Bioluminescence Imaging pour détecter Late Stage infection de la trypanosomiase africaine

Résumé

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Résumé

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.

Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.

Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

Introduction

Human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, is caused by the vector-borne protozoan parasites of the Trypanosoma brucei spp¹. Estimated numbers of current cases is fewer than 7 thousand every year with almost 70 million people exposed to the risk of the parasite infection within the African continent. The disease, which is most often lethal if left untreated, comprises an early hemolymphatic stage where parasites are present in the blood, progressing to the late stage when parasites invade the central nervous system (CNS) and are no longer susceptible to treatment by early stage trypanosomal drugs². The current drug therapies for late-stage HAT have both complex, prolonged, treatment regimens and severe adverse effects as well as reported resistance, therefore research into new drug therapies is imperative^3,4.

The study of late-stage human African trypanosomiasis (HAT) within traditional mouse models is lengthy and complex, with the removal of brain tissue being required to monitor parasitic burden⁵. The animal infective strain T. b. brucei is used as the study model of trypanosomiasis with the late stage appearing 21 days post infection (dpi). To monitor the wild type nonbioluminescent parasite infection in the mouse model, peripheral blood films or quantitative PCR are the only methods to determine parasite burden. For parasite burden in the brain, the mouse needs to be culled, brain excised and qPCR carried out on tissues, making it impossible to track parasites through multiple time points in the late stage infection. This results in the inability to follow real-time infections within the central nervous system (CNS).

In vivo bioluminescence imaging (BLI) can provide highly sensitive, non-invasive detection of parasite dissemination and disease progression in a mouse model that can be followed in a single animal for the entirety of the experiment⁶. BLI is based on the emission of light in the visible spectrum produced by a luciferase-catalyzed reaction. The emitted photons are then detected by a charge coupled device (CCD) camera⁷. For this purpose, the pathogen is genetically modified to express a luciferase protein and the substrate, luciferin, is introduced at time points of interest by injection. The main advantage of this method is the ability to carry out longitudinal studies, in which the same animal can be imaged several times with minimal adverse effects. The acquired bioluminescence signal can be quantified, thus indicating the pathogen burden.

The optimization and validation of a red-shifted bioluminescent T. b. brucei has enabled the investigation of the late stage infection through non-invasive procedures, detecting parasites earlier than blood film microscopy and greatly reducing the time, cost and numbers of animals needed to study CNS infection and drug screening in late-stage trypanosomiasis^8,9. In this protocol we demonstrate infection of mice with bioluminescent trypanosomes and how to then visualize the parasites in vivo for quantification of disease progression and CNS penetration.

Protocole

Éthique
Tous les travaux ont été effectués en vertu de l'approbation du Royaume-Uni Home Office Animaux (Procédures scientifiques) de la Loi de 1986 et la London School of Hygiene and Tropical Medicine Bien-être des animaux et Comité d'éthique. ARRIVÉE directive sont suivies dans le présent rapport.

1. In Vivo Passage de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

1. Retirer un stock cryoconservés (stabilat appelé) de T. b. souche brucei GVR35-VSL-2 (disponible chez le professeur John Kelly à la London School of Hygiene & Tropical Medicine par MTA) ⁹ à partir de l' azote liquide et laisser équilibrer à la température ambiante. Diluer stabilat à 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml dans du tampon phosphate stérile de glucose (PBS-G) pH 8,0 (1 litre de PBS + 15 g de glucose) ^10.
   Note: T. b. brucei GVR35-VSL-2 est non-infectieux pour l' homme et exige SAPO autorisé des installations pour mener à bien des expériences.
2. Inject 20-25 g femelle CD1 souris avec 0,2 ml dilué trypanosomes par voie intrapéritonéale (IP) avec une aiguille de 25 G. Ceci est la "souris donneuse". Placez la souris infectée dans un spécifique Pathogen gratuit (SPF) -cage et alimentation ad libitum.
   Remarque: les souris CD1 sont une souche consanguine et T. b. infections brucei GVR35 sont bien caractérisés dans cette souche. Cependant, ce protocole est également applicable aux souches consanguines ou génétiquement modifiés, mais il est important de noter que la couleur de la fourrure peut avoir un impact sur ​​la sensibilité de l' imagerie ^6,9.
3. Surveiller parasitémie périphérique par prélèvement de sang. Placez la souris dans un restrainer plastique et prendre 5 pi de sang de la queue par ponction veineuse avec 21 aiguilles G ou saignées et mélanger 1/10 avec 0,85% de chlorure d'ammonium stérile pour lyser les globules rouges et de permettre un meilleur comptage.
4. Comptez le sang dilué dans un Neubauer hémocytomètre.
   1. Chargez le sang dilué dans les deux chambres. Comptez tout le gr centralid d'une chambre pour donner n trypanosomes. Concentration de trypanosomes dans le sang = n x 10 ⁴ trypanosomes / ml, ajuster pour tout facteur de dilution et de calculer la moyenne des deux chambres.
      Remarque: Après environ 5-7 jours après l'infection, la parasitémie périphérique devrait augmenter suffisamment pour mener à bien une infection à une concentration de 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml.
5. Lorsque les niveaux de trypanosomes sont suffisants pour le nombre de souris nécessaires élevé, passer à l'étape 1.6. Un niveau de parasitémie de 6 x 10 ⁴ trypanosomes / ml dans une souris donneuse est suffisante pour l' infection de 10 souris.
   Remarque: Pour des tailles de groupes statistiquement significatifs, n = 6 pour chaque groupe de souris de traitement sont nécessaires ^8. Pour les autres modèles d'infection, il faudrait appliquer pour déterminer la taille des groupes appropriés calculs de puissance.
6. Placez la souris dans une boîte de chaleur (à 28-30 ° C pendant environ 5-10 min) pour permettre aux veines de la queue à se dilater.Pour induire une anesthésie terminale, administrer 20 mg / kg iv pentobarbital avec une aiguille 25 G. Confirmer la souris est anesthésiée en appuyant doucement les coussinets pour assurer qu'il n'y a aucun retrait réflexe.
7. Hépariner une aiguille 21 G par aliquotage 5 ml d'héparine à 5000 unités USP / ml dans un tube bijou et sucer deux fois dans et hors de l'aiguille reliée à une seringue de 1 ml.
8. Prenez le héparinisé 21 G aiguille et seringue de 1 ml, et d'effectuer une ponction cardiaque sur la souris de passage anesthésié par l'insertion de l'aiguille centrale en dessous de la cage thoracique (un cordon de sang commun dans la base de l'aiguille) et tirez doucement sur le piston afin de ne pas replier l'enceinte du coeur. Recueillir un minimum de 0,7 ml de sang.
9. Diluer sang infecté pour produire un inoculum de 2 x 10 ⁴ trypanosomes / ml dans du PBS-G pH 8,0 que l' étape 1.1 ci - dessus.
   Remarque: À ce stade, le sang restant peut être cryoconservés pour produire stabilat par mélange avec 8% de glycérol, 20% inactivé par la chaleur foetal casérum lf (salut-FCS) et du sang infecté 72%. geler lentement à -80 ° C en utilisant un lent gel gel récipient pour atteindre une vitesse de refroidissement de -1 ° C / min, avant le transfert à l'azote liquide.

2. L'infection des souris expérimentales

1. Placez CD1 souris femelles (~ 21-25 g) dans une boîte de chauffage pour réchauffer doucement pour dilater les veines. Placez les souris réchauffés dans un dispositif de retenue en plastique et injecter 0,2 ml inoculum dilué par voie intraveineuse avec une aiguille G 25 dans la veine de la queue, ce qui équivaut à 4.000 trypanosomes par souris. Placez la pression au niveau du site d'injection après pour endiguer l'hémorragie.
   Remarque: l' infection intrapéritonéale est un itinéraire valide de l' infection et a été utilisé dans les études précédentes ^10, mais nous avons trouvé cela moins reproductible que la voie intraveineuse.
2. Randomize souris et cage infectées par groupes de 3 dans des cages SPF-ventilés. En tant que témoin, injecter CD1 souris femelles de type sauvage parasite non bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
3. Surveiller l'infection par le biais du sang Film Microscopie
   1. Spot 5 ul sang de venepuncture ou saignées sur une lame de verre et d'effectuer un frottis sanguin (en utilisant une deuxième lame de verre pousser doucement la goutte de sang à travers la diapositive pour produire un film mince). Autoriser les diapositives à l'air sec.
   2. Fixer le frottis sanguin avec 100% de méthanol et tache avec Giemsa pendant 10 min avant de rincer avec dH ₂ O et laisser sécher à l' air. Sous l'objectif 100X compter le nombre de trypanosomes dans 10 champs de vision (FOV).
      Remarque: le tournage de sang est effectué aux côtés de l'animal entier imagerie non invasive dès après l'infection d'un jour. Lors du traitement d'un certain nombre d'animaux, cette méthode de détermination quantitative du trypanosome est préféré au comptage hémocytomètre que les échantillons peuvent être conservés à la température ambiante et on les compte plus tard.

3. bioluminescence Imaging to Track Infection

Remarque: Pour surveiller l'infection, toute animal imagerie non invasive peut être utilisée.

1. Préparer une solution mère de D-luciférine, le substrat de la luciférase de luciole, dans Phosphate Buffered Saline de Dulbecco (DPBS) à 30 mg / ml. Filtre stériliser et congeler à -20 ° C.
   Remarque: D-luciférine est sensible à la lumière, donc la protéger de la lumière en enveloppant aliquotes dans du papier. Ne pas la congélation-décongélation répétée luciférine car il peut affecter l' activité ^11.
2. Chauffer une partie aliquote de la D-luciférine à la température ambiante. Retirez chaque souris de la cage (y compris les souris témoins infectées par la souche nonbioluminescent parasite de type sauvage) et injecter 150 mg / kg de la D-luciférine réchauffé (dilué dans du DPBS) intrapéritonéale avec une aiguille 25 G. Placer la souris dans une chambre isofluorane pendant environ 5 min pour induire une anesthésie avec 2% d' isofluorane / O ₂ au mélange de 2,5 L / min.
   Note: Les souris deviennent immobiles quand ils sont sous anesthésie. Pour l'imageur utilisé ici, 3 souris peuvent être traitées à la fois. Si les souris sont anesthettérisé pendant plus de 30 min, une pommade ophtalmique artificielle déchirure peut être appliquée pour prévenir les yeux des souris contre le dessèchement.
3. Pour l'imageur décrit ici, ouvrez le logiciel et initialiser la machine en utilisant le logiciel selon les instructions du fabricant. Acquérir les images une fois caméra et plaque chauffante ont atteint la température.
   Remarque: Cet instrument est généralement pas éteint, permettant à la machine d'effectuer des étalonnages de fond pendant la nuit. Dans le cas où il a besoin de redémarrer, il doit exécuter une vérification d'étalonnage en premier.
4. Placer les souris anesthésiés dans l'imageur (voir 3.5). Utilisez de grands séparateurs noirs entre les souris pour minimiser saigner à travers de tout signal bioluminescent lumineux. souris de l'image en utilisant un ensemble de temps d'exposition; 1, 3, 10, 30, 60 et 180 secondes, avec binning moyenne, 1 f / arrêt et un filtre ouvert, et le champ de vision E (12,5 x 12,5 cm ^2).
   Remarque: Les souris témoins infectées par le type sauvage parasites GVR35 nonbioluminescent fournissent un backgrvaleur de bioluminescence ound. À partir d' un essai de cinétique de luciférine (figure 6) avec ce modèle, nous avons constaté que les crêtes du signal de bioluminescence à 10 minutes après l' administration et de l' imagerie dure environ 5 minutes pour 3 souris. Prenez ce délai en considération lors de l'anesthésie et l'imagerie des souris.
5. Pour assurer l'imagerie approfondie des souris, tourner pour obtenir une ventrale, dorsale et vue latérale. Maintenir la cohérence dans l'ordre d'orientation pour l'imagerie entre les animaux séquentielles.
6. Après l'imagerie, permettent la souris pour récupérer de l'anesthésie sous observation avant de revenir au SPF-cage.
7. Continuer imagerie souris tous les 7 jours jusqu'au jour 21 post-infection. Il devrait y avoir une augmentation constante du signal de bioluminescence sur l'animal entier.
8. A D21, l'image et le film de sang des souris comme décrit ci-dessus et la dose souris avec 40 mg / kg par voie intrapéritonéale acéturate de diminazène. Ce médicament va effacer la parasitémie périphérique, mais ne sera pas traverser la barrière hémato-brain barrière, et permet donc une meilleure visualisation de l'infection du système nerveux central.
   Remarque: Diminazène diminazène est un médicament bien établie utilisée pour traiter la trypanosomiase animale à un stade précoce.
9. Continuer l'imagerie et la surveillance à J28 et J35.

4. Confirmation CNS Infection

1. A D35, les souris d'image indiqués ci-dessus (étapes 3.1-3.4).
2. Après l'exposition, les souris permettent de récupérer à partir de souris d'anesthésie et exsangue comme décrit à l'étape de 1,6 à 1,8, la collecte de sang pour une analyse ultérieure.
3. Suite à une ponction cardiaque, perfuse des souris avec 20 ml de PBS (en option: ajouter 3 mg / ml de luciférine à une solution de perfusion), par l'intermédiaire du coeur pour effacer le sang provenant des organes et à réintroduire l'étiquette de luciférine qui aurait effacé de la région du cerveau au cours de l'intervalle de temps de l'étape 4.1.
4. Retirez délicatement le cerveau, en utilisant des ciseaux courbes, coupe de la base autour de la circonférence du crâne, et soulevant la partie supérieure du crâne, pour permettre au cerveauà soulever délicatement avec une pince incurvées.
5. Placer excisés du cerveau sur une section de matière plastique noire et la pipette 50 ul de 15 mg / ml de luciférine sur l'organe avant l'imagerie, afin d'assurer la luciférine adéquate a été ajoutée au cerveau excisée. L'image en utilisant les paramètres ci-dessus. Cela démontrera la localisation de l'infection aux hémisphères cérébraux.
   Remarque: la quantification de la parasitémie en aval sur le cerveau excisé peut être effectuée par qPCR ⁸ comme décrit précédemment. D'autres applications en aval alternatives peuvent inclure histologie ou immuno-histochimie afin d'identifier des parasites dans le tissu cérébral après fixation.

5. Quantification de la bioluminescence Imaging

Note: bioluminescence peut être quantifiée en utilisant la région d'intérêt (ROI) avec le logiciel d'imagerie et corrigé pour le fond bioluminescence.

1. Utilisation de l'outil de retour sur investissement, créer un ROI rectangulaire pour l'animal entier une quantificationnd positionner sur l'image de la souris pour couvrir la pointe du nez à la base de la queue de la souris. Utilisez la même boîte de taille pour chaque animal et chaque point de temps. Lorsque l'on regarde le retour sur investissement pour le cerveau, utilisez un ROI circulaire de la même manière, en le positionnant sur la région de la tête de la souris dans l'image.
2. Si vous le souhaitez, d'ajuster les images apparaissent sur le même spectre pour une représentation visuelle de l'infection.
   Remarque: Le logiciel utilisé ici génère une carte de couleur pour chaque image réglée automatiquement pour le comptage de photons minimum et maximum. Pour permettre une comparaison visuelle entre une série d'images, l'échelle de couleurs doit être réglé sur les mêmes valeurs pour toutes les images.
   1. Utilisation de l'image la plus bioluminescence et l'onglet «Réglage d'image» sur la palette d'outils, sélectionnez une échelle logarithmique et une échelle minimale de couleur appropriée et maximale (à déterminer empiriquement). Appliquer cette échelle à toutes les images tout au long de l'expérience.

Résultats

Ce protocole démontre comment suivre la progression de la maladie après infection de souris avec T. b. brucei, un modèle pour la trypanosomiase humaine africaine. La figure 1 montre la chronologie du protocole expérimental, ce qui démontre le calendrier de traitement et d' imagerie étapes. La figure 2 montre un champ de vue typique dans un Giemsa teinté frottis sanguin fixe utilisé pour quantifier la parasitémie périphérique, avec...

Discussion

Le développement d'un T. bioluminescente b. souche brucei GVR35 permet la visualisation d'une infection trypanosomienne du début à la fin de l' étape. Modèles d'infection antérieurs ont été incapables de détecter la phase tardive, lorsque les parasites sont dans le cerveau, en temps réel de la microscopie de frottis sanguin, et nécessitaient l'abattage et l' élimination des cerveaux de souris infectées afin de déterminer la charge parasitaire ^12.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Sigma, UK	P4417	tablets pH 7.4
Glucose	Sigma, UK	G8270	99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride	Sigma, UK	A9434	99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt)	Sigma, UK	H0878
Hi-FCS	Gibco, Life Technologies, UK	10500-064	500 ml
DPBS	Sigma, UK	D4031	Sterile filtered
Mr. Frosty	Nalgene, UK
Giemsa	Sigma, UK	G5637
D-Luciferin	Perkin Elmer, UK
Sigma, UK	115144-35-9
Diminazene aceturate	Sigma, UK	D7770	Analytical grade
IVIS Lumina II	Perkin Elmer, UK		other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2	Perkin Elmer, UK		proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe	Fisher Scientific, UK	10142104
20 ml Syringe	Fisher Scientific, UK	10743785
25 G Needles	Greiner Bio-one	N2516
21 G Needles	Greiner Bio-one	N2138
Twin-frosted microscope slide	VWR, UK	631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube	StarLab, UK	I1415-1000
7 ml Bijou tube	StarLab, UK	E1412-0710
Mouse restrainer	Sigma, UK	Z756903	our restrainer was made in-house, this is a similar model