121 ° C.
   Remarque: Cette eau sera utilisée pour le lavage des biopuces après l'ensemencement. Estimer que 10 ml seront nécessaires pour chaque biopuce.
   Remarque: Le volume réel de chaque canal de biopuce est de 2 ml, mais 5 ml d'eau stérile est rincé à travers chaque canal après le retrait de la solution d'eau de Javel.
6. Fabriquer des ensembles de tubes d'injection de la seringue en coupe 27 mm sections de tube biocompatible et la fixation des raccords mâle Luer slip aux deux extrémités du tube. Placez les assemblages de tubes dans une poche de stérilisation papier thermo-soudage et autoclave pendant 8 min à 134 &# 176; C.

2. Fluidic Procédure biopuce Semis

Remarque: Effectuez toutes les procédures où les biopuces ou les médias sont manipulés dans une enceinte de sécurité biologique de classe II en utilisant une technique aseptique.

1. Vingt-quatre heures avant le semis prévu, retirez les biopuces du fabricant d'emballage dans le biohood et dans les cas d'instruments en plastique stérilisés.
2. Stériliser les biopuces en utilisant une solution d'eau de Javel à 20% de la manière suivante
   Remarque: Dans le passé, ce procédé de blanchiment a empêché la croissance fongique dans les biopuces au cours du stockage à long terme dans le cas où la stérilisation par plasma des biopuces effectuées par le fabricant n'a pas été efficace.
   1. En utilisant une seringue de 20 ml stérile avec une tubulure d'injection de seringue ensemble attaché et travaillant dans le biohood, injecter 2 ml de la solution d'eau de Javel à 20% dans chaque canal de la biopuce. Autoriser les biopuces à siéger pendant 1 h avec la solution d'eau de Javel.
   2. Après une heure, vide aspen colère la solution d'eau de Javel à partir des deux canaux en utilisant un mâle ensemble slip luer stérile attaché à la tuyauterie d'aspiration sous vide. Utilisez l'un des ensembles de tubes de biopuce comme un drain lors du rinçage des biopuces.
   3. En utilisant une seringue de 20 ml stérile fixé à un ensemble d'injection de seringue stérile, rincer chaque canal de la puce avec 5 ml d'eau stérile, permettant à l'excès d'eau dans un récipient dans le biohood. Ensuite, le vide-aspirée hors de l'eau que nous venons de décrire pour l'eau de Javel et placez les biopuces de nouveau dans les cas d'instruments en plastique et laisser dans le biohood jusqu'à ensemencées avec des cellules le jour suivant.
3. Soixante minutes avant l'ensemencement des biopuces, injecter 2 ml de la / ml solution fibronectine 10 pg dans chaque canal de la biopuce. Laissez les biopuces dans le biohood pendant 60 min, puis sous vide Aspirer l'fibronectine (tel que décrit à l'étape 2.2.3) avant de semer la biopuce avec des cellules. Placez deux sections des assemblages de tubes de biopuce stériles (voirsection 1.4) sur les ports des biopuces.
4. Trypsiniser un confluentes RTgill-W1 flacon T175 pour 16 biopuces en utilisant les procédures décrites dans l'American Type Culture Collection (ATCC) description du produit feuille ^16.
   1. Aspirer le support du flacon (s) confluente de cellules.
   2. Rincer la couche cellulaire avec 15 ml de PBS, puis aspirer hors tension.
   3. Ajouter 6 ml de trypsine / EDTA à la couche de cellules dans chaque flacon T175 et permettent aux cellules de trypsiniser pendant environ 5 min.
   4. Ajouter 15 ml de L-15 complète des milieux de culture cellulaire dans chaque flacon pour arrêter trypsinisation.
   5. Combiner les suspensions de cellules dans un récipient jetable stérile.
      Remarque: La taille des conteneurs peut varier de 150-500 ml, en fonction du nombre de biopuces étant ensemencée. Estimation que 5 ml de suspension cellulaire seront nécessaires par biopuce.
5. Retirer ~ 1 ml de la suspension cellulaire et le placer dans un tube à centrifuger pour le comptage. À l'aide d'un microscope à fond clair avec un 10X objectivationve et un hémocytomètre, compter une aliquote de 10 pi de cellules et de calculer le volume de toutes les L-15 milieux de culture cellulaire nécessaire pour atteindre une suspension cellulaire de 2,5 x 10 ⁵ cellules / ml.
   Remarque: Si vous utilisez la suspension cellulaire aux semences des flacons pour continuer la culture, ce serait le point de le faire. Ajuster la concentration de la suspension cellulaire en utilisant toutes les L-15 milieux de culture cellulaire.
6. En utilisant une solution stérile de 20 ml syringeattached à un ensemble de tubes d'injection de seringue stérile (voir section 1.6), injecter 2,5 ml de la suspension cellulaire dans l'orifice externe de chaque canal de la biopuce ( par exemple, les ports qui ne possèdent pas le tube en annexe), permettant à une partie de la suspension cellulaire supplémentaire à sortir du tube dans un conteneur de déchets dans la biohood.
   Remarque: Cela permettra d'assurer que l'ensemble du canal et le tube fixé seront pleins de la suspension cellulaire.
   1. Créer une boucle fermée pour chaque canal de biopuce en insérant l'extrémité libre du tuyau avec les Fitti luerng dans les ports externes pour chaque canal.
   2. Essuyez tous les médias en excès hors des boucles fermées avec une serviette en papier humidifié avec 70% d'éthanol et de placer les biopuces dans la boîte en plastique dans un incubateur à 20 °. Donnez à chaque biopuce un numéro d'identification unique.
7. Les jours 4 et 7, retirez les biopuces de la 20 ° C incubateur et reconstituer les médias dans tous les biopuces avec toutes les L-15 milieux de culture cellulaire équilibrée température. Suivre la même procédure que dans l'étape 2.6, sauf utilisation juste L-15 milieux de culture cellulaire à la place (pas de suspension cellulaire). Placez les biopuces de retour dans le 20 ° C incubateur après le jour 4 alimentation.
   1. Après la journée 7 alimentation, enlever et jeter les tuyaux des copeaux et insérez les bouchons de vidange autoclavées dans les biopuces.
   2. Placez les biopuces dans une boîte dans un incubateur à 6 ° jusqu'à utilisation pour les tests.
      Remarque: Les puces peuvent être conservés à des températures réfrigérées pour un maximum de 9 mois et sont encore viables pour les tests in les lecteurs ECIS.

3. Test ECIS avec biopuces

1. Préparer des produits chimiques d'essai en cas d'utilisation. (Voir Brennan et al., 2012 ⁷ pour la préparation de produits chimiques d'essai).
2. Retirer ECIS lecteur et fournitures de test de la mallette de transport. Retirer une biopuce préparée à partir de la 6 ° C incubateur. Placez la biopuce sur une serviette en papier. Allumez le lecteur ECIS.
3. En utilisant 10 ml seringues, distribuer 10 ml d'eau de contrôle dans un 0,5 oz pot de contrôle en plastique transparent marqué et 10 ml de l'échantillon d'essai dans un 0,5 oz pot d'essai en plastique transparent marqué.
   Note: 1) Assurez-vous d'enlever les bulles pour une mesure précise. 2) Les seringues et les bocaux sont codés par couleur; bleu pour le contrôle et le rouge pour le test.
4. Retirer les deux flacons de médias en poudre des sachets. Ouvrez l'un des flacons de médias en poudre (utilisation de l'outil multifonction si nécessaire) et verser tout le contenu d'un flacon dans le bocal avec de l'eau de contrôle, laissant tomber l'ensemble du flacon danssolution aussi bien. Répétez cette procédure avec le pot de test. Cap et secouer les bocaux pour assurer que la poudre soit dissoute.
5. Remplir chacune des couleurs 10 ml seringues avec 9 ml de lutte (seringue bleu) ou test (seringue rouge) solutions de flacons respectifs. Retirer les bulles d'air des seringues.
6. Retirer les bouchons des ports de biopuces et fixer le drain.
7. Placez la biopuce dans le bac amovible en plastique dans le lecteur ECIS et fermer le couvercle.
8. Fixer des seringues remplies aux ports de biopuces extérieures et fixer le piston de la seringue.
9. Depuis l'écran principal, sélectionnez "NEXT" pour lancer pré-test.
   Remarque: le logiciel Reader vérifiera impédances. Si impédances sont à portée définie par l'utilisateur (généralement entre 1000 et 3000 ohms) l'écran va enregistrer "Cartouche Passed" comme indiqué dans la figure 3, et de charger l'utilisateur de sélectionner "Suivant" et le logiciel va passer à l' étape 3.10). Si les impédances ne sont pas à l'intérieurla plage de jeu en raison d'une biopuce défectueux ou mauvaise connexion de la biopuce au lecteur (généralement en raison d'un mauvais alignement des électrodes), puis l'écran va enregistrer "Cartouche Echec" et l'utilisateur aura la possibilité soit de "Abort" ou "Vérifier" le test.
   1. Sélectionnez "Abandonner" pour revenir à l'étape 3.9). Sélectionnez «Vérifier» pour passer à l'étape 3.10) après avoir reçu une "cartouche Passed" message et en sélectionnant "Suivant".
      Note: Il est préférable de prendre la biopuce sortir et inspecter visuellement pour des défauts ou des fuites si une "cartouche a échoué" message est reçu avant de procéder à une nouvelle biopuce.

Figure 3:. ECIS lecteur Capture d' écran d'une biopuce avec des lectures d'impédance acceptables La capture d' écran montre des lectures d'impédance initiales en ohms de chacun des 4 coélectrodes ntrol (CE) et 4 électrodes d'échantillons de test (SE) au sein de la biopuce fluidiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

10. Lorsque vous êtes invité par le lecteur, entrez les informations échantillon en utilisant un clavier virtuel, puis sélectionnez «Accepter» lorsque vous avez terminé.
    Remarque: Le logiciel de lecture ECIS estampillera automatiquement chaque jeu de données avec la date, l'heure et d'autres informations saisies par l'utilisateur; tels que le nombre de biopuces, et le type de produit chimique et la concentration. Deux minutes de données d'impédance seront collectées à partir de la biopuce insérée et une minuterie sur écran compte à rebours du temps.
11. Au bout de deux minutes lorsque vous êtes invité par les instructions à l'écran qui clignotent dans une boîte rouge, appuyez sur "NEXT". Lorsque vous êtes invité par une boîte verte clignotante à "Injecter échantillons maintenant", injecter le contrôle et les médias de test à partir des seringues attachées simultanément dans le chann biopuceels. Laissez les seringues en place sur les biopuces lorsque vous avez terminé.
    Remarque: Les valeurs d'impédance seront collectées une fois par minute pendant 60 minutes. Si le logiciel de lecture ECIS détermine que le canal de traitement est statistiquement différent du canal de commande à tout moment entre 10 et 60 min après le début du test, puis l'affichage à l'écran indique que l'échantillon est "contaminé". Si le traitement ne diffère pas de la chaîne de commande, l'écran affiche "Aucune contamination détectée» à la fin de l'essai.
12. les résultats des tests d'enregistrement comme contaminés ou non contaminés pour chaque échantillon.
13. A la fin de l'essai, enlever et jeter la biopuce. Rincer et sécher à l'air les seringues, les flacons d'essai et plateau en plastique amovible qui abritait la biopuce pendant les essais.
    Remarque: Le lecteur ECIS dispose de 4 Go de stockage à bord pour le logiciel d'exploitation, les modèles de contrôle et les fichiers de test générés par l'exécution d'un test. Cela permet plusieurs thousand fichiers de test devant être stockées sur le lecteur. Les fichiers peuvent être récupérés avec une commande de saut USB et transférées à un ordinateur pour une analyse ultérieure à des fins de recherche, si désiré.

Résultats

La technologie ECIS décrite dans le présent document ont subi des tests à l'US Environmental Protection Agency (USEPA) -sponsored Testing Technology et le programme d'évaluation (TTEP). Treize produits chimiques ont été sélectionnés pour tester en tant que représentants d'un large éventail de composés industriels toxiques qui pourraient être contaminants possibles de l'eau potable. Lors de l'essai, 9 des 13 ont été détectés par ECIS au sein d' une heure à des concentrations qui sont pertinentes pour la santé humaine ^8. Le tableau 1 illustre les résultats de ce test contaminant. Figure 4 est représentatif de ce qu'est un "contaminé" résultat ressemblerait sur l'écran du lecteur ECIS. Pour la plupart, les impédances cellulaires ont diminué pour des échantillons contaminés par rapport aux témoins. Occasionnellement, certains composés peuvent provoquer une augmentation de l'impédance.

Aussi résumées dans le tableau 1 est l'analyse de l'eau propre. Quarante échantillons d'eau potable ont été effectuées et aucune contamination n'a été détectée dans aucun des échantillons (voir figure 5) pour une capture d'écran représentant de "No Contamination détectée".

Figure 4: ECIS lecteur Capture d' écran d'un "contaminé" échantillon d'eau Un exemple de graphiques normalisés d'impédance et les résultats d'un échantillon d'eau qui a été contaminée.. les lignes bleues représentent les impédances normalisées de chacune des électrodes de commande; lignes rouges représentent les impédances normalisées de chacune des électrodes d'échantillons de test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: ECIS lecteur Capture d' écran d'un échantillon d'eau "Aucune contamination détectée" Un exemple de graphiques normalisés d'impédance et les résultats d'un échantillon d'eau qui n'a pas été contaminée.. les lignes bleues représentent les impédances normalisées de chacune des électrodes de commande; lignes rouges représentent les impédances normalisées de chacune des électrodes d'échantillons de test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Catégorie	contaminant	Concentration Testé (mg / L) 1			Détecté ≤1 heure n = 4/4 jetons
pesticides	aldicarbe	0,17			non
	Arsen ic (arsénite de sodium)	4.5			Oui
	Azide (azoture de sodium)	46,7			Oui
	fénamiphos	0,56			non
	méthamidophos	1.4			non
	parathion de méthyle	33,6			Oui
	Paraquat (dichlorure)	4.6			non
	Pentachlorophénate (sodium)	71,9			Oui
Produits chimiques industriels	Ammoniac	924			Oui
	Cuivre (cuivre II, le sulfate)	103			Oui
	Cyanhydrique (sodium)	Oui
	Le mercure (chlorure)	24.7			Oui
	Toluène	444			Oui
Clean Water 2	aucun	N / A			non
1 Les concentrations testées sont les mêmes que dans le manuscrit par Widder et al. (2014).
2 40 échantillons d'eau potable ont été effectuées sans contamination.

3 "> 14

Tableau 1: les contaminants dans les échantillons d' eau détectées par ECIS.

Discussion

La technologie ECIS de bons résultats dans un environnement de laboratoire et a été en mesure de détecter les contaminants potentiels de l'eau à des concentrations qui sont pertinentes pour la santé humaine. La portabilité et l'emballage de la technologie, il est favorable à une utilisation sur le terrain.

Les étapes critiques dans le protocole pour le succès de la technologie sont les suivants: 1) Maintenir des conditions aseptiques pendant la culture, l'ensemencement, et l'alimentation des biopuces, 2) Garder les biopuces ensemencées dans des conditions réfrigérées jusqu'à ce prêt pour les essais puisque les cellules RTgill-W1 ne survivra pas très longtemps une fois qu'ils sont soumis à des températures supérieures à 25 ° C, 3) peser avec précision le l-15ex dans les flacons de médias en poudre et mesurer avec précision les échantillons d'eau pour éviter de produire des faux positifs, qui peuvent être causés par un changement dans la osmolalité des médias plutôt que la toxicité de l'échantillon, 4) Suivez les instructions de l'utilisateur sur l'écran ECIS pour l'exécution des tests. Le logiciel dans le lecteur avertit l'utilisateur si un biochip est inacceptable pour les essais (sur la base des lectures d'impédance initiale) lorsque la biopuce est d'abord insérée dans le lecteur. Si les niveaux d'impédance sont inacceptables pour les tests, le logiciel ne sera pas permettre à l'utilisateur de procéder à l'essai jusqu'à ce qu'un nouveau biopuce est utilisé. Raisons pour les lectures d'impédance inacceptables sont généralement dues à un léger défaut d'alignement des électrodes de biopuces avec les broches du lecteur ECIS ou une fuite de fluide le long d'un des bords de collage de la biopuce.

Il y a des limites à cette technologie car le capteur de ECIS a seulement été testé avec de l'eau potable et non avec de l'eau de surface. Les cellules RTgill-W1 qui sont sur la biopuce ne peuvent pas tolérer le gel ou à des températures bien au-dessus de 25 ° C pendant des périodes de temps prolongées (laps de temps peut être de quelques heures à jours dépendant de la température. Les biopuces fonctionnent mieux dans une plage de température de réfrigération à température ambiante ^7. Ils sont prêts pour une utilisation immédiate, cependant, juste après avoir été removed de la chambre froide. conteneurs frigorifiques portables sont actuellement utilisés par le personnel de l'armée dans le domaine des fournitures sensibles à la température. Ces mêmes conteneurs peuvent être utilisés pour le transport de biopuce ensemencée.

Une autre limite de cette technologie est que, même si elle est un capteur de toxicité à large bande, il ne répond pas bien, voire pas du tout, à des composés inhibiteurs de la cholinestérase, tels que certains pesticides. Pour combler cette lacune de capacité, le capteur de ECIS est conçu pour être utilisé en conjonction avec un test d'essai de pesticides rapide disponible dans le commerce lors de l'essai des échantillons d'eau afin de fournir à l'utilisateur une plus large gamme de tests de toxicité. Le kit est un dosage enzymatique rapide conçu pour détecter organophosphates et de carbamates pesticides dans les 30 minutes.

Le capteur de ECIS complète le SAQB-PM (Eau Système d'analyse de la qualité - médecine préventive) Système de test de l'eau sur le terrain, actuellement utilisé par le personnel de la médecine préventive militaires pour détecter, arsenIC, le plomb, ou de cyanure dans un échantillon d'eau potable. Bien que le capteur de ECIS n'identifier ce que le contaminant est, il indiquera si certains métaux ou des composés organiques sont présents, ce qui indique que l'eau ne peut pas être propre à la consommation humaine. Les résultats des tests de ECIS sont disponibles au sein d'une heure. Les échantillons d'eau peuvent ensuite être envoyés pour une analyse ultérieure pour l'identification du polluant en cas de résultat positif du test.

Comme décrit ci-dessus, le lecteur de ECIS est conçu pour faire partie d'un système qui comprend un kit ACE enzymatique séparé afin de couvrir un large spectre de détection de contaminants. Ces deux lecteurs sont actuellement conditionnés dans un boîtier robuste pour le transport sur le terrain pour une utilisation sur le terrain par des soldats.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal bovine serum	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%).
Fibronectin, bovine plasma	EMD Millipore Corp.   www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 μg/ml and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips.
L-15 media without L-glutamine	Lonza  www.lonzabioscience.com	12-700F	Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C.
L-15ex powdered media with phenol red	US Biological        www.usbio.net	L1501	Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 ml of water sample for testing in biochips.
PBS, w/o Ca2+ or Mg2+	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-516F	Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks.
Trypsin, EDTA	Lonza  www.lonzabioscience.com	CC-5012	Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks.
T175 culture flasks	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Used for culturing RTgill-W1 cells.
Bleach	Chlorox                                 www.chlorox.com		Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable.
70% ethyl alcohol			For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood.
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1)	American Type Tissue Culture Collection            www.atcc.org	CRL-2523	Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips).
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM	Lonza  www.lonzabioscience.com	35050-061	Store at room temperature.  Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-602E	Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%).
Pharmed BPT tubing	U.S. Plastic Corp.      www.usplastic.com	57317	Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes.
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies	Value Plastics	MTLS210-9	Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips.
20 ml syringes, slip-tip	VWR Scientific      us.vwr.com	BD302831	Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips.
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials	Bottles Jars and Tubes, Inc.   www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing.
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS     medidose.com	IB701	Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips.
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13”	CardinalHealth        www.cardinalhealth.com	90713	Used for autoclaving tubing and fittings and plugs.
Quantos automated powder dispenser	Mettler Toledo       www.mt.com	QB5	Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials.
ECIS reader	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing.
3 x 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags	Uline                 www.uline.com	S-16893	Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials.
Leatherman squirt ps4	Amazon          www.Amazon.com		Used to open powdered media vials.
1 g silica gel desiccant packets	Uline                 www.uline.com	S-3902	Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture.
Sterile 250 or 500 ml Nalgene bottles	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C or E	Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood.
Plugs for biochips	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage at 6 °C.
Drains for ECIS biochips	Nanohmics, Inc.    www.nanohmics.com		Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader.  Allows for excess media to drain from channels during test injections.
Hemocytometer	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips.
Brightfield microscope w/ 10X objective	Leitz Labovert		Any brightfield microscope is acceptable.
Class II biological safety cabinet			Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable.
Microcentrifuge tubes, 0.6 ml	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Holds 1 ml of cell suspension prior to counting cells.
Slip 10 cc red syringes	Procedure Products, Inc.       www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Withdraws 9 ml of test water sample and used to inject sample into biochip.
Slip 10 cc blue syringes	Procedure Products, Inc.       www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Withdraws 9 ml of control water sample and used to inject sample into biochip.
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps	SKS Bottle & Packaging, Inc.        www.sks-bottle.com	0605-30	Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 ml of water sample for testing.
50 ml sterile conical polypropylene centrifuge tubes	Fisher Scientific     www.fishersci.com	12-565-269	Used to hold 40 ml aliquots of 10 μg/ml fibronectin at -20 °C.
NIDS ACE Acetylcholinesterase Inhibitor Detection Test	ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com	ACE-400	Sensor designed for the rapid detection of pesticides in drinking water