Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Abstract

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

Introduction

אבחון טרום לידתי הוא כלי קליני חשוב להעריך מחלות גנטיות (סטיות כרומוזומליות כלומר, monogenetic או polygenetic / מחל מולטיפקטוריאלית) ו מומים מולדים (כלומר מולד בקע סרעפתי, נגעי ריאות פיברוזיס, exomphalos, gastroschisis). מי שפיר (AF) תאים הם פשוט להשיג מנהלים מתוכננים באופן שגרתי במהלך השליש השני של הריון (כלומר מי שפיר ו amnioreduction) או ניתוחים קיסריים 1, 2. הזמינות של תאי AF מחולים טרום לידתי או בילוד מספק את האפשרות של שימוש מקור זה עבור רפואה רגנרטיבית, וכמה החוקרים בדקו את האפשרות לטיפול נזקים ברקמות שונות או מחלות באמצעות האוכלוסייה בתאי גזע שבודדו 3 AF, 4, 5, 67, 8, 9, 10, 11, 12. האפשרות של קבלה בקלות תאי AF מחולים חולים, בחלון הזמן בו המחלה היא לעתים קרובות נייחת, פותחת את הדרך אל הרעיון של שימוש מקור התא הזה למטרות תכנות מחדש. ואכן, גזע מושר (iPS) תאים שמקורם בתאי AF יכולים להיות מובחנים בתאים של ריבית עבור בדיקות סמים במבחנה או גישות הנדסת רקמות, כדי להכין טיפול למטופל ספציפי נאות לפני הלידה. מחקרים רבים כבר הוכיחו את יכולתם של תאי AF כדי לתכנת מחדש בדיל לתוך מגוון רחב של סוגי תאי 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

מאז גילויו על ידי טקהאשי יאמאנאקה 28 תאים סומטיים לתכנות מחדש דרך הביטוי הכפוי של ארבעה גורמי שעתוק (Oct4, Sox2, cMyc ו Klf4), הושג התקדמות בתחום של תכנות מחדש. בהתחשב בשיטות שונות, אנו יכולים להבחין בין גישות ויראלי ולא ויראלי. הראשון מצפה השימוש של וקטורים ויראליים (רטרווירוסים ו lentiviruses), אשר יש יעילות גבוהה, אך בדרך כלל השתקה שלמה של transgene retroviral, הוא עם התוצאה של שורת תאים לתכנות מחדש באופן חלקי את הסיכוןinsertional mutagenesis 29, 30, 31. השיטה הלא-ויראלי משתמשת באסטרטגיות שונות: פלסמידים כלומר, וקטורים, mRNA, חלבון, transposons. על הגזרה של תאי iPS ללא רצפים מהונדסים שואפת לעקוף את השפעות מזיקי ביטוי transgene דולף mutagenesis insertional. בין כל האסטרטגיות הלא-ויראלי הנ"ל, את PiggyBac (PB) מערכת transposon / transposase דורשת חוזרת מסוף ההפוך רק חובק transgene ו ביטוי חולף של אנזים transposase לזרז אירועי כניסה או כריתה 32. היתרון בשימוש transposons על פני שיטות אחרות לייצור תאי שב"ס הוא האפשרות לקבל תאי iPS ללא וקטור עם גישת וקטור שאינו ויראלי שמראה אותה היעילות של וקטורי retroviral. זה אפשרי על ידי כריתת עקבות-פחות של קידוד transposon המשולב עבור reprogramming גורמים הבאים ביטוי חולף חדש של transposase בתאי שב"ס 33. בהתחשב בכך PB הוא יעיל בסוגי תאים שונים 34, 35, 36, 37, הוא מתאים יותר עבור גישה קלינית ביחס וקטורים ויראליים, ומאפשר את ייצור תאי iPS ללא קסנו בניגוד פרוטוקולי ייצור ויראלי הנוכחיים משתמשות xenobiotic תנאים, מערכת זו משמשת להשיג תאי שב"ס מן בעכברים AF.

כאן אנו מציעים פרוטוקול מפורט לאחר עבודה שכבר פורסם להראות לייצור שיבוטי שב"ס פלוריפוטנטיים מתאי AF עכבר (תאי iPS-AF) 38.

Protocol

כל הנהלים היו בהתאם לחוק האיטלקי. דגימות Murine AF נבצרו מעכברים בהריון 13.5 ימים לאחר coitum (DPC) מ C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J עכברים בשם GFP.

1. ייצור transposon

הערה: וקטורי ביטוי transposon נוצרו באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים. ה- DNA פלסמיד עבור transfection בתאי עכבר AF הוכן באמצעות ערכות מסחריות.

  1. מערבבים 10 ng של DNA פלסמיד עם 50 μl של חיידקים DH5α צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. דגירת צינור microcentrifuge על קרח למשך 20 דקות.
  2. הלם חום על 42 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות.
  3. מניחים צינור microcentrifuge על קרח במשך 2 דקות.
  4. הוסף 250 μl של טרום התחמם (37 ° C) lysogeny מרק (LB) מרק. Shake (300 סל"ד) בשעה 37 ° C למשך 30 דקות.
  5. מורחים 30 μl של כל שינוי לצלחות LB עם 0.1 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין. אפשר הצלחות להתייבש דגירה הפוכה ב 37 ° C overnight.
  6. למחרת, בשעות אחר הצהריים, לקחת 3 מושבות, באמצעות סטרילי 200 טיפים μl, מכל שינוי ולהעביר על 0.1 מ"ג / אמפר מ"ל LB.
  7. Shake (300 סל"ד) חיידקים לילה בשעה 37 ° C.
  8. עבור טיהור פלסמיד לשימוש ערכות מסחריות. פלסמידים המניה ב -20 ° C.

2. פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תרבות

  1. ציפוי של צלחות 6-היטב עם ג'לטין 0.1%
    1. מעיל צלחות מתחת למכסה המנוע הוספת 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין סטרילי כל אחד מששת בארות. תנו ג'לטין לפלמר על אינקובטור (37 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1.
    2. מחק את העודף, ולייבש את הצלחות במשך שעה 1.
    3. השתמש parafilm לאטום וצלחות ולאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. איון של MEF עם mitomycin C
    1. להפשיר בקבוקון של 4 x 10 6 תאים MEF באמצעות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס.
    2. זרעי MEF בשכונה על צלחת פטרי (150 מ"מ) עם מדיום MEF.
    3. טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    4. (זהירות) הוסף C mitomycin (5 מ"ג / מ"ל) כשתאים ומחוברות.
    5. המקום התאים לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) למשך 3 שעות.
    6. הסר בינוני עם mitomycin ג לשטוף תאים שלוש פעמים עם חיץ מלוחים פוספט 1x (PBS).
    7. הוסף 2 מ"ל של תאים טריפסין ומקום מסחרי לתוך 37 ° C חממה במשך 5 דקות. לאחר, להוסיף 18 מ"ל של חסימת בינוני כדי לעצור את התגובה טריפסין.
    8. ספירת התאים באמצעות תא'שודד גופות' על פי הפרוטוקול של היצרן.
    9. תאי צנטריפוגה ב 145 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant.
    10. זרע 60,000 תאים / 2 ס"מ של MEF מומת על צלחות מצופה ג'לטין 0.1%.
    11. טפחו את התאים למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לפני זריעת AF ו / או תאי iPS-AF.

3. בידוד תא עכבר AF

  1. הגדרת הזדווגויות מתוזמן ולבדוק plu הנרתיקgs אחרי 24 שעות של דיור שיתוף.
  2. שימו לב עד 13.5 DPC ולהקריב הסכר בהריון באמצעות פריקה צוואר הרחם.
  3. נקה את דופן הבטן של החיה באמצעות אתנול 70%.
  4. בעזרת מספריים, לבצע פיום בטן קו האמצע חריטה אורך של דופן הבטן כדי לקבל גישה אל תוך חלל הבטן.
  5. לחשוף את הרחם באמצעות מלקחיים. הסר את הרחם באמצעות מספריים ולהעביר לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ מלא סטרילי 1x PBS ממוקם על הקרח.
  6. השתמש stereomicroscope כדי לאסוף את AF בהגדלה 10X.
  7. החזק את הרחם עם מלקחיים ולהסיר את דופן הרחם במספריים. היזהר, כדי למנוע כל נזק ממברנות העובר דליפת מי שפיר הסוגר.
  8. אסוף עוברים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ מלא PBS 1x סטרילי ומניחים על קרח.
  9. אחוז השליה של עובר אחד עם מלקחי נקודה משובחים ומניחה בצלחת פטרי 100 מ"מימ נקיה.
  10. הסר את שק חלמון באמצעות מלקחיים נקודת בסדר.
  11. לשבש את amnion באמצעות מלקחיים בסדר נקודה ולאסוף 30 μl של AF לכל עובר באמצעות מזרק אינסולין לתוך בקבוקון חרוטי 15 מיליליטר.
  12. לאחר איסוף AF, לשטוף כל עובר עם PBS 1x סטרילי השלים עם 1% בסרום שור עוברי (FBS) ולאסוף לתוך 15 מיליליטר צינור חרוטים המכיל את AF.
  13. צנטריפוגה AF ב 145 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant מתחת למכסה המנוע וזרעי התאים AF pelleted.

4. תרבית תאי העכבר AF

  1. זריעה של תאי AF העכבר
    1. יום אחד לפני הזריעה, להכין צלחת 0.1% ג'לטין מצופה 6-גם עם mitomycin C שטופל MEF.
    2. לאחר איסוף AF, זרע התאים המתקבלים דיקור מי שפיר (כ 1 x 10 7 תאים המתקבלים 6 עובר) על MEF mitotically מומת באמצעות מדיום תרבות AF.
    3. טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, שינוי המדיום פעם ביומיים.
    4. לאחר 7 ימים של תרבות, טרנסתאי AF fect הנוהל המתואר להלן.

5. Transfection, נייד דור שב"ס-AF ותרבות

הערה: תאי AF העכבר היו transfected עם הפלסמיד transposon PB-tetO2-IRES-OKMS, בשיתוף עם פלסמיד ביטוי transposase (mPBase) ועם transactivator טטרציקלין ההפוך (PB-CAG-rtTA) פלסמיד transposon. כל פלסמידים נמסרו על ידי פרופ 'אנדרש Nagy 33.

  1. מערבבים 1 מיקרוגרם של PB-tetO2-IRES-OKMS עם 0.5 מיקרוגרם של mPBase ו -0.5 מיקרוגרם של PB-CAG-rtTA (DNA סה"כ: 2 מיקרוגרם) בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  2. לדלל את ה- DNA עד 100 μL עם סרום ללא בינוני (Medium הנשר שונה של Dulbecco - DMEM).
  3. הוסף 8 μL של מגיב transfection (למשל, Fugene) (לפי יחס של DNA פלסמיד: סוכן transfection של 2 מיקרוגרם (DNA) לסוכן transfection 8 μL) לתוך DNA המכיל צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
  4. דגירה תערובת מגיב transfection / DNA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הוסף dropwise 100 μL של התערובת transfection מגיב / DNA לכל היטב צלחת 6-היטב עם תאים AF העכבר ולהפיץ ידי מתערבל עדין, עם נפח סופי של 2 מ"ל / היטב. השאר למשך 24 שעות.
  6. למחרת, להשרות את הביטוי של גורמים של יאמאנאקה (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) על ידי האכלה התאים עם מדיום חדש שב"ס-AF השלימו עם 1.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של דוקסיציקלין (2 מ"ל של התקשורת לכל היטב).
  7. Feed תאים בכל יום, ללא מעבר, עם מדיום המכיל-DOX טרי (לשמור תאי תקשורת השלימה עם דוקסיציקלין עד נקודת 5.13).
  8. שימו לב תאים בתוך 24 שעות עבור ביטוי mCherry ויומיומי עבור היווצרות המושבה (מושבות מופיעות בדרך כלל בין 20 ל -30 ימים לאחר transfection).
  9. יום אחד לפני הקטיף המושבה, להכין צלחת בתרבית רקמה 96-היטב עם mitomycin C שטופלו MEF.
  10. פיק מושבות יחידות 50 μL של usin נפחפיפטה ga 200 μL, ולהעבירם ברצף לתוך צלחת 96-גם בבארות בודדות.
  11. למחרת, לנתק כל מושבה לתוך תאים בודדים על ידי הוספת 50 μl של טריפסין המסחרי ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  12. פיפטה מעלה ומטה כדי disaggregate המושבה.
  13. העברת 50 μL של טריפסין המכיל המושבה ניתקה לתוך באר חדשה עם MEF מומת על ג'לטין 0.1% מצופים 96 היטב צלחת מלאה 100 μL של מדיום שב"ס-AF הטרי בתוספת דוקסיציקלין.
  14. כאשר התאים מגיעים 60-70 מפגש%, לפצל לתוך באר של צלחת 24 באר.
  15. כאשר התאים מגיעים 60-70 מפגש%, לפצל 1: 2 עד שתי בארות, אחד עם דוקסיציקלין והשני ללא דוקסיציקלין, כדי לוודא אם המושבות מופיעים גם במצב ללא דוקסיציקלין.
  16. המשך לשמור על שיבוטי שב"ס-AF, דוקסיציקלין עצמאי, על MEF מומת במדיום שב"ס-AF.
  17. טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, פרקanging בינוני יומי.

6. אלקליין phosphatase מכתים

  1. בצע מכתים phosphatase אלקליין הבא של פרוטוקול היצרן בכל פעם שיש ההופעה העצמאי דוקסיציקלין תאי iPS-AF.

7. Immunofluorescence

  1. בכל פעם שיש הופעת עצמאית דוקסיציקלין שב"ס-AF תאים, זרע 150,000 תאים / 2 ס"מ על באר של צלחת 24 גם עם MEF מומת, ולגדול תאים עבור 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. (זהירות) תקן את התאים על ידי הוספת 300 μl לכל גם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוספת 300 μl של 0.1% NP-40 permeabilize תאים.
  4. יש לשטוף את התאים עם 300 μl של 0.1% PBS-Tween 20.
  5. הוספת 300 μl של חיץ החסימה (סרום סוס 10% ב 1x PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  6. השתמש נוגדנים העיקריים הבאים: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (01:100) ו SSEA1 (1:80). לדלל SSEA1 עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 10% בסרום עז נורמלי, 0.3 מ 'גליצין ב 0.1% PBS-Tween-20. לדלל כל נוגדנים אחרים עם סרום סוס 10% ב 1x PBS.
  7. דגירת נוגדני הלילה ב 4 ° C..
  8. לשטוף עם 300 μl של 0.1% PBS-Tween-20.
  9. השתמש נוגדנים משני מדולל סרום סוס 10% ב 1x PBS: Alexa594 מצומדות עז נגד העכבר IgG (1: 200), Alexa594 מצומדות IgG נגד עז עוף (1: 200), IgG נגד ארנב עוף Alexa594 מצומדות (1: 200), Alexa568 מצומדות עז נגד העכבר IgM (1: 200). דגירה של 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. לשטוף עם 1x PBS.
  11. גרעיני כתם עם פתרון Hoechst (1: 10,000) ב- PBS 1x.

8. התמיינות תאים במבחנה

  1. כדי ליצור תלויים גופי embryoid ירידה (EBS), לטפח טיפות יחידות (2,000 תאים / 20 μl) על המכסה של צלחות פטרי, באמצעות מדיום הבידול.
  2. דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוסו 5% CO 2 למשך 4 ימים.
  3. העבר EBS לתוך 100 מ"מ צלחות חיידקי כיתה בתרבות ההשעיה למשך 3 ימים במדיום בידול.
  4. EBS פלייט 24 היטב הצלחות מצופות מטריצת קרום במרתף (בדילול 1:10 ב DMEM) במשך 14 ימים נוספים.
  5. עבור immunofluorescence מנתח, השתמש נוגדנים ראשוניים: T (1: 100), αfp (1: 200) ו Tubb3 (1: 500) 37.

9. גיבוש in vivo teratoma

  1. להזריק 100 μl של PBS 1x המכיל 1 x 10 6 תאים iPS-AF לתוך השריר של hindlimb של Rag2 - / - γc - / - עכברים.
  2. קורבן עכברים באמצעות נקע בצוואר רחם 6 שבועות לאחר הזרקת תא.
  3. הסר את המוני גידול, מאופיינים גודלם, מן hindlimb של העכברים עבור הניתוחים שלאחר מכן.
  4. חותכי 7-10 מיקרומטר חלקים רוחביים עבים של הגידול איזופנטאן בהקפאה באמצעות cryostat.
  5. לקבלת Haematoxylinכתם ד Eosin (HE):
    1. כתם עם HE להעריך את רכב רקמת גידול, בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
  6. לקבלת כתם אימונו:
    1. תקן סעיפים teratoma עם 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. Permeabilize עם 0.1% Triton X-100.
  7. דגירה עם נוגדנים הבאים: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) ו αSMA (1: 100) מדולל BSA 1% ב 1x PBS. דגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C (Tubb3) או לילה ב 4 ° C (עבור נוגדנים אחרים).
  8. peroxidase בלוק באמצעות מתנול 100% במשך 20 דקות.
  9. דגירה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם HRP-מצומדות אנטי עכבר נוגדנים משני (1: 150).
  10. לשטוף עם 1x PBS.
  11. דגירה עם מצע peroxidase (HRP) (ראה לוח חומרים) במשך 5 דקות.
  12. יש לשטוף במי ברז במשך 5 דקות.
  13. הכתם עם Haematoxylin QS עבור 9 שניות.
  14. יש לשטוף במי ברז.

הפקת RNA 10. מתאי

  1. השתמש ערכת חילוץ מסחרית RNA לפי הפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן.

הפקת RNA 11. מן teratoma

  1. Homogenize teratoma באמצעות עלי וחנקן מרגמה הנוזלי כדי למנוע הפשרת המדגם.
  2. לשקול 25 מ"ג של רקמת גוף.
  3. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט מסחריים להפקת RNA ו -200 μL של כלורופורם.
  4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  5. צנטריפוגה ב 13,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. מעבירים את supernatant פינה לצינור חדש.
  7. כדי לטהר את RNA להשתמש ערכת חילוץ מסחרי RNA על פי פרוטוקול של היצרן.

ניתוח תגובת שרשרת 12. הפוך תמלול-פולימראז

  1. לסנתז את cDNA הראשון גדיל באמצעות transcriptase הפוכה עבור שעתוק לאחור (RT) תגובת שרשרת -polymerase (PCR) אוליגו (DT) אקורדינג פרוטוקול של היצרן, כדי להשיג 50 ng / μL של cDNA. לדלל cDNA עם מים RNase ללא בריכוז של 10 ng / μL.
  2. בצע RT-PCR באמצעות פולימראז ה- DNA על פי פרוטוקול של היצרן, ניצול 1 ng / μL של cDNA.

תוצאות

כדי להעריך את היכולת של תכנות מחדש, בתאי עכבר AF נאספו מעוברים של עכברים GFP. התאים היו transfected עם הפלסמיד transposon עגול PB-tetO2-IRES-OKMS, המבטא את הגורמים יאמאנאקה (Oct4, Sox2, cMyc ו Klf4) צמוד חלבון פלואורסצנטי mCherry באופן דוקסיציקלין-מושרה, הפוכה transactivator טטרציקלין (PB- CAG-rt...

Discussion

השיטה שנבחרה כדי להשיג את האינדוקציה של pluripotency רלוונטית לבטיחות קלינית תא ביחס השתלה לטווח ארוכה. כיום, קיימות מספר שיטות מתאימות תכנות מחדש. בין השיטות הלא-אינטגרטיבי יותר, ויראלי סנדאי (SEV) הווקטור הוא וירוס RNA אשר יכול לייצר כמויות גדולות של חלבון ללא להשתלב בגרעין ...

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol SigmaM6250For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit Sigma85L1Alkaline Phosphatase  staining
AmpicillinSigmaA0166For bacterial selection
Bovine Serum Albumin SigmaA7906BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1X
ChloroformSigmaC2432For RNA extraction
DH5α cellsThermo Fisher Scientific18265-017Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline SigmaD9891For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Sarstedt 72.706For PB production 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106For MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolation
GelatinJ.T.Baker131Used 0.1%, diluted in PBS 1X
GlycineBio-Rad161-0718For blocking solution. Diluted in PBS 1X
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010Histological analysis of teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detection
Horse Serum Thermo Fisher Scientific16050-122For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25G)TerumoSS+01H25161Amniocentesis procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox)SigmaL3022For bacterial growth
LIF SigmaL5158For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel BD354234For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plateBD Falcon353047For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plateBD Falcon353046For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids SigmaM7145For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000For blocking solution. Diluted in PBS 1X
NP-40Sigma12087-87-0For cell permeabilization. Diluted in PBS 1X
Oct4SantaCruzsc-5279Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution)Sigma441244PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10XThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1X
Penicillin - Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150mm)BD Falcon353025For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidProvided by professor Andras Nagy laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134For RNA extraction
Sox2 SantaCruzsc-17320Goat polyclonal IgG
SSEA1 Abcamab16285Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific18064-014For RT-PCR
T Abcamab20680Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Cell culture passaging
Triton X-100Bio-Rad161-047For cell permeabilization, diluted in PBS 1X
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596-026For RNA extraction
Tubb3  Promega G712AMouse monoclonal IgG1
TWEEN-20SigmaP1379For cell permeabilization, diluted in PBS 1X
αfp   R&D SystemsMAB1368Mouse Monoclonal IgG1
αSMA Abcamab7817Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD)Promega E2311For AF cells transfection
StereomicroscopeNikonSM2645To perform amniocentesis 
200 ul tipsSarstedt 70.760012To pick bacteria colonies
ScissorF.S.T14094-11 stainless 25UTo perform amniocentesis 
EthanolSigma2860To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm) BD Falcon353025For MEF expansion
Mitomycin CSigmaM4287-2MGFor MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plateBD Falcon353071For iPS-AF culture

References

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147 (2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87 (2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389 (2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855 (2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

120transposon PiggyBac

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved