אפיון איכותי של השבר מימית מ הידרותרמיות עיבוי של אצות באמצעות גז כרומטוגרפיה 2D עם זמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה

Summary

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Abstract

גז כרומטוגרפיה דו מימדי בשילוב עם זמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה הוא כלי רב עוצמה לזיהוי וכימות רכיבים כימיים תערובות מורכבות. הוא משמש לעתים קרובות כדי לנתח בנזין, דלק סילוני, סולר, ביו-דיזל השבר האורגני של ביו-גולמי / ביו-שמן. ברוב הניתוחים הללו, הממד של הפרדה הראשונה הוא קוטבי, ואחריו הפרדת קוטב. שהברים מהימיים של ביו-גולמי דגימות מימיות אחרות מייצור דלק ביולוגי נבחנו עם שילובי טור דומים. עם זאת, טכניקות הכנת מדגם כגון derivatization, חילוץ ממס, והפקה מוצק שלב היו נחוצות לפני הניתוח. במחקר זה, שברים מימיים המתקבלים ההתנזלות הידרותרמיות של אצות התאפיינו גז כרומטוגרפיה דו ממדים בשילוב עם ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסה ללא טכניקות הכנת מדגם לפני באמצעות פרדת קוטב בממד הראשון ואחריועל ידי פרדה קוטבית של השני. דו ממדי מגרשים מניתוח זה הושוו לאלו שהושגו מתצורת הטור המסורתית יותר. תוצאות משלב האפיון איכותי של שברים מהימיים של ביו-גולמי אצות הם דנו בפירוט. היתרונות של שימוש פרדת קוטב ואחריו הפרדה הלא קוטבית לאפיון של חומרים אורגניים בדגימות מימיות על ידי גז כרומטוגרפיה דו ממדים בשילוב עם ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסה מודגשות.

Introduction

צמיחה יציבה בביקוש לדלקים נוזליים, משאבי דלק מאובנים סופיים, אי ודאות של אספקת דלק מאובנים, וחשש הריכוז גדל וההולך של גזי חממה באטמוספרה גדלה מודעות עולמיות עבור משאבים מתחדשים ^1. אנרגיה סולארית (כולל photovoltaics ושמש-תרמית), אנרגית רוח, אנרגית מים, אנרגיה גיאותרמית, ביומסה הן מהמקורות המתחדשים העיקריים שעלולים להחליף נגזרות מאובנים אנרגיה ^2. מבין אלה, ביומסה היא משאב אנרגיה חלופית רק מבוסס פחמן לייצור דלקים לתחבורה נוזליים וכימיקלים בעלי ערך גבוה ^3. ביומסה כוללת כל חומר אורגני כגון משאבי יער, שאריות חקלאיות, אצות, זרעי שמן, פסולת מוצקה עירונית, פסולת תעשייתית עתיר פחמן (למשל מ תעשיית עיסת נייר או מעיבוד מזון) ^1. ביומסה מסווג לשתי קטגוריות רחבות: חומר זינה lignocellulosic והלא עֵצִי מבוסס על comמאפיינים מיקומית. ביומסה Lignocellulosic מורכבת פחמימות ליגנין, בעוד שאינה עֵצִי יש חומר זינה חלבונים, פחמימות ושומנים / שמנים ^4. חומר זינה Lignocellulosic, המופקים מצמחים יבשתי, יכול רק לספק 30% של דלק נוזלי הנוכחי (בנזין, דלק סילוני, וסולר) דרישה אם מעובדות בר קיימא וקצרו ^5,6. לפיכך, אי-עֵצִי מיקרואורגניזמים ימיים, כגון microalgae ופטריות, הם חומר זינה הפוטנציאל נחשב לייצור דלקים נוזליים מתחדשים כדי להשלים משאבים lignocellulosic.

יש microalgae חומר זינה פוטנציאל לספק דלקים לתחבורה נוזלי הנוכחי לדרוש ^7,8. יש אצות יתרונות רבים: פריון אזורי גבוהה ^8, היכולת לגדול באיכות נמוכה, מליחים, או מי ים ^9, ואת היכולת לצבור טריגליצרידים או פחמימנים אנרגיה צפופה ^7,8. ייזל הידרותרמיות (HTL) הוא שותף קיימא וניתן להרחבהnversion תהליך אשר מנצל מים הקשורים באופן טבעי עם חומר זינה אצות או מימיים ^10,11. זהו תהליך תרם-כימי עם טמפרטורות הפעלה של לחצי 250-400 מעלות צלזיוס ותפעוליות של 10-25 מגפ"ס המייצר מוצר נוזלי, או ביו-גולמי, אשר ניתן לשדרג לתוך מניית תערובת דלק. ביו-גולמי המופק HTL של אצות יש להבחין ו להפרדה בקלות שברים אורגניים מימיים. השבר האורגני של-גולמי ביו ניתן להמיר ביעילות לתוך מניית תערובת זיקוק מוכנה באמצעות קטליטי הדר בטיפול תהליכים ^11. השבר המימי של-גולמי ביו מכיל ~ 30% של הווה פחמן סך זינת האצות. למרות אלפי תרכובות זוהו בזרם מימית HTL, שברים השולט מורכב מחמצן משקל מולקולרי נמוך (כולל חומצות, כהלים, קטונים, ו אלדהידים) שהוקמה על ידי השפלה של פחמימות ושומנים, ו heterocyclics חנקן (כולל pyrroles, pyridines , pyrazines, ו imidazoles) נגזר פירוק חלבון ^12. מחקרים על ניצול השבר המימי לשפר כלכלת תהליך כוללת וכן קיים הם מתמשכים. גז סינתזה ניתן לייצר את החלק היחסי המימי של ביו-גולמי אצות באמצעות גיזוז הידרותרמיות קטליטי ^{10,13, 14.} לחלופין, חומרים אורגניים בתהליך של השבריר המימי גם ניתן להמיר קטליטית כדי תוספי דלק וכימיקלים מיוחדים. מחקר על אופטימיזציה מחקרי הקרנת גיזוז זרז הידרותרמיות קטליטי לגיור של חומרים אורגניים בתהליך של השלב הנוזלי המימית מתנהל כיום במעבדה הלאומית מערב האוקיינוס ​​השקט (PNNL). עבור עבודה זו, איכותי וכן אפיון כמותי של השבר המימי של ביו-גולמי אצות נדרש. מאז השבר המימי של ביו-גולמי אצות נחשב זרם פסולת, יש מעט מאוד מחקרים שנתחו את השבר המימי של האצות ביו גולמי ^13,15. יתר על כן, לאחרונהמחקרים הגיעו למסקנה כי הפיכת מים אצים HTL זה לתוך-מוצרי ביו בעלי ערך גבוה תשפר את קיימת כמו גם כלכלה של HTL ביו מבוסס-זיקוק ^11. לכן, מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה לאפיון איכותי של השבר המימי של ביו-גולמי המתקבל HTL של אצות על ידי גז כרומטוגרפיה דו ממדים בשילוב עם ספקטרומטריית מסת הזמן של טיסה (GC × GC-TOF-MS).

GC × GC-TOF-MS הוא שיטת אנליטית chromatographic המבטיחה ביותר כדי להגדיל את הרזולוציה (או פרדה של תרכובות כימיות במדגם), קיבולת שיא (מספר כלומר של פסגות נפתרו), יחס אות לרעש (לזיהוי של תרכובות כימיות בסבירות גבוהה), ועל מנת למנוע שיתוף elution של תרכובות כימיות ^16. על מנת למקסם את החלטה, קיבולת שיא, ואת אות יחס רעש, שתי עמודות GC עם שלבים נייחים שונים מחוברות בסדרה באמצעות ג קיבועonnector או מיקרו-איחוד ¹⁷ (ראה איור 1 שהינה דיאגרמה מלבנית של GC × מערכת GC-TOF-MS השתמשו במחקר זה). אפנן ממוקם בין המחבר-fit העיתונות ועמודות משניות מלכודת, ולמקד, מחדש להזריק הקולחים מהעמודה העיקרית לתוך הטור מהשני ^18. אפנון מתרחש על העמודה המשנית במחקר הנוכחי כפי שמוצג באיור 1. העמודה המשנית אז מחוברת TOF-MS באמצעות הרכבת קו העברה.

GC × GC-TOF-MS שמש בעבר עבור האיכותיים וכן ניתוח כמותי של דגימות אורגניות כגון נפט גולמי ^16,19, בנזין, סילון-דלק, דיזל, ביו-דיזל, וחלקיק האורגני של ביו-דלק ^{20 22} המופקים-כימיים תרמו וכן המרה התרמו-קטליטי מעבדת ^23,24. לאפיון של דגימות האורגניות אלה ב- GC × מכשירי GC-TOF-MS, טור קוטבי ארוך wכפי שמוצג כמו הטור הראשי, בעוד טור קוטבי קצר שמש בעמודה המשנית. תצורת הטור השמרנית הזו פותרת תרכובות כימיות על בסיס הבדלים בתנודתיות על הממד הראשון, ואחריו קוטביות בממד השני ^18. דגימות מימיות או מים מתהליכים ביולוגיים, עיבוד מזון, ופסולת סביבתית התאפיינו גם באמצעות העיקרית דומות / והגדרות עמודות משתי לאחר המדגם עבר הכנה שלבי ^17,25-30. טכניקות להכנת דגימות כגון derivatization, מיצוי מוצק שלב, והפקת ממיס אורגני כולם נוצלו לפני GC × ניתוח GC-TOF-MS ^{17,27-29,31,32.} טכניקות אלה נועדו להקטין את הקוטביות של תרכובות במדגם לניתוח משתמשת בתצורת טור קונבנציונלית ^33. אסטרטגיה חלופית הועסקה במחקר זה מבוסס על הטבע של המדגם (כאן תרכובות אורגניות קוטב במים)ניצול תצורת העמודה משנית / העיקרית ההפוכה GC × ניתוח GC-TOF-MS. מאז השבר המימי של ביו-גולמי ההופק HTL יש תרכובות קוטב ^13, שילוב עמודה של עמודת קוטב ראשונית טור קוטבי משני שמש GC × GC-TOF-MS בלי שום הכנת מדגם במעלה זרם. שילוב עמודה ראשי / משני זה פותר תרכובות כימיות על בסיס הבדלים בקוטביות על הממד הראשון, ואחריו התנודתיות בממד השני. שיטות אנליטיות מוגבלות קיימות בספרות לאפיון של דגימות מימיות באמצעות כרומטוגרפיה גז דו-ממדי ללא עיבוד המדגם לפני ^15.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את התרכובות הכימיות הנוכחיות בשבריר המימי של-גולמי ביו אצות. כדי להשיג מטרה זו, GC × שיטת רכישת נתוני GC-TOF-MS פותח עם שילוב טור של טור קוטבי (חסודהאר"י) × קוטבי (משני). Klenn et al. (2015) הציעו כי הגדלת אורך הטור הראשי (במיוחד 60 מ 'עמודות GC) והורדתי טמפרטורת קיזוז בעמודה המשנית ביחס לעמודת בחירות המוקדמת הוא למקסם את יכולת שיא והרזולוציה ^16-18. לכן, 60 מ 'טור עיקרי ו -5 ° C לקזז טמפרטורה של העמודה המשנית ביחס לעמודה העיקרי שמשו במחקר זה. תקופת האפנון האופטימלית נקבעת בעקבות פרוטוקול המתוארים במחקר זה (ראה סעיף 4). שיעור הרמפה האופטימלי של טמפרטורת עמודת GC נקבע על ידי שיטת ניסוי וטעייה, והוא דומה הערך המומלץ בספרות ^16-18. כדי לדון את היתרונות של שילוב הטור הזה עבור דגימות מימיות, נתחנו HTL דגימות אצות מים עם שילוב הטור הקונבנציונלי של הלא קוטבי × קוטב. פרמטרי הפעלה הציעו בספרות הועסקו לניתוח מהימישבריר של ביו-גולמי אצות עם שילוב טור קוטבי קוטבי × ^18.

Protocol

לדוגמא הכנה 1.

1. ליצור זרם מוצר מימי / אורגני מעורב באמצעות HTL זרימה הרציף של אצות על פי תכנון כור ההליך הניסיון למצוא בספרות ^10,11.
2. השתמש מפריד הכביד כדי להפריד את זרם המוצר לתוך שלב מימי ופאזה אורגנית.
3. מסנן 10 מ"ל של שלב מימית HTL באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ולאחסן במקרר שמרו על 4 מעלות צלזיוס למשך GC × ניתוח GC-TOF-MS.

2. רכיבי Instrument

1. השתמש כרומטוגרפיה גזית (GC) המצויד בשלב כפול מרובע-סילון קירור מבוססי אפנן והשעה של הטיסה (TOF) ספקטרומטר מסה (MS) עבור ניסויים אלו.
2. הגדר את סמפלר האוטומטי להזריק 1 μl של כל דגימה או תקן לתוך GC. השתמש עיצוב בלוק אקראי של מדגם וזריקות סטנדרטיות עבור הרצף האוטומטי סמפלר כמתואר בספרות ^13. randomiעיצוב בלוק zed הוא נפוץ מחקרים כמותיים כדי לשלוט על פעולת המכשיר. המעבדה שלנו מנצלת את העיצוב אפילו שגרתי במחקרים השוואתיים כדי לוודא פעילות מכשיר.
3. חבר את הטור הראשי והמשני באמצעות מחבר חזק בעיתונות לפני אפנן. ודא ששני הקצוות של שני עמודים ראשיים ומשניים נחתכים ישר ללא קצוות חדים לפני חיבור למחבר העיתונות חזק.
4. מניח טבעת חזוק על עמודת GC ולאחר מכן חבר בעמודה ראשית אל מזרק GC כך 5 מ"מ של טור הוא בתוך המזרק.
5. ודא כי אוניית זכוכית, אוניית טפלון O-Ring ואת המחיצה עבור מזרק GC הוא חדשים ללא זיהום.
6. השתמש 1/16 x ferrules 0.5 מ"מ מזהה העברת קו כדי לחבר את קו העמודה והעברת משנית. מניח חלק מ 0.2 של הטור המשני בקו ההעברה.
7. ודא כי חלק 0.1 מ 'של העמודה המשנית אפנן.
8. השתמש הליום טוהר ultrahighגז גז מוביל עבור GC בקצב זרימה של ^-1 1.5 מיליליטר דקות.
9. ודא שיש חנקן נוזלי מספיק דיואר אשר משמש קירור אפנן. רמת החנקן הנוזל דיואר ניתן לחזות באמצעות מד לחץ מחובר לשקע שלה. קריאת 69 kPa של מד הלחץ עולה כי דיואר מלא, בעוד 0 kPa עולה, כי היא ריקה.

3. פרוטוקולים לפני ניתוח דוגמאות

1. ודא שאין נזילות מרכזיות המכשיר. אם קריאת מד ואקום של TOF-MS גבוה מ 2.7 × 10 ^-5 אבא עבור 1.5 מיליליטר דקות ^-1 GC קצב זרימת טור, זה מצביע על דליפה מרכזית במערכת.
2. הגדרת בקרת איכות (QC) שיטה ולהפעיל המובנית פרוטוקול 'התאמות מערכת הרכישה "על מנת להשיג תגובה האות המרבי באמצעות פרוטוקול של היצרן.
3. הפעל המובנית הפרוטוקולים "אופטימיזציה מכשיר 'של שיטת QC, בסדרה - filamמוקד אף אוזן גרון, מוקד יון אופטי ובדיקות כיול המוניות באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ודא כי בדיקת כיול המסה עוברת. שיטת QC הדבר מבטיחה כי כל פרמטרי החומרה של המכשיר הם ברמה אופטימלית.
4. בצע "בדיקת דליפה" באמצעות הפרוטוקול של היצרן. לנתח באופן אוטומטי מייצר דוח בדיקת דליפה. ודא כי הריכוז היחסי של 28 (N _2), 32 (O ₂₎ ו -18 (לחות) יונים חייבים להיות מתחת פחות מ -10%, 3% ו -5% של ספקטרה מונית תקן הפנימית של 69 יון, בהתאמה.
5. כוון את TOF-MS באמצעות פרוטוקול של היצרן.
6. שיטת בקרת איכות הפעל וכן TOF-MS מנגינה הפרוטוקול לפני ואחרי בדיקת דליפה וגם תוך ניתוח דגימות ותקנים.

4. פרוטוקול לקביעת תקופת אפנון אופטימום של אפנן

1. באופן שרירותי בחר תקופת אפנון ארוך (למשל 10 שניות או 13 שניות). להזריק מדגם כמתואר 2.2.
2. זהה את זמן השמירה בממד השני של העלילה מתאר שלאחריו ולא שיאים elutes. בחר זמן השמירה הממד השני מזוהה בתקופה אפנון אופטימלית. איור 2 בבירור להבהיר את הזיהוי של זמן השמירה בממד השני של העלילה מתאר.
3. להגדיל את תקופת אפנון בשימוש בשלב 4.1 ולבצע את הניתוח שוב אם "לעטוף" הוא ציין ^18. עוטפים סביב תופעות מתרחשות אם הפסגות בממד השני elutes מתחת לקו הבסיס של הממד הראשון. דוגמא עלילה תאר עבור 'מעטפת' מוצגת מידע משלים איור 3.
4. חזור על שלבים 4.2 ו -4.3 עד ערך אופטימלי נקבע.

5. פרמטרים הניסיונות של הגדרת Instrument

1. התקן טור נימים קוטבית (60 MX 0.25 מ"מ x 0.5 מיקרומטר עובי סרט) כטור העיקרי וכן הלא קוטבי (2.3 MX 0.25 מ"מ x 0.5 מיקרומטר עובי סרט) קפילהטור ר"י כמו הטור המשני. אופה שני עמודות חדשות הראשיות ומשניות של לפחות 2 שעות כדי להסיר כמויות זעירות של לחות, אוויר ומזהמים הקשורים עמודות GC חדשות.
2. שימוש בגז הליום טוהר ultrahigh כגז מוביל GC בקצב זרימה של ^-1 1.5 מיליליטר דקות.
3. הגדר את מזרק GC לטמפרטורה של 260 מעלות צלזיוס ביחס פיצול של 1: 250.
4. להעסיק את תכנית הטמפרטורה הבאה עבור העמודה העיקרית: טמפרטורה קבועה של 40 מעלות צלזיוס במשך 0.2 דקות ולאחריה רמפת טמפרטורה ל 260 מעלות צלזיוס ב 5 מעלות צלזיוס דקות ^-1, ואחריו על טמפרטורה קבועה של 260 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
5. שמירה על C ° אפנן טמפרטורת 5 גבוה יותר מזה של טור מהשני וטמפרטורת העמודה המשנית ב 5 מעלות צלזיוס גבוה יותר מזה של הטור העיקרי.
6. השתמש תקופת אפנון אופטימלית של 4 שניות ל -0.8 שניות של דופק חם ו -1.2 שניות של דופק קר. ערך זה נקבע על בסיס הפרוטוקול המתואר כתיון 4.
7. טמפרטורת קו העברת גדר עד 270 מעלות צלזיוס.
8. לכוון את זמן ההשהיה הרכישה או עיכוב ממס 0 שניות.
9. הגדר את טווח נמוך וגבוה של m / z כמו 35 ו -800, בהתאמה.
10. הגדר את קצב רכישת גלאי MS ב 400 ספקטרה / sec.
11. שמירה על מתח גלאי MS ב 150 V גבוה מהשווי המותאם.
12. לשמור על טמפרטורת מקור יון MS ב 225 מעלות צלזיוס.

6. ניתוח נתונים

1. לבצע עיבוד נתונים באמצעות התוכנה שסופקה על ידי יצרן המכשיר.
2. בחר את המשימות הבאות בשיטת ניתוח נתונים - בסיס Compute, למצוא פסגות מעל חיפוש הבסיס, הספרייה ולחשב הם / גובה.
3. עקוב אחר הבסיס באמצעות קובץ הנתונים. זן לקזז בסיס כמו 0.5.
   זן רוחב שיא צפוי של 15 שניות בממד הראשון 0.15 שניות בממד השני.
4. אות לרעש נקבע יחס כמו 5,000 וערכי דמיון של> 850 עבור מזוההfication של תרכובות.
5. בחר ספרייה ספקטרלי המונית זמינה מסחרי לזהות תרכובות כימיות נוכח דגימות ולהגדיר את מצב חיפוש הספרייה להעביר.
6. לעבד את קבצי נתונים באמצעות שיטת ניתוח נתונים זה באמצעות הפרוטוקול של היצרן. זה דורש לפחות 1 hr לעבד קובץ נתונים.

תוצאות

הכרומתוגרמה יון כוללת (TIC) שהתקבלה עבור החלק מהימי של האצות ביו גולמי נתח עם שילוב טור של × הקוטב הלא קוטבי מוצג באיור 4. פעמי שימור גורם דמיון או תואם לערכים של תרכובות שזוהו על ידי חיפוש נגד אזרח המכון לתקנים וטכנולוגיה (NIST) הספרייה נספר

Discussion

תוצאות בבירור להמחיש את היכולת של שילוב הטור של קוטב × קוטבי לפתור תרכובות קוטב נדיפים אור נוכח השבר המימי של ביו-גולמי אצות ללא טכניקות הכנת מדגם לפני. עוקב שיא דרסטי נצפה חומצות אורגניות N-תרכובות תוך שימוש בשילוב הטור הקוטבי הקוטבי ×. עוקב שיא זה לא נצפה על החומרים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GC × GC–TOF/MS	Leco	PEG4D11DLN15	Commercial Pegasus 4D
ChromaTOF version 4.50	Leco		Data analysis software
Rxi-5MS GC column	Restek	13420	2.3 m column was used from this column.
Stabilwax GC column	Restek	10626
HP-5 GC column	Agilent	19091J-416
Stabilwax GC column	Restek	15121
Presstight Connector	Restek	20430
GC injector liner	Restek	23305.5
GC Injector ferrules	Agilent	5181-3323
Non-stick liner O-rings	Agilent	5188-5365
Transfer line ferrules	Restek	20212
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	Chromatography grade
Acetone	Sigma-Aldrich	414689	Chromatography grade
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Chromatography grade
2-butanone	Sigma-Aldrich	360473	Chromatography grade
Propanoic acid	Sigma-Aldrich	402907	Chromatography grade
Butanoic acid	Sigma-Aldrich	19215	Chromatography grade
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Chromatography grade
Pyrazine	Sigma-Aldrich	65693	Chromatography grade
Acetamide	Sigma-Aldrich	695122	Chromatography grade
2,5-pyrrolididione	Sigma-Aldrich	S9381	Chromatography grade
N-methylsuccinimide	Sigma-Aldrich	325384	Chromatography grade
N-(2-hydroxyethyl)succinimide	Sigma-Aldrich	444073	Chromatography grade