הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Summary

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Abstract

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Introduction

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protocol

אֶתִיקָה
כל העבודה בוצעה תחת אישור של בעלי חיים משרד הפנים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בלונדון סקול אוף צער בעלי חיים רפואה היגיינה & Tropical המועצה לביקורת אתיקה. ARRIVE מנחה מלוות בדוח זה.

1. בקטע Vivo של Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

1. הסר מניה cryopreserved (המכונה stabilate) של T. ב. brucei זן GVR35-VSL-2 (זמין פרופ 'ג'ון קלי ב"לונדון סקול אוף להיגיינה ורפואה טרופית & דרך MTA) ⁹ מ חנקן נוזלי ולאפשר לאזן לטמפרטורת החדר. לדלל stabilate עד 2 x 10 ⁴ trypanosomes / מ"ל סליין גלוקוז שנאגרו פוספט סטרילית (PBS-G) pH 8.0 (1 L PBS + 15 גלוקוז גרם) ^10.
   הערה: ט ב. brucei GVR35-VSL-2 הוא לא זיהומיות לבני אדם ודורשים סאפו מורשה מתקנים לבצע ניסויים.
2. inject עכבר CD1 נקבה 20-25 גרם עם 0.2 מ"ל מדולל trypanosomes דרך המסלול הזרקה (IP) עם מחט 25 G. זהו "עכבר התורם". מניחים את העכבר נגוע לתוך חינם פתוגן ספציפי (SPF) כרצונך -cage ולהאכיל.
   הערה: עכברים CD1 הם זן outbred וט ב. זיהומי GVR35 brucei הם מאופיינים היטב זן זה. עם זאת, פרוטוקול זה הוא גם החלים על זנים טהורים או גנטי שונים, אך חשוב לציין כי צבע פרווה עשוי להשפיע על רגישות ההדמיה ^6,9.
3. צג parasitemia היקפי ידי לקיחת דמים. מניחים את העכבר לתוך עוצר פלסטיק ולקחת 5 μl של דם מזנב ידי venepuncture עם 21 G מחט או venesection ומערבבים 1/10 עם אמוניום כלוריד סטרילי 0.85% ל lyse תאי דם אדומים ולאפשר ספירת קל.
4. ספירת הדם המדולל נויבאואר hemocytometer.
   1. טען את הדם המדולל לשני התאים. ספירת הגר המרכזי כולהid של תא אחד לתת trypanosomes n. ריכוז trypanosomes בדם = n x 10 מ"ל ⁴ trypanosomes /, להתאים לכל גורם לדילול ולחשב את הממוצע של שני החדרים.
      הערה: לאחר כ 5-7 ימים לאחר ההדבקה, parasitemia היקפי צריך לעלות מספיק לבצע זיהום בריכוז של 2 x 10 ⁴ trypanosomes / מ"ל.
5. כאשר רמות trypanosome גבוהות מספיק עבור מספר העכברים הנדרשים, עבור לשלב 1.6. רמת parasitemia של 6 x 10 מיליליטר ⁴ trypanosomes / עכבר תורם אחת מספיקה עבור זיהום של 10 עכברים.
   הערה: גדלים קבוצה משמעותית סטטיסטית, n = 6 לכל קבוצת טיפול של עכברים נדרשים ^8. עבור דגמים אחרים של זיהום, חישובי כוח היו צריכים להיות מיושמים כדי לקבוע גדלים לקבוצה מתאימים.
6. מקום עכברים לתוך קופסא חום (ב 28-30 מעלות צלזיוס למשך כ 5-10 דקות) כדי לאפשר את ורידי הזנב להתרחב.כדי לגרום הרדמה מסוף, לנהל 20 מ"ג / iv pentobarbital ק"ג עם מחט 25 G. אשר העכבר הוא מורדם בעדינות על ידי לחיצה לכפות הרגלים כדי להבטיח שאין רפלקס נסיגה.
7. Heparinize מחט 21 G על ידי aliquoting 5 מ"ל הפרין ב 5000 מ"ל / יחידות USP לתוך צינור Bijou ומוצץ פעמיים פנימה והחוצה של מחט מצורף מזרק 1 מ"ל.
8. קח את מזרק 21 G מחט 1 מיליליטר heparinized, ולבצע לנקב לב על העכבר מעבר הרדים ידי החדרת מחט מרכזית מתחת לצלעות (אגל הדם יהיה ברכה בבסיס המחט) ומשוך בעדינות בחזרה על הבוכנה כדי לא להתמוטט לשכת בלב. לאסוף מינימום של 0.7 מ"ל של דם.
9. לדלל דם נגוע לייצר הבידוד של 2 x 10 ⁴ trypanosomes / מ"ל ב PBS-G pH 8.0 כצעד 1.1 לעיל.
   הערה: בשלב זה, הדם הנותרים ניתן cryopreserved לייצר stabilate ידי ערבוב עם גליצרול 8%, 20% ca עוברי חום מומתסרום LF (היי-FCS) ו -72% דם נגוע. לאט להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס באמצעות להקפיא איטי מקפיא מיכל להשיג קצב הקירור של -1 ° C / min, לפני העברת חנקן נוזלי.

2. זיהום של עכברי ניסוי

1. מניחים CD1 עכברות (~ 21-25 גרם) לתוך תיבת חימום חם בעדינות להתרחב ורידים. מניחים את העכברים חימם לתוך איפוק פלסטיק להזריק 0.2 מ"ל הבידוד בדילול לווריד עם מחט 25 G לווריד הזנב, שווה ערך ל -4,000 trypanosomes לכל עכבר. מניח לחץ באזור הזריקה לאחר מכן לעצור את הדימום.
   הערה: זיהום Intraperitoneal הוא ניתוב חוקי של זיהום ויש בו נעשה שימוש במחקרים קודמים ^10, אבל אנחנו מצאנו את זה פחות לשחזור מאשר המסלול תוך ורידי.
2. בחר באקראי עכברים בכלוב נגועים בקבוצות של 3 בכלובים-פרקו SPF. כביקורת, להזריק עכברות CD1 עם טפיל שאינו bioluminescent סוג בר, ט ב. brucei GVR35 (n =3).
3. לפקח על הזיהום באמצעות מיקרוסקופיה סרטי דם
   1. דם ספוט 5 μl מן venepuncture או venesection לשקופית כוס ולבצע כתם דם (באמצעות שקופיות כוס שניות בעדינות את טיפת הדם על פני השקופית כדי להפיק סרט דק). אפשר שקופיות לייבוש באוויר.
   2. תקן את כתם דם עם 100% מתנול ואת הכתם עם Giemsa במשך 10 דקות לפני השטיפה עם DH ₂ O ולאפשר לייבוש באוויר. תחת מטרה 100x לספור את מספר trypanosomes ב 10 שדות הראייה (FOV).
      הערה: צילומי דם מתבצעים לצד הדמיה לא פולשנית כולה חיה מוקדם ככל שלאחר זיהום יום אחד. כאשר עיבוד מספר בעלי חיים, בשיטה זו של quantitation trypanosome עדיפה על פני ספירת hemocytometer כפי הדגימות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ומנה מאוחר יותר.

3. פליטת אור הדמיה כדי לעקוב אחר זיהום

הערה: כדי לפקח על הזיהום, כולו עניםניתן להשתמש הדמיה אל פולשני.

1. הכן פתרון המניות של D-luciferin, המצע בלוציפראז גחלילית, ב בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) 30 מ"ג / מ"ל. סנן לעקר ולהקפיא aliquots ב -20 ° C.
   הערה: D-Luciferin הוא אור רגיש, ולכן להגן עליו מפני האור על ידי לפפה aliquots בנייר כסף. אין להקפיא להפשיר luciferin שוב ושוב כפי שהוא יכול להשפיע על הפעילות ^11.
2. לחמם aliquot של D-luciferin לטמפרטורת החדר. הסר כל עכבר מהכלוב (כולל שליטה עכברים נגועים בזן טפיל סוג בר nonbioluminescent) ולהזריק 150 מ"ג / ק"ג של D-luciferin חיממה (מדולל DPBS) intraperitoneally עם מחט 25 G. מניחים את העכברים לתוך תא isofluorane כ 5 דקות כדי להשרות הרדמה עם 2% isofluorane / O ₂ תערובת של 2.5 ליטר / דקה.
   הערה: העכברים להיות נייחים כשהם נמצאים תחת הרדמה. עבור תרמי משמש כאן, 3 עכברים ניתן לעבד בכל פעם. אם עכברים הם anesthetized עבור יותר מ -30 דקות, משחה דמעה מלאכותית עיניים יכול להיות מיושם כדי למנוע את העיניים של העכברים מהתייבשות.
3. עבור תרמי המתואר כאן, לפתוח את התוכנה לאתחל את המכשיר באמצעות תוכנה לפי הוראות היצרן. לרכוש תמונות הפעם הגיעה לטמפרטורת מצלמת צלחת מחוממת.
   הערה: מכשיר זה אינו בדרך כלל כבוי, המאפשר את המכונה כדי לבצע כיולי רקע לילה. במקרה זה צריך להפעיל מחדש, זה חייב להפעיל בדיקת כיול ראשון.
4. מניחים את העכברים מורדם לתוך תרמי (ראה 3.5). השתמש מפרידי שחור גדולים בין העכברים כדי למזער לדמם דרך של כל אות bioluminescent בהירה. עכברי תמונה באמצעות סט של פעמי חשיפה; 1, 3, 10, 30, 60 ו -180 שניות, עם binning בינוני, 1 f / stop מסנן פתוח, ותחום E נוף (12.5 x 12.5 ס"מ ^2).
   ההערה: עכברי השליטה נגועים טפילי GVR35 nonbioluminescent סוג הבר לספק backgrערך פליטת אור ound. מניסוי קינטיקה luciferin (איור 6) עם מודל זה, מצאנו כי פסגות אות פליטת האור ב -10 דקות לפרסם ממשל וההדמיה לוקחת כ 5 דקות עבור 3 עכברים. קח זמנים זה בחשבון בעת ​​הרדמה והדמיה העכברים.
5. כדי להבטיח הדמיה יסודית של העכברים, לסובב שתיתן להם תמונת גחון, הגבה ו לרוחב. לשמור על עקביות סדר אוריינטציה הדמיה בין בעלי חיים רציפים.
6. לאחר הדמיה, לאפשר עכברים להתאושש מן ההרדמה בהשגחה לפני שחזר כלוב SPF.
7. המשך הדמיה עכברים כל 7 ימים עד יום 21 לאחר הפגיעה. לא צריך להיות עלייה מתמדת אות פליטת אור על החיה כולה.
8. בשעה D21, תמונה ודם הסרט העכברים כמתואר לעיל, והמנה עכברים עם 40 מ"ג / ק"ג diminazene aceturate intraperitoneally. תרופה זו תנקה את parasitemia ההיקפי אבל לא לחצות את הדם-braiמחסום n, ולכן מאפשרת ויזואליזציה טובה יותר של זיהום במערכת העצבים המרכזית.
   הערה: aceturate Diminazene הוא תרופה ומבוססת המשמשת לטיפול trypanosomiasis חי בשלב מוקדם.
9. המשך הדמיה וניטור ב D28 ו D35.

4. אישור CNS זיהום

1. בשעת D35, עכברי תמונה כמפורט לעיל (שלבי 3.1-3.4).
2. לאחר הדמיה, לאפשר עכברים להתאושש מעכברי הרדמה, ולגרום לדימום מחודש כמפורט צעד 1.6-1.8, איסוף דם לצורך ניתוח נוסף.
3. בעקבות לנקב לב, perfuse עכברים עם 20 מ"ל PBS (אופציונלי: להוסיף 3 מ"ג / מ"ל ​​של luciferin לפתרון זלוף) דרך הלב כדי לנקות דם מן האיברים לחדש תווית luciferin שאולי פינה מאזור המוח על מרווח זמן משלב 4.1.
4. הוצא בעדינות את המוח, באמצעות מספריים מעוקלים, חיתוך מהבסיס סביב היקף הגולגולת, מרים את החלק העליון של הגולגולת, כדי לאפשר למוחשירים החוצה בזהירות עם מלקחיים מעוקלים.
5. מניחים את המוח נכרת על קטע של פלסטיק שחור פיפטה 50 μl של 15 מ"ג / מ"ל ​​luciferin מעל האיבר לפני הדמיה, כדי להבטיח luciferin נאותה נוספה המוח נכרת. תמונה תוך שימוש בהגדרות כנ"ל. זה יהיה להדגים לוקליזציה של הזיהום ההמיספרות של המוח.
   הערה: כימות Downstream של parasitemia על המוח הניכר יכולה להתבצע על ידי qPCR כפי שתוארו לעיל ^8. יישומים במורד הזרם חלופיים אחרים עשויים לכלול היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה לזהות טפילים ברקמת המוח לאחר קיבעון.

5. כימות של הדמיה פליטת אור

הערה: פליטת אור ניתן לכמת באמצעות האזור של עניין (ROI) עם תוכנת ההדמיה ותיקן עבור פליטת אור רקע.

1. באמצעות כלי ROI, ליצור ROI מלבני עבור quantitation כל חיהnd למקמו מעל תמונת העכבר לכסות קצה האף כדי בבסיס הזנב של העכבר. השתמש באותו בתיבת הגודל עבור כל בעל חיים וכל נקודת זמן. כאשר מסתכלים על ההחזר על ההשקעה עבור המוח, להשתמש ROI חוזר באותה דרך, מיקומה על אזור הראש העכבר בתמונה.
2. אם תרצה, להתאים תמונות להופיע באותו ספקטרום עבור ייצוג חזותי של זיהום.
   הערה: התוכנה בה משתמשת כאן מייצרת מפת צבע עבור כל תמונה המותאמת באופן אוטומטי עבור ספירת פוטון מינימום ומקסימום. כדי לאפשר השוואה ויזואלית בין סדרה של תמונות, את סולם הצבעים חייב להיות מוגדר אותם הערכים עבור כל התמונות.
   1. שימוש בתמונה עם פליטת האור הגבוהה ביותר ואת הכרטיסייה 'תמונה להתאים' על לוח הכלי, בחר סולם לוגריתמים ו למינימום סקאלת צבעים מתאים ומקסימום (נקבע באופן אמפירי). החל סולם זה על כל התמונות לאורך הניסוי.

תוצאות

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב התקדמות המחלה בעקבות זיהום של עכברים עם ט ב. brucei, מודל trypanosomiasis אדם אפריקני. איור 1 מציג את ציר הזמן של פרוטוקול הניסוי, הוכיח את לוח הזמנים עבור טיפול שלבים והדמיה. איור 2 הדגים שדה טיפוסי של נוף כתם ?...

Discussion

ההתפתחות המינית של ט bioluminescent ב. זן brucei GVR35 מאפשר הדמיה של זיהום trypanosome מן המוקדמות בשלב מאוחר. מודלי זיהום קודמים לא הצליחו לזהות בשלב מאוחר, כאשר טפילים הם במוח, בזמן אמת במיקרוסקופ סרט דם, ודרשו קולינג והסרת המוח של עכברים הנגועים לקבוע טפיל נטל ^12....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml Syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25 G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21 G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model