휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

요약

이 프로토콜은 주문품 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 센서 데이터의 신속한 고감도 정량 설명한다. 장치는 당도 실용적이고 효율적인 평가를 가능하게 검출 감도를 최대화하는 임계 온도 범위 내에서 말토오스를 검출하기 위해 사용 하였다.

초록

포스터 공명 에너지 전달이 최근 개선 (FRET) 센서는 이온 및 아미노산을 포함하여 다양한 작은 분자를 검출하기 위해 사용을 사용할 수있다. 그러나, FRET 센서의 본래 약한 신호 세기는 다양한 분야에의 응용을 방지하고 비싼 고성능의 사용이 필요하게 fluorometers 중요한 과제이다. 이전에, 우리는 특히 높은 검출 감도를 달성하기 위해 두 개의 발광 파장 대역 (530 및 480 ㎚)의 비율을 측정 할 수있는 경제적 인 고성능 FRET 분석 내장. 55 °의 C - 더 최근에는 세균의 세포질 단백질과 결합 FRET 센서 (50)의 임계 온도 범위에서 최대 감도 리간드를 검출하는 것이 발견되었다. 이 보고서는 온도 별 FRET 센서 우리 FRET 휴대용 분석기를 사용하여 시판 음료 샘플 당 함량을 평가하기위한 프로토콜을 설명한다. 우리의 결과는 추가 예열 것으로 나타났다프렛 센서의 과정은 상당히 당도의보다 정확한 측정을 가능하게하려면 FRET 비율 신호를 증가시킨다. 주문품 FRET 분석과 센서 성공적 상용 음료의 세 종류의 당 함량을 정량하기 위해 적용 하였다. 우리는 하이 엔드 장비는 가능하지 않은 장치의 추가적인 소형화 및 성능 향상이 환경에서 휴대용 분석기의 사용을 용이하게 할 것으로 예상된다.

서문

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 널리 당, 칼슘 이온, 아미노산 ^1-4와 같은 작은 분자를 검출하는 바이오 센서로서 사용되어왔다. FRET 바이오 센서는 형광 단백질, 시안 형광 단백질 (CFP들), 및 주변 세포질 결합 단백질 (PBPs)의 양단에 융합 노란색 형광 단백질 (YFPs)를 포함한다. 당류는 이후 PBPs 양쪽 끝에 두 형광 단백질의 거리 및 전이 쌍극자의 방향을 변경하는 센서의 구조 변화를 일으키는 FRET 센서의 중앙에 위치 PBPs 바인딩. 이러한 변화는 EYFP (530 ㎚) 및 ECFP (480 ㎚)의 발광 파장의 비율을 측정함으로써, 당 함량의 정량 분석을 가능하게한다. 높은 민감도, 특이도, 실시간 모니터링 능력 및 FRET 바이오 센서의 빠른 응답 시간으로 인해, 이러한 센서는 크게, 환경 산업, 의료 분야 ^5에 사용된다. 또한, ratiom이 센서의 농도를 용이하게 제어 및 배경 형광이 항상 존재할 수없는 복잡한 생물학적 시료의 성분을 측정하기 위해 사용될 수있다 FRET 바이오 센서를 사용하여 측정 etric 중요한 실용적인 장점을 갖는다.

양적 시각화를위한 FRET 기반 센서의 이러한 장점에도 불구하고, 형광 단백질에 불완전 도메인 모션 전송 작은 구조적 변화는 본질적으로 약한 신호 강도를 생산하고 있습니다. 이 약한 신호는 시험 관내 또는 생체 내 분석 ⁶ FRET 기반 센서의 적용을 제한합니다. 따라서, 대부분의 바이오 센서가 고가 민감한 장비를 사용해야 FRET. 이전에는, 기존 형광 분석기 ^(7)의 것과 유사한 기능을 저렴하고 휴대용 FRET 분석을 개발 하였다. 이 장치 저렴 405 nm의 대역 자외선 발광 다이오드 (LED)에서는 제의 여기를 야기하는 광원으로서 사용 된즉 형광 신호 고가 램프 또는 레이저를 교체. 광자의 검출 시스템은 효율적으로 실리콘 광 다이오드 두 광 검출기 상으로 발산 형광 신호를 집중한다. 55 ° C를 크게 비율 계량 FRET 신호 ^(8)을 확대 할 수 - 더 최근의 연구에서 우리는 50에서 검출 온도의 최적화는 것을 보여 주었다. 이 온도 별 신호 향상은 맞춤형 FRET 분석과 함께 신속한 고감도 일반적인 진단 애플리케이션 FRET 센서의 사용을 가능하게한다.

이 프로토콜에서는 시판 음료의 당 함량을 정량함으로써 FRET 최적 온도 조건 하에서 분석 FRET의 일반적인 적용 가능성을 보여 주었다. 이 프로토콜은 FRET 장치 동작의 세부 사항뿐만 아니라 센서 샘플 준비에 대한 간략한 설명을 제공한다. 우리는이 보고서는 휴대용의 잠재적 인 응용 프로그램을 촉진 것으로 예상소규모 실험실 환경 분석기 FRET 기반 바이오 센서와 저가의 현장 진단 장치의 추가 개발을위한 기반을 제공한다.

프로토콜

바이오 센서 1. 준비

1. 이전에 확립 된 프로토콜 ^2에 따라 CFP-MBP-YFP-을 His6 - 플라스미드 pET21a (+)를 구축합니다.
2. 대장균 DE3 균주의 단일 콜로니로 루리아 국물 (LB) 5 ㎖를 접종하고 진탕 16 시간 동안 37 ° C에서 품어.
3. 전송 100 ㎖ LB를 함유하는 600 나노 미터 (OD _{600)에서의} 광학 밀도가 0.5 (약 3 시간)에 도달 할 때까지 진탕 배양기에서 37 ℃에서 부화 500 mL의 플라스크에 O / N 배양 1 ㎖.
4. 4 ℃에서 20 분 동안 1000 × g에서 원심 분리하여 50ml의 원뿔형 튜브에 세포를 수확.
5. 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 × g에서 50 ml의 얼음처럼 차가운 증류수 (DW) 및 원심 각 튜브에 신속하게 펠렛을 재현 탁.
6. 부드럽게 용액 (electrocompetent 세포)까지 소용돌이에 의해 10 % (v / v) 글리세롤과 빙냉 DW 50 μL에 펠렛을 재현 탁 것은 OD에 도달 ₍₆₀₀₎ (100).
7. 일렉트로 장치와 electroporate에 빙냉 전기 천공 큐벳에 CFP-MBP-YFP-을 His6 - 플라스미드 pET21a (+) 10 ng의 (AN OD 100 _(600)에서 세포의 50 μL) electrocompetent 세포의 혼합물을 놓고 혼합물 (18 kV로 / ㎝, 25 μF).
8. 신속 완만 15 mL의 둥근 바닥 튜브에 진탕하면서 1 시간 동안 37 ℃에서 회복 하였다 부드럽게 세포를 큐벳에 1 mL의 SOC 배지를 추가하고 재현 탁.
9. 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 세포를 확산하고 12 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
10. 루프를 사용하여 단일 콜로니를 분리 및 LB는 12 시간 동안 진탕 기에서 37 ℃에서 100 ㎍ / ml 암피실린 10ml에 콜로니를 접종.
11. 100 ㎍ / ml 암피실린 LB 500 ml의 종자 배양 5 mL를 첨가하고 37 ° C 진탕 배양기에서 배양 물을 배양한다.
12. 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-티오 갈 락토 시드 (IPTG) 때 OD _600에 도달 추가0.5 24 시간 동안 37 ° C 진탕 배양기에서 문화를 품어.
13. 원심 분리기 20 분 (4 ° C를) 조심스럽게 뜨는을 제거하기위한 4,500 × g에서 세포.
14. 5 mL의 결합 완충액 (20 mM 트리스 - 염산, 산도 8.0, 1 ㎜ PMSF, 0.5 mM의 EDTA, 1 mM의 DTT)의 펠렛을 재현 탁.
15. 각각의 냉각 10 초 버스트 다음, 200 ~ 300 W에서 여섯 10 초 버스트 얼음에 세포를 초음파 처리.
16. 10,000 ×에서 해물을 원심 분리기 4 ° C에서 30 분 동안 g는 세포 파편 펠렛합니다. 새 컬렉션 튜브에 뜨는 (가용성 단백질)을 전송합니다.
17. 나 Ni-NTA 친 화성 컬럼 (5 ㎖의 부피) 상에 FRET 센서 단백질의 친 화성 정화, 부하 클리어 세포 용 해물의 4 ml의를 달성하고 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) ^(18)를 사용하여 크로마토 그래피 분석을 수행 할 수 있습니다.
18. 세척 완충액 다섯 컬럼 부피로 한번 씻어 열 I (50 mM의 포스페이트 완충액, 300 mM 염화나트륨, 10 mM의 이미 다졸, pH를 7.0).
19. 세척 완충액 II 다섯 컬럼 부피 (50 mM의 포스페이트 완충액, 300 mM 염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, pH를 7.0)으로 세척하는 단계를 반복한다.
20. 용출 완충액의 다섯 컬럼 부피 (50 mM의 포스페이트 완충액, 300 mM 염화나트륨 500 mM의 이미 다졸, pH를 7.0)와 센서 단백질을 용출시켰다.
21. 집중 용출 샘플을 탈염, 3,000 × g에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리기의 최대 20 ㎖에 집중 (10,000 MW의 막 크기)를 입력합니다. 0.8 % 인산 완충 식염수 (PBS)로 집중 리필. 첫 번째 샘플의 20 ml의 집중을 충전 한 후 PBS로 채우는 두 번이 단계를 반복합니다.
22. 농축 및 탈 소금에 절인 센서 단백질 복구 및 -80 ° C에서 보관합니다.

프렛 분석기를 사용하여 당도 2. 측정

참고 : FRET 분석기 건설의 세부 사항은 이전 작품 ^7에 설명 하였다.

1. 0.8 % 0.2 PBS를 함유하는 검출 솔루션을 준비센서 단백질 μM.
2. 프렛 분석기를 켭니다. 최적의 온도를 보정하기 위해 2 초 동안 "UP"버튼을 누릅니다. 은 "UP"과 "DOWN"버튼을 사용하여 53 ° C로 온도를 설정하고 "SET"버튼을 누릅니다.
3. 교정, 언론과 2 초 동안 동시에 "UP"과 "DOWN"버튼을 길게하십시오. LED가 패널에 "CALIB"하고는 "SET"버튼을 눌러 확인합니다.
4. 만 PBS는 분석기의 큐벳 홀더에 버퍼 및 "SET"버튼을 누르면이 포함 된 12.5 × 12.5 × 45mm (길이 × 폭 × 높이) 직육면체 용기 (큐벳)를 놓습니다.
5. 하나는 설탕 (맥아당 / 크로스)없이 오직 탐지 솔루션 (2.1 참조) 함유 큐벳을 교체하고베이스 라인을 교정하기 위해 "SET"버튼을 누릅니다.
6. 10 mM의 설탕 검출 솔루션을 포함하는 하나 큐벳을 교체하고 "SET"를 눌러단추.
7. 음료 샘플의 당 함량을 결정하기 위해 1 분 동안 16,000 × g에서 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 1 ㎖의 음료 샘플을 넣어.
   주 : FRET 센서 계 형광 측정 총량에 포함되는 샘플의 때문에 1 % (v / v)로 시료의 특별한 전처리를 필요로하지 않는 장점을 갖는다. 그러나, 우리는 형광 측정 (예를 들면, 세포, 불용성 입자, 지질, 지방, 또는 자기 형광과 자료를) 영향을 줄 수있는 물질을 제거하는 것이 좋습니다. 강산, 강염기, 제 (세정제)를 청소하거나, 유화제 (유화제)이 고농도로 존재하고 FRET 생물학적 센서의 특성에 영향을 미칠 수있는 경우 또한, 그 유기 용매 또는를 사용하여 제거되어야 중화제. 우유 지방, 유화제가 스낵 냉동로부터 제거되는 경우, 예를 들어, 샘플은 30 분, 액체 betwee 16,000 × g에서 미세 원심 분리 튜브에서 원심 분리N 바닥 침전물과 우유 지방의 상층을 추출한다. 헥산의 동일한 양을 30 분 지질을 제거하기 위해 15,000 × g에서 원심 분리 후 첨가한다.
8. 1 ML의 주사기로 상층 액을 제거하고 주사기 필터 (기공 크기 0.2 μm의)를 통해 필터링합니다.
9. 부드럽게 0.9 ml의 PBS와 소용돌이를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 음료 샘플 필터링 0.1 ml에 놓습니다.
   참고 : 제대로 음료 샘플을 희석하는 것이 중요합니다. 당 농도가 상기 장치의 동적 범위에 속하는 것이라고이 경우, 1000 배 희석을 수행 하였다. 우리는 음료의 라벨의 당도를 참조하여, 사전에 목표 당 농도를 추정 바랍니다.
10. 검출 용액 0.495 mL를 함유하는 큐벳 (1 % v / v)로 희석 된 음료 시료 5 μL를 추가한다.
11. 프렛 분석기의 큐벳 홀더에 큐벳을 놓고 53 ° C에 시료 용액을 예열.
12. 설탕 함량을 측정 할 수있는 "SET"버튼을 누릅니다.
    535분의 488 내지 ^7,8의 비율을 판독하여 온도 제어하는 펠티에 소자를 구비 한 다중 레벨 플레이트 판독기 또는 형광 분광 광도계를 이용하여 FRET 측정을 평가하는 것이 가능합니다. 크로스 탐지를 들어, CSY-LH 센서 ² 2.12 1.1의 단계를 따릅니다.

결과

프렛 분석기를 사용 당도의 정량 분석을 수행하기 위해, 관찰 된 FRET 비율에서 표적 당 농도를 추정 피팅 곡선을 구축 할 필요가있다. R은 480 nm에서 CFP의 발광 강도의 비율을 정의 YFP의 발광 강도가 530 나노 미터 (식. 1)에서 생성하자.

토론

이 프로토콜은 FRET 센서 최적 온도 주문품 FRET 분석 장치 ^(7)를 이용하여 음료 샘플 당 농도의 신속하고 효율적인 정량화를 허용한다. 이 분석기는 최근에 개발 된 저렴한 405 나노 밴드 광원 및 실리콘 포토 다이오드와 두 개의 광 검출기로 자외선이-LED 설계되었습니다. 이 장치는보다 비용 효율적인 다른 비교 fluorometers보다. FRET 센서를위한 최적의 온도 범위에서 두 개의 발광 파장 대역 (53...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	70011-044	0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC			2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 × 30 mm anion-exchange chromatography column
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quartz cuvette	Sigma	Z802875
AKÄKTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		a fluorescence spectrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Electrocompetent cells
A (Beverage)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermented drinks
B (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Soft drink
C (Beverage)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sports drink