JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Özet

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.

The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Giriş

Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir.

VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ​​ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin.

Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 . Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi.

Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 hafta) kullanıldı. Hiçbir belirgin cinsiyet bağımlı farklılıklar gözlenmiştir.

1. Solüsyon Hazırlama

  1. Hücre-dışı solüsyon S 1 hazırlanması: 4- (2-Hidroksi-etil) -piperazin-1-etansülfonik asit 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, (mM olarak) ihtiva eden hücre-dışı çözelti tamponlu (HEPES); pH = 7.3 (NaOH ile ayarlanır); (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm.
  2. ekstraselüler hazırlayınlar Çözelti 2: karbojen oksijenli (% 95 O2,% 5 CO2) CaCl2, 1 MgSO 4 125 NaCl, 25 (mM olarak) NaHCO 3, 5 KCl, 1 ihtiva eden hücre-dışı çözelti 5 BES; pH = 7.3; (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm.
  3. Doku yerleştirilmesi için% 4 düşük jelleşme sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisi (S3) hazırlayın:% 4 düşük jelleşme sıcaklığı agaroz. 2 g bir manyetik karıştırıcı ile birlikte 100 ml'lik bir cam şişe içinde laboratuar S 1 50 ml agaroz düşük jelleştirme eritin. agaroz eriyik için, yaklaşık 20 dakika boyunca ya da çözelti karıştırılırken saydam hale gelinceye kadar 70 ° C'de (kapağın sıkı bir şekilde kapatılmamış olan) bir su banyosu içinde bir şişe yerleştirin. soğutun ve sonraki kullanıma kadar 42 ° C 'de, ikinci bir su banyosu içinde eritilmiş agaroz tutun.
  4. Hücre-içi solüsyon s, 4 hazırlayın: Pipet çözelti 2 (serbest Ca2 + = 110 nM) 1 EGTA 143 KCI, 2 KOH, 0.3 CaCl, 10 HEPES, 2 MgATP (mM olarak), 1 NaGTP;pH = 7.1 (KOH ile ayarlanmıştır); osmolarite = 290 mOsm.
  5. / Değiştir S 1 kompozisyonunun ayarlanması, bireysel deneysel tasarım (örneğin, farmakolojik blokerler gerilim aktive akımları belirli türleri izole etmek) göre S 2 ve S 4.

2. Çalışma Alanı Hazırlığı

  1. Sıcaklık ve pH ayarlaması ve sürekli oxygenate çözüm için buz üzerinde S 2, en az 30 dakika önce diseksiyon, yer dilim depolama odasını oksijenlendirdikten doldurun.
  2. S 2 ile kayıt ayarları da dilim süperfüzyomu için doldurun ve sürekli oksijen.
  3. Diseksiyon önce S 2 ile vibratome bölmeyi doldurun ve odanın etrafında ezilmiş buz düzenlemek. Alternatif olarak, vibratome odasına odasını oksijene yedek buz oksijenli çözümü transferi ve sürekli oksijenlendirdikten tutun.
  4. cerrahi aletleri ve sarf düzenleyin.
  5. diseksiyon altında buz jel paketi yerleştirinmikroskop, çanak alt donmaya karşı VNO doku önlemek için bir kağıt havlu ile kaplayın.
  6. Kısaca,% 70 etanol ve distile su ile durulama ve vibratome monte temizleyin traş makinesi bıçak. Her dilimleme oturumu için değiştirin.

3. VNO Diseksiyon ve katıştırma

  1. CO 2 ve keskin cerrahi makas kullanarak başını kesmek için kısa maruz bırakılarak hayvan kurban. Not: kritik buz üzerinde VNO kapsülü koyarak hayvan ödün zaman olduğu gibi, en az 2 dk süreyi en aza indirmek. doku canlılığını muhafaza etmek için, en az 30 dakika içinde agaroz de tamamen Dissected VNOs yerleştirin.
  2. Büyük cerrahi makas ile alt çene çıkarın. Ağız boşluğu ile girmek ve ayrı ayrı her tarafında mandibula kemik ve kas kesti.
  3. başaşağı büyük Petri kabındaki başın kalan kısmını yerleştirin.
  4. üst çene ve daha rahat erişmek için orta forseps ile burun ucu çevresindeki deri çekmeyekesici dişler.
  5. Rostral yönde (Şekil 1A) bir ~ 45 ° 'lik açıyla kesici dişlerin en büyük kısmını kesip kemik makas kullanın. Bu burun boşluğundan VNO kapsülün çıkarılması kolaylaştıracaktır.
    Not: VNO kapsülün ucu zarar görmesini önlemek için dişin köküne kesmeyin.
  6. Orta forseps ile rostral kısmında sert üst damak tut ve dikkatli bir düz açı (Şekil 1B) geri tek parça halinde soyun.
    Not: Tekrar tekrar buz gibi soğuk S 2 ile durulayın.
  7. vomer kemik ve çene ucu arasındaki kemik füzyon kesmek için mikro yaylı makas kullanın. VNO kapsüle sol ve sağ taraf yanal hem de küçük adımlar halinde kemiğin kesilmesi dışarıya doğru VNO gelen ve dikkatli bir şekilde işaret ucunun eğri kısmı ile makas ipuçları yerleştirin.
  8. VNO kapsülü çıkarmak için, kaudal kısmında vomer kemiği kesmek için mikro yaylı makas kullanın ve dikkatli n dışarı vomer kemiğini kaldırınorta forseps kullanarak asal boşluğu. Hemen diseksiyon kalan adımlar gerçekleştirilir bir buz jel paketini bir stereo mikroskop altında küçük bir petri tabağına VNO aktarın.
  9. Kurumasını önlemek için doku buz soğukluğunda S 2. Alanın küçük bir miktarda VNO durulayın.
  10. orta forseps ile vomer kemiğin arka kapma VNO yumuşak dokuları ihtiva kıkırdak kapsül ayırın. Her iki VNOs arasındaki bölünmüş (Şekil 1D i) görünür hale gelmesi için dorsal görünümü için kapsül yerleştirin.
  11. Arka kısmında aşağı tuş vomer kemik tutarken merkez kemikten hem kıkırdak VNO kapsülleri ayırmak için ince forseps ucu kullanın.
    Not: Sadece kıkırdak kapsülün RIM forseps kullanın ve narin duyusal epitel kolayca zarar olarak kıkırdak delip için çok dikkatli olun.
  12. İki VNOs ayrılır sonra, köknar encapsulating kıkırdağı kaldırarak başlamakt VNO.
  13. bir ince forseps ile kapsülün üst çemberinin tut ve daha önce vomer kemik (medial tarafı) bağlı olduğu kıkırdak duvar uzak ayrıldı.
  14. kıkırdak çanak alt kavisli yan tarafı ile VNO çevirmek ve güvenli forseps kullanarak bir tarafta kıkırdak aşağı pin kalan kaldırmak için. Dikkatle doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için kıkırdak ve VNO arasında bir çok düz açıyla arka tarafında ikinci ince forseps taşıyın.
  15. Yavaş yavaş duyusal epitel zarar vermemek için, kendi kaudal ucunda tutarak uzak kıkırdaktan VNO soyma.
  16. VNO kapsülden levered sonra, dilimleme işlemi sırasında agaroz çevredeki doku ayırmak olacaktır kıkırdak kalan parçaları olarak kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını kaldırmak için emin olun.
  17. Doku hasarını önlemek için ilk Dissected VNO buz-soğuk 2 küçük bir damla koyun. lateral yan Wil ilgili büyük bir kan damarıl organı hala bozulmamış ve fena halde diseksiyon (Şekil 2A ii) sırasında zarar olmadığını belirten görünür hale gelir. kan damarı hasar var bu durumda, hala sürece genel morfolojisi açıkça düşüklüğüne uğramamış gibi VNO dilimleme ile devam etmek faydalı olacaktır.
  18. Hemen ikinci VNO teşrih.
  19. VNOs yerleştirmek için, erimiş S 3 ağız hem de kültür kaplarına dolgu (42 ° C'de su banyosu içinde depolanmış, 1.3).
  20. duyusal epitel zarar vermemek için ince forseps ile geniş kaudal ucunda VNO tutun.
  21. agaroz VNO daldırın ve ekstrasellüler çözüm filmi yanı sıra yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için ileri geri yatay birkaç kez hareket ettirin.
  22. çanak alt bakan kaudal ucu ile dikey VNO yerleştirin. Bunun yerine, doğrudan forseps ile VNO kısma ait, yakın Proximi forseps ucu hareket ettirerek yönünü ayarlamakVNO için ty.
    Not: Deney sırasında duyusal nöronlar dilim uçağı ve erişilebilirlik belirler olarak gömme sırasında Oryantasyon önemlidir.
  23. jel buz paketi üzerinde yemekleri yerleştirin ve Agaroz katılaşmış kadar bekleyin.
    Not: Agaroz bu çevredeki agaroz doku ayırmak gibi katılaşan başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin.

4. Koronal VNO Doku Dilimleme

  1. Büyük bir Petri kabı kapağının içine küçük çanak agaroz blok kaldırmak için küçük bir spatula kullanın, baş aşağı yukarı bakacak VNO kaudal ipucu bırakarak agaroz çevirin.
  2. cerrahi neşter (ucunda 3-4 mm, altta 8-10 mm) kullanılarak bir piramit şekline blok kesin. Gömülü doku zarar vermemeye özen gösterin.
  3. vibratome numune plakasının merkezine piramit şeklindeki blok düzeltmek ve yapıştırıcı tamamen kurumasını için ~ 1 dakika beklemek zorunda süper yapıştırıcı kullanın.
  4. dilimleme c numune plaka aktarınhamber ve buna bağlı olarak ikinci bir VNO hazırlar. kullanılana kadar 4 ° C, ikinci örnekle plaka tutun.
  5. kalınlığı: Aşağıdaki ayarlara sahip bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın 150-200 mikron; Hız: 3.5 au = 0,15 mm / sn; Frekans: = 75 Hz 7,5 au. kısaca Diseksiyon mikroskobu altında dilim morfolojisi inceledikten sonra kullanıma kadar oxygenating odasına dilim aktarın. Dilimler birkaç saat boyunca muhafaza edilebilir.

5. Tek hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar

  1. kayıtlar için, suya daldırma amaçları, Dodt ya da kızıl ötesi ayırıcı müdahale kontrast (IR DIC) ve epi-floresan gibi soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir dikine duran aşamalı mikroskop kullanımı. veri toplama için bir yama-kelepçe amplifikatör, kafa sahne, AD / DA arayüz kartı ve (kayıt yazılımı dahil) bir PC kullanın.
  2. 10-20 yama pipetler (4-7 MQ) bir stok hazırlayın. borosilikat cam kılcal damarlardan çekme pipetler (1.50 mm OD / 0.86 mm ID) istimalBir Microforge ile ga mikropipet çektirmesi ve yangın lehçe.
    Not: oldukça küçük VSNs yama yaparken Yangın pipet uçları parlatma önemlidir. Bu durum, yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için negatif basınç uygulanırken, hücre zarını önlemek için yararlı olacaktır. Pipet açılışı parlatma sonra yaklaşık 1 mikron olmalıdır.
  3. kullanana kadar hasar ve toz birikmesini önlemek için bir pipet depolama kavanoz pipetler tutun.
  4. çözüm rezervuarları doldurma ve deneysel tasarım göre tüp ile perfüzyon sistemi hazırlayın.
    Not: güçlü elektrofizyolojik kayıtlar engel olacak şekilde tamamen tüp içindeki hava kabarcıklarını çıkarın.
  5. ~ 3 ml / dakika akış elde etmek için basınç ayarlayın.
    Not: Yüksek basınç elektrofizyolojik kayıtlar doku dilim hareketini yanı sıra fesih neden olacaktır.
  6. görüntüleme odasına VNO dilim aktarın ve 0.1 mm kalınlığında synt ile kablolu paslanmaz çelik çapa kullanarak dilim pozisyonunu düzeltmekinfographie lifler (Şekil 2B - C).
    Not: sentetik elyaf ipliklerin biri değil dilim çevreleyen agaroz ile doku dilim örtmeyin.
  7. Banyo uygulaması aracılığıyla oda sıcaklığında oksijenli S 2 ile kurulum ve sürekli Superfuse dilim kayıt Transfer görüntüleme odası.
  8. Banyo çözeltisinin sürekli bir değişim için yavaş bir emme oluşturmak için çözeltinin yüzeyine emme kılcal ayarlayın. 8-in-1 çoklu varil "perfüzyon kalem" yukarıda ve kan damarı (Şekil 2C, 3A) 50 içeren VNO dilim olmayan duyusal kısmına yakın ayarlayın. Zıt yönlerde gelen dilim dönük olması perfüzyon kalem ve kayıt pipet düzenlemek için yararlı olacaktır.
  9. Referans elektrodu ve (150 mM KCI ile dolu), L-şeklinde bir agar köprü kullanılarak banyo çözeltisi bağlayın.
  10. Pipet çözüm S 4 ile yama pipet doldurun.
  11. kaplama kapalı kazıma olmadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı yama elektrot üzerinde pipet montaj ve sıkıca takın.
  12. hafif pozitif basınç uygulayın (yaklaşık 10 ml plastik şırınga 1 ml) banyo girmeden önce yama pipet.
  13. (Şekil 2B) onu vurmadan hedefi batığın edebilmek için yeterince mikro manipülatörler kullanarak banyoya pipet indirin.
  14. Baş aşamasına bağlı elektrofizyoloji yazılımı kullanarak (4-7 MQ arasında R pip) pipet direnci izleyin.
    Not: R pip ise <4 MQ cam ucu kırıldı. R pip> 10 M? Ise, uç büyük ihtimalle tıkalı ve pipet değiştirilmesi gerekir.
  15. Kızılötesi optimize edilmiş diferansiyel girişim kontrast (DIC) kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilim görselleştirmek ve floresan aydınlatma kullanılarak FPR-RS3-i Venüs (benzer etiketli nöronların veya) hücreleri ifade eden tanımlamakve uygun bir filtre küpü.
  16. Odak ve hedef floresan veya floresan olmayan hücrelerin deneysel tasarım bağlı.
  17. hücre gövdesi yaklaşmak için, maksimum duyarlılık el tekerlekleri kullanın. Pipet yakın olduğunu bir kez pozitif basınç nedeniyle, hücre soma zarında küçük bir göçük görünür hale gelir.
  18. pozitif basınç bırakın ve yüksek direnç mühür (1-20 GΩ) elde etmek için, hücre zarındaki emmek için hafif negatif basınç uygulayın. hücre zarı bozar ve tam hücreli yapılandırmasını kurmak için kısa ve nazik vakum uygulayın.
  19. deney sırasında sürekli erişim direnci izleyin.
    Not: Sadece küçük ve istikrarlı bir erişim direnci sergileyen nöronlar (R girişinin ≤3%; değişimi

Sonuçlar

Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) 'de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağ...

Tartışmalar

VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. resept?...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Agarose (low-gelling temperature)PeqLab35-2030
ATP (Mg-ATP)Sigma-AldrichA9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)Sigma-AldrichB9879
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE3889
GlucoseSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Sigma-Aldrich51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333
Potassium hydroxideSigma-Aldrich03564
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sodium hydrogen carbonateSigma-AldrichS5761
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical tools and consumables
Large Petri dish, 90 mmVWRdecapitation, dissection of VNO capsule
Small Petri dish, 35 mmVWRlid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissorFine Science Toolsdecapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissorsFine Science Toolscutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2Fine Science Toolsremoving skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades Fine Science Toolscutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5Fine Science Toolsdissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatulaFine Science Toolshandling agarose block and tissue slices
Surgical scalpelcutting agarose block into pyramidal shape
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AmplifierHEKA ElektronikEPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)Science Products
CCD-cameraLeica MicrosystemsDFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515Leica MicrosystemsI3
Fluorescence lampLeica MicrosystemsEL6000
Hot plate magnetic stirrerSnijders34532
Microforge NarishigeMF-830
Micromanipulator Device Luigs & NeumannSM-5
Micropipette puller, vertical two-stepNarishigePC-10 
MicroscopeLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)Quest Scientific
Objective Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
OscilloscopeTektronikTDS 1001B
Osmometer GonotecOsmomat 030
Perfusion system 8-in-1AutoMate Scientific
pH Meter five easyMettler Toledo
Pipette storage jarWorld Precision Instrumentse212
Recording chamber Luigs & NeumannSlice mini chamber
Razor bladesWilkinson Sword GmbHWilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)custom-made
Stereo microscopeLeica MicrosystemsS4E
Trigger interface HEKA ElektronikTIB-14 S
Vibratome Leica MicrosystemsVT 1000 S
Water bath MemmertWNB 45

Referanslar

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 115Vomeronazal organkoku almaakut dilim haz rl kpatch kelep eelektrofizyolojiduyusal n ronlarformil peptid resept r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır