רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הכימות המהיר ורגיש מאוד של העברת אנרגית תהודת פורסטר נתוני חיישנים (סריג) באמצעות נתח סריג נייד מחוייט. המכשיר שימש לאיתור מלטוז בטווח טמפרטורה קריטית הממקסם רגישות זיהוי, שמאפשרים להעריך מעשית ויעילה של תכולת הסוכר.

Abstract

שיפורים שנעשו לאחרונה תהודה העברת אנרגיה פורסטר חיישנים (סריג) אפשרו את השימוש בהם כדי לזהות מולקולות קטנות שונות כולל יונים וחומצות אמינו. עם זאת, את עוצמת האות החלשה המולד של חיישני סריג הוא אתגר גדול שמונע בקש בתחומים שונים והופך את השימוש יקר, high-end fluorometers צורך. בעבר, בנינו מנתח סריג חסכוני, בעל ביצועים גבוהים שיכול למדוד את היחס במיוחד של שתי להקות אורך גל פליטה (530 ו -480 ננומטר) כדי להשיג רגישות זיהוי גבוהה. לאחרונה, התגלה כי חיישני סריג עם חלבונים מחייבים periplasmic חיידקי לזהות הליגנדים ברגישות המקסימלית בטווח הטמפרטורה הקריטי של 50 - 55 מעלות צלזיוס. דו"ח זה מתאר פרוטוקול להערכת תכולת הסוכר בדגימות משקות, זמינות מסחרי באמצעות מנתח הסריג הנייד שלנו עם חיישן טמפרטורת סריג ספציפי. התוצאות שלנו הראו כי preheating הנוסףתהליך של חיישן הסריג מגביר באופן משמעותי את אות יחס הסריג, כדי לאפשר מדידה מדויקת יותר של תכולת סוכר. מנתח הסריג מחוייט החיישן יושמו בהצלחה לכמת את תכולת הסוכר בשלושה סוגים של משקאות מסחריים. אנו צופים כי שיפור ביצועים והקטנת גודל נוסף של הציוד יקל על שימוש מנתחי כף יד בסביבות שבן ציוד high-end אינו זמין.

Introduction

אנרגית העברת תהודת פורסטר (סריג) כבר בשימוש נרחב כחיישן ביומטרי לזיהוי מולקולות קטנות כגון סוכרים, יוני סידן, וחומצות אמינו ^1-4. biosensors סריג מכילים חלבוני ניאון, חלבוני ניאון ציאן (CFPs), וחלבונים פלואורסצנטי צהוב (YFPs), אשר התמזגו בשני הקצוות של חלבונים קושרי periplasmic (PBPs). סוכרים להיקשר PBPs ממוקם באמצע חיישן סריג, ולגרום לשינויים מבניים לחיישן כי לאחר מכן לשנות את כיוון דיפול מרחק המעבר של שני חלבוני ניאון בכל צד של PBPs. שינוי זה מאפשר ניתוח כמותי של תכולת הסוכר על ידי מדידת היחס בין אורכי גל הפליטה של ​​EYFP (530 ננומטר) ECFP (480 ננומטר). בזכות הרגישות, סגוליות גבוהה, יכולת ניטור בזמן אמת, וזמן תגובה מהיר של חיישנים ביולוגיים סריג, חיישנים אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים הסביבה, תעשייה, רפואה ^5. יתר על כן, ratiomמדידת etric באמצעות חיישנים ביולוגי סריג יש יתרונות מעשיים חשובים, כפי שהוא יכול לשמש כדי למדוד רכיבים בדגימות ביולוגיות מורכבות שבו ריכוז החיישן לא ניתן לשלוט בקלות קרינת רקע הוא תמיד נוכחת.

למרות יתרונות אלה של חיישנים מבוססים סריג להדמיה כמותית, שינויים מבניים קטנים עם העברת תנועת תחום שלם אל חלבוני הניאון לייצר עוצמת אות חלשה מטבעו. אות חלש זה מגביל את היישום של חיישנים מבוססי סריג עבור במבחנה או in vivo ניתוח ^6. כתוצאה מכך, רוב הסריג biosensors דורש שימוש בציוד יקר ורגיש מאוד. בעבר, פתחנו מנתח סריג זול ונייד עם יכולות דומות לאלה של מנתחי הקרינה הקיימים ^7. במכשיר זה, דיודה האור האולטרה סגול הלהקה 405 ננומטר זולה (LED) שימש כמקור האור לגרום עירור של הדואר אותות הקרינה, החלפת מנורה או לייזר יקר. מערכת זיהוי של הנתח ביעילות מתמקדת אות הקרינה שמגרש גבי שני photodetectors עם פוטודיודה סיליקון. במחקר שנערך לאחרונה יותר, הראינו כי אופטימיזציה של טמפרטורת זיהוי ב 50 - C ° 55 יכולה משמעותית להגדיל את אות סריג ratiometric ^8. טמפרטורה ספציפית זה שיפור אות, יחד עם מנתח מחוייט הסריג, מאפשר שימוש חיישני סריג ביישומי אבחון כלליים יותר ברגישות מהירה וגבוהה.

בפרוטוקול זה, הראינו את תחולתה הכללית של הנתח סריג בתנאי טמפרטורה סריג אופטימלי על ידי כימות שתכולת הסוכר משקאות זמינים מסחרית. פרוטוקול זה מספק את הפרטים של פעולת מכשיר סריג, וכן תיאור קצר של חיישן הכנת מדגם. אנו צופים כי דו"ח זה יקדם את התחולה הפוטנציאלית של ניידמנתח בסביבות מעבדה בקנה מידה קטן לספק בסיס להמשך פיתוח של מכשיר אבחון באתר זול עם חיישנים ביולוגיים מבוססי סריג.

Protocol

1. הכנת biosensor

1. לבנות את הפלסמיד pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 ידי ביצוע הפרוטוקול בעבר המבוסס ^2.
2. לחסן 5 מ"ל של מרק לוריא (LB) עם מושבה אחת של זן Escherichia coli DE3 לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות עם רעד.
3. העברת 1 מ"ל של התרבות O / N לתוך בקבוק 500 מ"ל המכיל 100 מ"ל LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה רועד עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ מגיע 0.5 (כ -3 שעות).
4. קציר התאים צינור חרוטי 50 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב g 1,000 × במשך 20 דקות ב 4 ° C.
5. Resuspend גלולה במהירות בצינור אחד עם 50 מ"ל מים מזוקקים קר כקרח (DW) ו צנטריפוגות ב 1000 גרם × במשך 20 דקות ב 4 °.
6. Resuspend גלולה ב 50 μl של DW קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול ידי מתערבל בעדינות עד הפתרון (תאי electrocompetent) מגיעה OD ₆₀₀ של 100.
7. מניחים את התערובת של תאים electrocompetent (50 μl של התאים ב OD של ₆₀₀ 100) ו -10 ננוגרם של פלסמיד pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 בתוך קובט electroporation קר כקרח בהתקן electroporation ו electroporate את התערובת (ס"מ / 18 ק, 25 μF).
8. להוסיף במהירות בינונית SOC 1 מ"ל ל קובט ו resuspend התאים בעדינות, ואחריו התאוששות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד עדין בתוך 15 מ"ל צינור מסביב לתחתית.
9. מורחים את התאים על צלחת LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
10. לבודד מושבה אחת באמצעות לולאה ולחסן את המושבה ב 10 מ"ל של LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב 37 מעלות צלזיוס שייקר במשך 12 שעות.
11. הוסף 5 מ"ל של התרבות הזרע עד 500 מ"ל של LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו דגירה תרבות חממה רועד 37 ° C.
12. הוסף 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) כאשר מגיע OD ₆₀₀0.5 דגירת תרבות חממה רועדת 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
13. צנטריפוגה התאים ב 4500 גרם × במשך 20 דקות (4 ° C) ובעדינות להסיר supernatant.
14. Resuspend גלולה ב 5 חיץ מחייב מ"ל (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ PMSF, 0.5 mM EDTA, ו 1 מ"מ DTT).
15. Sonicate תאים על קרח עם שש התפרצויות של 10 שניות ב 200-300 W, לאחר כל פרץ עם 10 שניות של הקירור.
16. צנטריפוגה lysate ב 10,000 × גרמנו במשך 30 דקות ב 4 ° C עד גלולת פסולת הסלולר. העברת supernatant (חלבון מסיס) לתוך צינור אוסף חדש.
17. כדי להשיג טיהור הזיקה של חלבונים חיישן סריג, עומס 4 מ"ל של lysate התא פינה על עמודה זיקה Ni-נ.ת.ע (נפח של 5 מ"ל) ולבצע assay כרומטוגרפיה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) ^18.
18. לשטוף את העמודה פעם עם חמישה כרכים הטור של חיץ לשטוף לי (חיץ פוספט 50 מ"מ, נתרן כלורי 300 מ"מ, 10 מ"מ imidazole, pH 7.0).
19. חזור על השלב לשטוף עם חמישה כרכים הטור של חיץ לשטוף II (חיץ פוספט 50 מ"מ, נתרן כלורי 300 מ"מ, 20 מ"מ imidazole, pH 7.0).
20. Elute החלבון החיישן עם חמישה כרכים הטור של חיץ elution (חיץ פוספט 50 מ"מ, 300 מ"מ נתרן כלורי, 500 imidazole מ"מ, pH 7.0).
21. כדי להתרכז desalt המדגם eluted, למלא concentrator (גודל הממברנה של 10,000 מגוואט) עם עד 20 מ"ל של מדגם צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3000 גרם ×. מילוי concentrator עם בופר פוספט 0.8% (PBS). חזור על פעולה זו פעמים, ראשון ממלא את הרכז עם 20 מיליליטר של מדגם, ולאחר מכן מילוי עם PBS.
22. לשחזר את החלבון החיישן מרוכז-מומלחים דה ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.

מדידת 2. תכולת הסוכר באמצעות מנתח הסריג

הערה: הפרטים של בניית מנתח הסריג תואר בעבודה הקודמת שלנו ^7.

1. כן פתרון זיהוי של 0.8% PBS המכיל 0.2מיקרומטר של חלבוני החיישן.
2. הפעל נתח הסריג. לחץ על כפתור "UP" למשך 2 שניות כדי לכייל את הטמפרטורה האופטימלית. כוונו את הטמפרטורה ל -53 מעלות צלזיוס באמצעות לחצני "UP" או "למטה" ולחץ על כפתור "SET".
3. עבור כיול, לחץ לחיצה ממושכת על "UP" או "למטה" כפתורים בו זמנית למשך 2 שניות. ודא צגי LED "CALIB" ולחץ על הכפתור "SET".
4. מניחים 12.5 × 12.5 × 45 מ"מ (אורך × רוחב × גובה) מלבני כלי-הפאות (קובט) המכיל PBS רק חיץ לתוך מחזיק קובט של הנתח ולחץ על כפתור "SET".
5. החזר את קובט עם אחד המכיל את פתרון זיהוי בלבד (ראה 2.1) ללא סוכר (מלטוז / סוכרוז) ולחץ על כפתור "SET" כדי לכייל את הבסיס.
6. החזר את קובט עם אחד המכיל את פתרון זיהוי עם סוכר 10 מ"מ ולחץ על "SET"לַחְצָן.
7. כדי לקבוע את תכולת הסוכר של מדגם משקה, לשים 1 מ"ל מדגם משקה צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו צנטריפוגות ב g 16,000 × 1 דקות.
   הערה: סריג מבוסס חיישן מדידת קרינה יש את היתרון של לא הדורשים טיפול קדם מיוחד של המדגם כי רק 1% (v / v) של המדגם כלול מהנפח הכולל. עם זאת, אנו ממליצים להסיר כל חומר עלול להשפיע על מדידת הקרינה (למשל, תאים, חלקיקים מסיסים, שומנים, שומן, או כל חומר עם autofluorescence). בנוסף, אם חומצה חזקה, בסיס חזק, ניקוי סוכן (חומרי ניקוי), או חומר מתחלב (מתחלב) נמצאת בריכוז גבוה ועלולה להשפיע על המאפיינים של החיישן הביולוגי הסריג, יש להסירו באמצעות ממס אורגני או מנטרל. לדוגמא, כאשר שומן מתחלבים חלב מסולקים מן קפוא חטיפים, הדגימות הן centrifuged בתוך שפופרת microfuge ב 16,000 × g למשך 30 דקות, ואת betwee הנוזלn משקע בתחתית ואת השכבה העליונה של שומן חלב מופק. כמות שווה של הקסאן אז הוא הוסיף, ואחריו צנטריפוגה ב 15,000 g × למשך 30 דקות כדי לחסל שומנים.
8. הסר את supernatant עם מזרק 1 מ"ל ולסנן אותו דרך פילטר מזרק (גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר).
9. מניחים 0.1 מ"ל מסוננים מדגם משקה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 0.9 מ"ל PBS ו מערבולת בעדינות.
   הערה: זה קריטי כדי לדלל את המדגם משקה כראוי. במקרה זה, דילול 1,000 פי בוצע כך ריכוז הסוכר ייפול בתוך הטווח הדינמי של המכשיר. אנו ממליצים הערכת ריכוז סוכר היעד מראש על ידי פנייה תכולת הסוכר בתווית של המשקה.
10. הוסף 5 μl של המדגם משקה מדולל (1%, V / V) כדי קובט המכיל 0.495 מ"ל של פתרון זיהוי.
11. מניח את קובט בבעל קובט של נתח סריג מחממי הפתרון מדגם ל -53 מעלות צלזיוס.
12. לחץ על הכפתור "SET" כדי למדוד את תכולת הסוכר.
    הערה אפשר להעריך את מדידת הסריג באמצעות קורא צלחת multilabel או ספקטרופוטומטר קרינה מצויד בהתקן פלטייה של בקרת טמפרטורה על ידי קריאת היחס ב 488/535 ^7,8 ננומטר. לגילוי סוכרוז, ובצע את הצעדים שיוצגו 1.1 כדי 2.12 עם חיישן CSY-LH ^2.

תוצאות

כדי לבצע ניתוח כמותי של תכולת הסוכר באמצעות מנתח הסריג, יש צורך לבנות עקום מצוידת אמיד סוכר ריכוז היעד מייחס הסריג ציין. בואו r להגדיר את היחס בין עוצמת הפליטה של CFP ב 480 ננומטר ואת עוצמת הפליטה של YFP שנוצר ב 530 ננומטר (Eq. 1).

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר ויעיל של תכולת הסוכר בדגימות משקות, באמצעות נתח מחוייט סריג ⁷ בטמפרטורה אופטימלית עבור חיישני סריג. המנתח נועד עם א-שפותח לאחרונה, להקת 405 ננומטר זול אולטרה סגול-LED כמקור האור ושני photodetectors עם פוטודיודה סיליקון. מכשיר זה הוא יותר יעיל ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink