JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Abstract

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.

The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Introduction

רוב בעלי החיים להסתמך בכבדות על החושים הכימיים שלהם לתקשר עם סביבתם. חוש הריח ממלא תפקיד חיוני למציאת והערכת מזון, הימנעות טורפים ואיתור שותפים ההזדווגות מתאים. ברוב היונקים, מערכת חוש הריח מורכב מלפחות ארבעה תת היקפי אנטומית והן מבחינה תפקודית ברורים: אפיתל ההרחה הראשי 1,2, גנגליון Grueneberg 3,4, האיבר במחיצה של Masera 5,6 ואת איבר יעקובסון. VNO כוללת המבנה החושי ההיקפי של מערכת חוש ריח האבזר (AOS), אשר ממלאת תפקיד מרכזי באיתור לאותות כימיים המעבירים מידע על זהות, מגדר, מעמד חברתי ומדינה מינית 7-10. VNO ממוקם בבסיס של מחיצת האף ממש מעל החיך. בעכברים, זה הוא צינור דו צדדי שהסתיים סמיות מגודר בתוך הקפסולה סחוסי 11-13. האורגן מורכב הן של epithe חושית המדיאלי בצורת חצי סהרlium כי מטפח את VSNs ושל חלק הלא-חושי בצד לרוחב. בין שניהם epithelia טמון לומן מלא ריר אשר מחובר אל חלל האף דרך הצינור הצר vomeronasal 14. כלי דם לרוחב גדולים בתוך הרקמה הלא-החושית מספקים מנגנון שאיבת כלי דם כדי להקל על כניסה של גדולות יחסית, בעיקר מולקולות בלתי נדיף כגון פפטידים או חלבונים קטנים לתוך לומן VNO באמצעות לחץ שלילי 15,16. הרכיבים המבניים של VNO נוכחים בלידה והאיבר מגיע לגודלו זמן קצר לפני גיל ההתבגרות 17. עם זאת, אם AOS מכרסם כבר תפקודי קטינים עדיין נושא לויכוח 18-20.

VSNs מאופיין הוא מיקומם אפיתל את סוג הקולט שהם מבטאים. VSNs להראות מורפולוגיה דו קוטבית עם אקסון מחוסר מיאלין לבין דנדריט פסגה יחיד שבולט כלפי הלום ומסתיים ידית הדנדריטים microvillous. גרזן VSNons fasciculate ליצור את עצב vomeronasal שמשאיר הקפסולה סחוסי בסוף dorso-הזנב, עולה לאורך מחצה, מעביר את הצלחת cribriform ופרויקטים הנורה חוש הריח אביזר (AOB) 21,22. האפיתל חושית vomeronasal מורכב משתי שכבות: השכבה הפסגה ממוקם קרוב יותר אל הצד luminal ונמלים הן V1R- וכל אבל סוג אחד של FPR-rs-להביע עצב. נוירונים אלה coexpress G-חלבון α-למקטע G αi2 ופרויקט לחלק הקדמי של AOB 23-25. עצב סנסורי ממוקם V2Rs המפורש שכבת בסיס יותר או FPR-rs1 לצד αo G ולשלוח האקסונים שלהם לאזור האחורי של AOB 26-28.

נוירונים vomeronasal מופעלים ככל הנראה על ידי semiochemicals קטן למדי 29-33 (V1Rs) או תרכובות חלבוניים 34-38 (V2Rs) כי מופרשים לתוך נוזלים שונים בגוף כגון שתן, רוק ולקרוע נוזל 37,39-41 . בניסויים באתרו הראו כי VSNs גם מופעלים על ידי פפטידים formylated שונים תרכובות מיקרוביאלית / צמודי דלקת 25,42. יתר על כן, heterologously הביע חלבונים-rs FPR לשתף ספקטרום אגוניסט עם FPRs לידי ביטוי את המערכת החיסונית, מה שמעיד על תפקיד פוטנציאלי גלאי עבור מחל conspecifics או מקורות מזון מקולקלים 25 (ראה אסמכתא 43).

יסוד להבנת יחסים ליגנד רצפטור ומפלה איתות במורד באוכלוסיות ספציפיות VSN הוא הערכה מפורטת של מאפייני biophysical הבסיסיים שלהם בסביבת ילידים. בעבר, ניתוח של איתות הסלולר יש יתרון מאוד מבעלי חיים מהונדסים גנטית המציינים אוכלוסיה מוגדרת של נוירונים ידי coexpressing חלבון בסמן פלורסנטי 30,44-49. בפרוטוקול זה, קו עכבר מהונדס המבטא FPR-RS3 יחד עם סמן פלואורסצנטי (FPR-RS3-i-ונוס) משמש.גישה זו מדגימה איך להעסיק כזה זן עכבר מהונדס גנטי כדי לבצע ניתוח אלקטרו של אוכלוסיית תאים לזיהוי אופטי באמצעות הקלטות תיקון- clamp נוירון הבודד בחתכי רקמת VNO עטרה חריפים. לחץ מונחה אוויר מערכת זלוף רב-קניים עבור גירויים חושיים וסוכנים תרופתיים מאפשר מהיר, הפיך מוקדי גירוי עצבי או עיכוב במהלך הקלטות. הקלטות כל תא בהכנות פרוסות לאפשר ניתוח מפורט של תכונות מהותיות, conductances מופעל במתח, כמו גם דפוסי פריקת פוטנציאל פעולה בסביבה המקורית של התא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

נהלי כל החיה היו בהתאם לחקיקה מקומית ואיחוד האירופי על ההגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוי (Directive 86/609 / EEC) ועם המלצות שהועלו על ידי הפדרציה של אגודות מדע בעלי חי מעבדה אירופאיות (FELASA). שניהם C57BL / 6 עכברים ועכברים FPR-RS3-i-ונוס שוכנו בקבוצות של שני המינים בטמפרטורת החדר על מחזור אור 12 שעות / כהה עם מזון כרצונך מים זמין. בניסויים צעירים (6-20 שבועות) של שני מינים היו בשימוש. אין הבדלים ברורים תלויה מגדרים נצפו.

1. פתרון כנה

  1. כן S 1 פתרון תאי: 4- (2-הידרוקסי-אתיל) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) שנאגר פתרון תאי המכיל (מ"מ) 145 NaCl, KCl 5, 1 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES; pH = 7.3 (מנוכה עם NaOH); osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז).
  2. כן extracelluS 2 פתרון Lar: carbogen-מחומצן (95% O 2, 5% CO 2) פתרון תאיים המכילים (מ"מ) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, 1 2 CaCl, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7.3; osmolarity = 300 mOsm (מנוכה עם גלוקוז).
  3. הכן 4% פתרון agarose טמפרטורה נמוכה gelling (S 3) להטבעת רקמות: 4% agarose טמפרטורה נמוכה gelling. ממיסים 2 גרם נמוכה gelling agarose ב 50 מ"ל של S 1 בבקבוק מעבדה זכוכית 100 מ"ל יחד עם בוחש מגנטי. כדי להמס את agarose, הנחת את הבקבוק בתוך אמבט מים (עם מכסה לא סגור היטב) על 70 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות או עד הפתרון הופך שקוף תוך ערבוב. להתקרר ולשמור agarose מומסת באמבט מים שני ב 42 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  4. כן S 4 פתרון התאי: פתרון פיפטה המכיל (מ"מ) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 CaCl 2 (Ca חינם 2 + = 110 ננומטר), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7.1 (מנוכה עם KOH); osmolarity = 290 mOsm.
  5. לשנות / להתאים רכב S 1, S 2 ו- S 4 פי תכנון ניסוי בודד (למשל, חוסמים תרופתיים לבודד סוגים מסוימים של זרמים מופעלי מתח).

2. סביבת עבודה כנה

  1. מלאו מחמצני תא אחסון פרוס עם S 2 לפחות 30 דקות לפני לנתיחה, במקום על קרח למשך התאמת טמפרטורה ו- pH פתרון oxygenate ברציפות.
  2. מלאו מאגר עבור הפרוסה superfusion על הקלטת התקנה עם S 2 ו חמצן ברציפות.
  3. לפני לנתיחה, למלא vibratome קאמרית עם S 2 ולסדר קרח כתוש סביב החדר. לחלופין, להעביר פתרון מחומצן חילוף קרח קר מחמצנים קאמריים לתוך vibratome קאמרית ולשמור מחמצנים ברציפות.
  4. מסדרים כלים מתכלים כירורגיים.
  5. מניחים חבילת ג'ל קרח מתחת לנתחמיקרוסקופ, מכסים במגבת נייר כדי למנוע רקמות VNO מן המקפיא אל החלק התחתון של המנה.
  6. סכין גילוח נקי על ידי שטיפה קצרה באתנול 70% ומים מזוקקים הר כדי vibratome. חלף עבור כל פגישת חיתוך.

3. VNO Dissection והטבעה

  1. להקריב בעלי חיים על ידי חשיפה קצרה ל- CO 2 לערוף באמצעות מספרי כירורגיות חדים. הערה: ככל שזמן להקריב את החיה לשים את הקפסולה VNO על קרח הוא קריטי, למזער את הזמן פחות מ -2 דקות. כדי לשמור על כדאיות רקמות, להטביע הן VNOs מלא גזור agarose תוך פחות מ -30 דקות.
  2. הסר את הלסת התחתונה עם מספרי כירורגיות גדולים. זן דרך חלל הפה ופצע את העצמות ושרירי לסת התחתונות של כל צד בנפרד.
  3. מניח את החלק הנותר של הראש הפוך על צלחת פטרי הגדולה.
  4. משוך כלפי חוץ את העור של הלסת העליונה וסביב קצה האף עם מלקחיים בינוניים כדי לקבל גישה טובה יותרחותכות.
  5. השתמש במספרי עצם לחתוך את החלק הגדול ביותר של החותכות בזווית ~ 45 ° בכיוון המקורי (איור 1 א). זה יקל הסרת הקפסולה VNO מחלל האף.
    הערה: אין לחתוך את שורש השן כדי למנוע נזק קצה הקפסולה VNO.
  6. תפוס את החיך העליון הנוקשה חלק המקורי שלה עם מלקחיים בינוניים ובזהירות לקלף בחזרה בחתיכה אחת בזווית שטוחה (איור 1 ב).
    הערה: שוב ושוב לשטוף עם S קר כקרח 2.
  7. השתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את היתוך הגרמי בין קצה העצם vomer והלסת. הכנס את הטיפים מספריים עם החלק המעוגל של קצה מצביע כלפי חוץ מן VNO בזהירות לחתוך את העצם בצעדים קטנים משני שמאל לרוחב בצד ימין הקפסולה VNO.
  8. כדי להסיר את הקפסולה VNO, להשתמש במספריים באביב מיקרו לחתוך את העצם vomer בחלק הזנב ובזהירות להרים את עצם vomer מתוך nASAL חלל באמצעות מלקחיים בינוניים. מיד להעביר את VNO אל צלחת פטרי קטנה תחת מיקרוסקופ סטריאו על חבילת ג'ל הקרח שבו השלבים הנותרים של הניתוח יבוצע.
  9. שוטפים את VNO כמות קטנה של קר כקרח S 2 כדי למנוע את רקמות מהתייבשות.
  10. הפרד את כמוסות סחוסים המכילות רקמות הרכות VNO ידי גרירה האחורית של עצם vomer עם מלקחיים בינוניים. מקם את הקפסולה עבור תצוגה הגבי כך פיצול בין שני VNOs הופך לגלוי (איור 1D i).
  11. השתמש בקצה מלקחיים בסדר להפריד הסחוס הוא כמוסות VNO מהעצם המרכזית, תוך שמירה על עצם vomer מרותק בחלק האחורי.
    הערה: שימוש במלקחיים רק בשולי הקפסולה הסחוס להיזהר מאוד שלא לחדור מבעד הסחוס כמו האפיתל החישה העדין נפגע בקלות.
  12. לאחר שני VNOs מופרדים, להתחיל להסיר את הסחוס encapsulating האשוחיםt VNO.
  13. תפוס את השולים העליונים של קפסולה עם אחד מלקחיים בסדר התפצל קיר הסחוס שצורף בעבר עד עצם vomer (בצד המדיאלי).
  14. כדי להסיר הנותרים סחוס להפוך את VNO עם צד לרוחב המעוגל שלה לתחתית המנה ובבטחה להצמיד הסחוס בצד אחד באמצעות מלקחיים. בזהירות להזיז את מלקחיים בסדר השני מהצד האחורי בזווית מאוד שטוח בין סחוס VNO לרופף את הקשר בין רקמות הסחוס.
  15. לאט לקלף את VNO מן הסחוס על ידי מחזיק אותו קצה הזנב שלה, כדי למנוע ניזק האפיתל החושי.
  16. לאחר VNO היא דחסה הקפסולה, הקפד להסיר את כל חלקי הסחוס הקטנים הנותרים כמו כל חלקים נותרים של סחוס תנתק את הרקמה שמסביב agarose במהלך תהליך החיתוך.
  17. המקום טיפה קטנה של קר כקרח S 2 על VNO גזור הראשון כדי למנוע נזק לרקמות. כלי דם גדולים על wil צד לרוחבl להיות גלוי המציין כי האיבר עדיין לא נפגע ולא נפגע גס במהלך הניתוח (איור 2 א ii). במקרה כלי דם ניזוק, הוא עדיין יהיה כדאי להמשיך עם חותך את VNO עוד המורפולוגיה הכוללת לא נפגמה בבירור.
  18. מיד לנתח את VNO השני.
  19. כדי להטביע את VNOs, למלא שתי צלחות פטרי הקטנות אל שולי עם מומסת S 3 (מאוחסן באמבט מים ב 42 ° C; ראה 1.3).
  20. החזק את VNO על קצה זנב הרחב עם מלקחיים בסדר, כדי למנוע פגיעת האפיתל החושית.
  21. לטבול את VNO ב agarose והעבר אותו אופקי הלוך ושוב כמה פעמים כדי להסיר את הסרט של פתרון תאי וכן כל בועות אוויר מפני השטח שלו.
  22. מקם את VNO אנכית עם קצה הזנב מול התחתון של המנה. במקום צובט את VNO עם המלקחיים ישירות, לשנות את הכיוון על ידי הזזת קצה מלקחי proximi הקרובty אל VNO.
    הערה: האורינטציה במהלך ההטבעה היא קריטית שכן היא קובעת מטוס פרוס ונגישות עצב סנסורי במהלך הניסוי.
  23. מניחים מנות על חבילת ג'ל הקרח ולהמתין עד agarose יש הקרושה.
    הערה: אין לשנות את הנטייה VNO לאחר agarose החלה לחיזוק כמו זה יהיה לנתק את הרקמה מן agarose שמסביב.

4. רקמות VNO עטרה פרוסה

  1. השתמש מרית קטנה כדי להסיר גוש agarose מצלחת קטנה לתוך המכסה של צלחת פטרי גדולה, להעיף את agarose במהופך השארת טיפ הזנב של VNO כלפי מעלה.
  2. חותך את הגוש לתוך צורת פירמידה באמצעות אזמל כירורגי (3-4 מ"מ בקצה, 8-10 מ"מ בתחתית). יש להיזהר שלא לגרום נזק לרקמות מוטבע.
  3. להשתמש בדבק סופר לתקן את בלוק בצורת פירמידה למרכז הצלחת הדגימה vibratome ולחכות ~ 1 דק 'על הדבק להתייבש לחלוטין.
  4. מעביר את צלחת דגימת ג החיתוךhamber ולהכין את VNO השני, בהתאם. שמור צלחת עם הדגימה השנייה ב 4 ° C עד השימוש.
  5. השתמש microtome להב רוטט עם ההגדרות הבאות: עובי: 150-200 מיקרומטר; מהירות: 3.5 au = 0.15 מ"מ / sec; תדירות: 7.5 au = 75 הרץ. עבר פרוסות לתא מחמצנים עד לשימוש לאחר שבדק פרוסת מורפולוגיה לזמן קצר תחת מיקרוסקופ לנתח. פרוסות יכולות להישמר במשך כמה שעות.

5. הקלטות אלקטרו מתא בודד

  1. עבור הקלטות, משתמש במיקרוסקופ קבועה בשלב זקוף מצוידות מטרות טבילה במים, Dodt או בניגוד הפריע הפרש אינפרא אדום (IR-DIC), ואת קרינת EPI וכן CCD-מצלמה מקוררת. עבור רכישת נתונים, השתמש מגבר תיקון- clamp, לשלב את הראש, AD / לוח הממשק DA לבין מחשב (כולל תוכנת צריבה).
  2. הכינו מלאי של 10-20 טפטפות תיקון (4-7 MΩ). טפטפות משוך מן נימי זכוכית בורוסיליקט (1.50 מ"מ OD / 0.86 מזהה מ"מ) usinחולץ micropipette ga ו-פולנית אש עם microforge.
    הערה: אש ליטוש הטיפים פיפטה הוא חיוני כאשר תיקום VSNs קטן למדי. זה יעזור למנוע פקיעת קרום התא בעת הפעלת לחץ שלילי על מנת לקבל חותמת עמידות גבוהה. לאחר ליטוש פתיחת פיפטה צריך להיות כ 1 מיקרומטר.
  3. שמור טפטפות בצנצנת אחסון פיפטה כדי למנוע נזק הצטברות אבק עד השימוש.
  4. כן מערכת זלוף ידי מילוי מאגרי פתרון צינורות פי תכנון ניסוי.
    הערה: הסר בועות אוויר וצינורית לחלוטין כפי שהם יפריעו הקלטות אלקטרו בחום.
  5. התאם הלחץ להשיג ~ 3 מ"ל / זרימת דקות.
    הערה: בלחצים גבוהים יגרמו לתנועה של פרוסת רקמות וכן סיום הקלטות אלקטרו.
  6. עבר VNO פרוסה תא הדמיה ולתקן את העמדה פרוסה באמצעות עוגן נירוסטה חוטית עם 0.1 מ"מ עובי syntסיבי hetic (התרשים 2B - C).
    הערה: אין לכסות את פרוסת רקמה עם אחד הנושאים סיבים סינתטיים אלא agarose סביב פרוסה.
  7. העברה לחדר ההדמיה כדי הקלטה להתקנה פרוסה Superfuse ברציפות עם S מחומצן 2 בטמפרטורת החדר באמצעות יישום אמבטיה.
  8. התאם את נימי היניקה אל פני השטח של הפתרון ליצור יניקה איטית חליפין קבועים של פתרון אמבטיה. התאם את "עיפרון זלוף" 8-in-1 רב חבית מעל וקרוב החלק הלא-חושית של הפרוסה VNO המכיל את כלי הדם (איור 2 ג, 3 ​​א) 50. זה יהיה מועיל לארגן עיפרון זלוף פיפטה ההקלטה להיות מול הפרוסה מכיוונים מנוגדים.
  9. חבר אלקטרודה השוואתית ופתרון אמבטיה באמצעות גשר אגר בצורת L (מלא 150 KCl מ"מ).
  10. מלאו פיפטה תיקון עם פיפטה פתרון S 4.
  11. הר פיפטה על האלקטרודה תיקון כסף מצופה כלוריד מחוברת אל במת הראש ללא מקרצף את הציפוי ולצרף בתקיפות.
  12. החל לחץ חיובי קלה (כ 1 מ"ל על מזרק פלסטיק 10 מ"ל) ל פיפטה את התיקון לפני הכניסה לאמבטיה.
  13. מנמיכים את פיפטה לתוך האמבט באמצעות מניפולטורים מיקרו רחוק מספיק כדי להיות מסוגל להטביע את המטרה מבלי להכות אותו (2D איור).
  14. צג התנגדות פיפטה (PIP R, בין 4-7 MΩ) באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה מחובר לשלב את הראש.
    הערה: אם R פיפ <4 MΩ קצה זכוכית שבורה. אם R פיפ> 10 MΩ, קצה יש סתימה ככל הנראה ואת פיפטה חייב להיות מוחלף.
  15. דמיינו את פרוסת VNO עם המצלמה CCD באמצעות התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום אופטימיזציה (DIC) ולזהות תאים FPR-RS3-i-ונוס לבטא (או נוירונים שכותרתו דומה) באמצעות תאורה פלואורסצנטיו קוביית מסנן מתאימה.
  16. פוקוס פלורסנט היעד או תאים שאינם פלורסנט בהתאם לעיצוב ניסיוני.
  17. כדי להתקרב גוף התא, השתמש גלגלי יד רגישות מקסימלית. בשל לחץ חיובי, שקע קטן בקרום סומה תא הופך לגלוי פעם קצה פיפטה נמצא בסמיכות.
  18. שחרר לחץ חיובי להפעיל לחץ שלילי קל למצוץ בקרום התא על מנת להשיג חותם עמידות גבוהה (1-20 GΩ). החל יניקה קצרה ועדינה לשבש את קרום התא ולבסס את תצורת כל התא.
  19. צג התנגדות גישה ללא הרף במהלך הניסוי.
    הערה: רק כולל נוירונים מפגינים התנגדות גישה קטנה ויציבה (≤3% של מכניסה; שינוי <20% במהלך הניסוי) לתוך ניתוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לקבל תובנות לגבי מאפייני biophysical ופיזיולוגיים של אוכלוסיות תאים מוגדר, אנו מבצעים בחתכי רקמה העטרה חריפה של העכבר VNO (איור 1 - 2). לאחר דיסקציה, פרוסות יכולות להישמר פתרון תאי מחומצן קר כקרח (S 2) במשך כמה שעות. בשעה הגדרת הקלטה,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

VNO הוא מבנה chemosensory מאתר semiochemicals. נכון להיום, רוב הקולטנים vomeronasal נותר deorphanized כזוגות קולטן ליגנד רק כמה זוהו. בין אלה, V1rb2 תואר להיות מופעל על-ידי יצרן פרומון 2-heptanone שתן זכר 30, V2rp5 להיות מופעל על ידי ESP1 פרומון ספציפי זכר 57 וכן V2r1b ו V2rf2 כדי להיות מופעלים על ידי פפ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Agarose (low-gelling temperature)PeqLab35-2030
ATP (Mg-ATP)Sigma-AldrichA9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)Sigma-AldrichB9879
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE3889
GlucoseSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Sigma-Aldrich51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333
Potassium hydroxideSigma-Aldrich03564
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sodium hydrogen carbonateSigma-AldrichS5761
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical tools and consumables
Large Petri dish, 90 mmVWRdecapitation, dissection of VNO capsule
Small Petri dish, 35 mmVWRlid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissorFine Science Toolsdecapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissorsFine Science Toolscutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2Fine Science Toolsremoving skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades Fine Science Toolscutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5Fine Science Toolsdissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatulaFine Science Toolshandling agarose block and tissue slices
Surgical scalpelcutting agarose block into pyramidal shape
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AmplifierHEKA ElektronikEPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)Science Products
CCD-cameraLeica MicrosystemsDFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515Leica MicrosystemsI3
Fluorescence lampLeica MicrosystemsEL6000
Hot plate magnetic stirrerSnijders34532
Microforge NarishigeMF-830
Micromanipulator Device Luigs & NeumannSM-5
Micropipette puller, vertical two-stepNarishigePC-10 
MicroscopeLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)Quest Scientific
Objective Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
OscilloscopeTektronikTDS 1001B
Osmometer GonotecOsmomat 030
Perfusion system 8-in-1AutoMate Scientific
pH Meter five easyMettler Toledo
Pipette storage jarWorld Precision Instrumentse212
Recording chamber Luigs & NeumannSlice mini chamber
Razor bladesWilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)custom-made
Stereo microscopeLeica MicrosystemsS4E
Trigger interface HEKA ElektronikTIB-14 S
Vibratome Leica MicrosystemsVT 1000 S
Water bath MemmertWNB 45

References

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience115clampformyl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved