JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Abstract

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

Introduzione

La diagnosi prenatale è un importante strumento clinico per valutare le malattie genetiche (cioè aberrazioni cromosomiche, malattie monogeniche o poligeniche / multifattoriale) e malformazioni congenite (cioè ernia diaframmatica congenita, lesioni polmonari cistiche, onfalocele, gastroschisi). Il liquido amniotico (AF), le cellule sono semplici da ottenere dalle procedure di routine in programma durante il secondo trimestre di gravidanza (cioè l'amniocentesi e amnioreduction) o parti cesarei 1, 2. La disponibilità di cellule da pazienti AF prenatale o neonatale fornisce la possibilità di utilizzare questa fonte per la medicina rigenerativa, e diversi ricercatori studiato la possibilità di trattare diversi danni tissutali o malattie utilizzando una popolazione di cellule staminali isolate da AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilità di ottenere facilmente cellule AF di pazienti malati, in una finestra temporale in cui la malattia è spesso stazionario, apre la strada per l'idea di utilizzare questa fonte di cellule per scopi di riprogrammazione. Infatti, staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule derivate da cellule AF potrebbero essere differenziate nelle cellule di interesse per i test in vitro di droga o per gli approcci di ingegneria dei tessuti, al fine di preparare una adeguata terapia specifica per il paziente prima del parto. Molti studi hanno già dimostrato la capacità delle cellule AF da riprogrammare e differenziato in una vasta gamma di tipi di cellule 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Dal momento che la scoperta da Takahashi e Yamanaka 28 di riprogrammazione delle cellule somatiche attraverso l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4), sono stati compiuti progressi nel campo della riprogrammazione. Considerando i diversi metodi, possiamo distinguere tra approcci virali e non virali. Il primo si aspetta l'utilizzo di vettori virali (retrovirus e lentivirus), che hanno elevata efficienza, ma silenziamento solito incompleta del transgene retrovirale, sia con la conseguenza di una linea cellulare parzialmente riprogrammato e il rischio diinserzionale mutagenesi 29, 30, 31. Il metodo non virale utilizza diverse strategie: cioè plasmidi, vettori, mRNA, proteine, trasposoni. La derivazione di cellule iPS liberi di sequenze transgeniche ha lo scopo di aggirare gli effetti potenzialmente nocivi di espressione del transgene che perde e mutagenesi inserzionale. Tra tutte le strategie non virali di cui sopra, il piggyBac (PB) Sistema di trasposoni / trasposasi richiede solo le ripetizioni terminali invertite che fiancheggiano un transgene ed espressione transitoria dell'enzima trasposasi di catalizzare l'inserimento o escissione eventi 32. Il vantaggio nell'uso trasposoni rispetto ad altri metodi per la generazione di cellule iPS è la possibilità di ottenere cellule iPS privo di vettore con un approccio vettore non virale che mostra la stessa efficienza di vettori retrovirali. Ciò è possibile mediante escissione traccia meno della codifica trasposone integrato per la reprogramming fattori a seguito di una nuova espressione transitoria del trasposasi nelle cellule iPS 33. Dato che PB è efficiente in diversi tipi cellulari 34, 35, 36, 37, è più adatto per un approccio clinico rispetto ai vettori virali, e consente la produzione di cellule iPS libera-xeno contrariamente a protocolli di produzione virali correnti che utilizzano xenobiotico condizioni, questo sistema viene utilizzato per ottenere cellule iPS da murino AF.

Di seguito vi proponiamo un protocollo dettagliato seguenti lavori già pubblicati per mostrare la produzione di iPS pluripotenti cloni di cellule di topo AF (cellule iPS-AF) 38.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutte le procedure erano in conformità con la legge italiana. campioni murini AF sono state raccolte dai topi in gravidanza a 13,5 giorni dopo coitum (DPC) da C57BL / 6-Tg topi (UBC-GFP) 30Scha / J chiamato GFP.

1. Transposon Produzione

NOTA: vettori di espressione trasposoni sono stati generati utilizzando le procedure di clonazione standard. Il DNA plasmidico per il mouse AF cellule trasfezione è stato preparato utilizzando kit commerciali.

  1. Mescolare 10 ng di DNA plasmidico con 50 ml di batteri DH5α in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare la provetta in ghiaccio per 20 min.
  2. scossa di calore a 42 ° C per 40 sec.
  3. Mettere provetta in ghiaccio per 2 minuti.
  4. Aggiungere 250 ml di brodo di pre-riscaldato (C 37 °) brodo lisogenia (LB). Agitare (300 rpm) a 37 ° C per 30 min.
  5. Distribuire 30 ml di ogni trasformazione su piastre LB con 0,1 mg / ml di ampicillina. Lasciare le piastre a secco e incubare invertiti a 37 ° C overnight.
  6. Il giorno dopo, nel pomeriggio, prendere 3 colonie, utilizzando sterili 200 microlitri punte, da ogni trasformazione e trasferimento su 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Agitare batteri (300 rpm) durante la notte a 37 ° C.
  8. Per la depurazione plasmide utilizzare kit commerciali. plasmidi stock a -20 ° C.

2. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Cultura

  1. Rivestimenti dei 6 pozzetti con 0,1% di gelatina
    1. piastre Coat sotto il cofano aggiungendo 1 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina a ciascuna delle sei pozzetti. Sia la gelatina polimerizzare sulla incubatore (37 ° C) per 1 ora.
    2. Eliminare l'eccesso, e asciugare le piastre per 1 ora.
    3. Utilizzare parafilm per sigillare e piastre di conservare a temperatura ambiente.
  2. L'inattivazione del MEF con Mitomicina C
    1. Scongelare una fiala di 4 x 10 6 cellule MEF utilizzando una C vasca 37 °.
    2. Seme MEF nella cappa su una piastra di Petri (150 mm) con il mezzo MEF.
    3. Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
    4. (ATTENZIONE) Aggiungere mitomicina C (5 mg / ml) quando le cellule sono confluenti.
    5. Cellule posto in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 3 ore.
    6. Rimuovere media con cellule mitomicina C. Lavare tre volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
    7. Aggiungere 2 ml di cellule tripsina e luogo commerciale nel 37 ° C incubatore per 5 min. Dopo, aggiungere 18 ml di blocco mezzo per arrestare la reazione tripsina.
    8. Contare le cellule utilizzando una camera di Burker secondo il protocollo del produttore.
    9. cellule centrifugare a 145 xg per 5 min. Eliminare il surnatante.
    10. Seme 60.000 cellule / cm 2 di inattivato MEF su 0,1% piastre rivestite di gelatina.
    11. Coltivare cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2, prima della semina AF e / o cellule iPS-AF.

L'isolamento delle cellule 3. mouse AF

  1. Impostare accoppiamenti a tempo e verificare plu vaginalegs dopo 24 ore di co-housing.
  2. Osservare fino a 13,5 DPC e sacrificare diga incinta attraverso dislocazione cervicale.
  3. Pulire la parete addominale dell'animale utilizzando il 70% di etanolo.
  4. Utilizzando le forbici, eseguire una laparotomia mediana incisione della lunghezza della parete addominale per accedere nella cavità addominale.
  5. Esporre l'utero con pinze. Rimuovere l'utero con le forbici e il trasferimento in un piatto da 100 millimetri di Petri piena di sterile PBS 1x posto sul ghiaccio.
  6. Utilizzare uno stereomicroscopio per raccogliere l'AF a 10X di ingrandimento.
  7. Tenere l'utero con una pinza e rimuovere la parete uterina con le forbici. Fare attenzione a non danneggiare le membrane fetali e conseguente perdita di liquido amniotico.
  8. Raccogliere feti in una capsula di Petri 100 millimetri pieno di sterili 1x PBS e disporli sul ghiaccio.
  9. Afferrare la placenta di un feto con una pinza sottile punti e posto in un ambiente pulito 100 millimetri piastra Petri.
  10. Rimuovere il sacco vitellino con pinze punta fine.
  11. disturbare la membrana amniotica con pinze punta fine e raccogliere 30 ml di AF per ogni feto utilizzando una siringa da insulina in un flacone da 15 ml conica.
  12. Dopo la raccolta AF, lavare ogni feto con sterile 1x PBS integrato con siero fetale bovino 1% (FBS) e raccogliere nei tubo da 15 ml contenente l'AF.
  13. Centrifugare AF a 145 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante sotto il cofano e seminare le cellule AF pellet.

4. mouse AF Cell Culture

  1. Semina di cellule di topo AF
    1. Un giorno prima della semina, preparare un 6-pozzetti di gelatina rivestite 0,1% con mitomicina C trattati con MEF.
    2. Dopo la raccolta AF, seminare le cellule ottenute da una amniocentesi (circa 1 x 10 7 cellule ottenute da feti 6) sul mitoticamente inattivato MEF utilizzando terreno di coltura AF.
    3. Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2, cambiando il mezzo ogni altro giorno.
    4. Dopo 7 giorni di coltura, transcellule fetto AF seguendo la procedura descritta di seguito.

5. Transfection, iPS-AF cellulare Generation e cultura

NOTA: cellule mouse AF sono state trasfettate con il plasmide trasposone PB-tetO2-IRES-OKMS, in combinazione con un plasmide di espressione trasposasi (mPBase) e con il transattivatore inverso tetraciclina trasposone plasmide (PB-CAG-rtTA). Tutti i plasmidi sono stati forniti dal professor Andras Nagy 33.

  1. Mescolare 1 mg di PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 mg di mPBase e 0,5 mg di PB-CAG-rtTA (DNA totale: 2 mg) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Diluire il DNA di 100 ml con terreno privo di siero (Dulbecco Modified Eagle Medium - DMEM).
  3. Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione (ad esempio, Fugene) (nel rapporto di DNA plasmidico: agente trasfezione di 2 mg (DNA) all'agente trasfezione 8 mL) nel DNA contenente 1,5 mL provetta.
  4. Incubare trasfezione miscela reagente / DNA per 15 min a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere goccia a goccia 100 ml della miscela di trasfezione reagente / DNA per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con cellule di topo AF e distribuire delicatamente vorticoso, con un volume finale di 2 ml / pozzetto. Lasciare agire per 24 h.
  6. Il giorno dopo, indurre l'espressione di fattori della Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) alimentando le cellule con mezzo fresco iPS-AF integrato con 1,5 mg / ml di doxiciclina (2 ml di mezzi per ogni pozzetto).
  7. Nutrire le cellule ogni giorno, senza passaggio, con il mezzo DOX contenente fresco (mantenere le cellule in mezzi integrato con doxiciclina fino punto 5.13).
  8. Osservare le cellule entro 24 ore per l'espressione mCherry e tutti i giorni per la formazione di colonie (colonie compaiono tipicamente tra i 20 e 30 giorni dopo la transfezione).
  9. Un giorno prima colonia raccolta, preparare una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con mitomicina C trattati con MEF.
  10. Scegliere singole colonie in 50 ml di volume di usinga 200 microlitri pipetta, e trasferire in sequenza in una piastra da 96 pozzetti in singoli pozzetti.
  11. Il giorno dopo, dissociarsi ogni colonia in singole cellule aggiungendo 50 ml di tripsina commerciale e incubare per 5 min a 37 ° C.
  12. Pipetta su e giù per disaggregare la colonia.
  13. Trasferire 50 ml di tripsina contenente la colonia dissociato in un nuovo pozzo con inattivato MEF su una gelatina 0,1% rivestito 96 ben piatto pieno di 100 ml di fresca media IPS-AF integrato con doxiciclina.
  14. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, suddiviso in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti.
  15. Quando le cellule raggiungono 60-70% di confluenza, raggruppati 1: 2 a due pozzetti, uno con doxiciclina e l'altro senza doxiciclina, per verificare se le colonie appaiono anche nella condizione senza doxiciclina.
  16. Continuare a mantenere cloni iPS-AF, doxiciclina indipendenti, su inattivato MEF nel medio iPS-AF.
  17. Coltivare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2, CHAnging media giornaliera.

6. fosfatasi alcalina Colorazione

  1. Eseguire alcalina colorazione fosfatasi seguendo il protocollo del produttore ogni volta che c'è la comparsa di cellule iPS-AF doxiciclina indipendenti.

7. immunofluorescenza

  1. Ogni volta che c'è l'aspetto delle cellule iPS doxiciclina indipendenti-AF, semi di 150.000 cellule / cm 2 su un pozzo di un 24-pozzetti con inattivato MEF, e far crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. (ATTENZIONE) Fissare le cellule aggiungendo 300 pl per pozzetto del 4% paraformaldeide (PFA) per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 300 microlitri di 0.1% NP-40 per permeabilize cellule.
  4. Risciacquare le cellule con 300 ml di 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Aggiungere 300 ml di tampone di bloccaggio (siero di cavallo 10% in PBS 1x) per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluire SSEA1 con 1% di siero albumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,3 M glicina in 0.1% PBS-Tween-20. Diluire tutti gli altri anticorpi con 10% di siero di cavallo in 1x PBS.
  7. Incubare gli anticorpi notte a 4 ° C.
  8. Risciacquare con 300 ml di 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Usare gli anticorpi secondari diluiti in 10% di siero di cavallo in 1x PBS: capra Alexa594 coniugato anti-topo IgG (1: 200), Alexa594 coniugato IgG pollo anti-capra (1: 200), Alexa594 coniugato pollo anti-IgG di coniglio (1: 200), capra Alexa568 coniugato anti-topo IgM (1: 200). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
  10. Risciacquare con PBS 1x.
  11. nuclei macchia con soluzione di Hoechst (1: 10.000) in PBS 1x.

8. In Vitro cellulare Differenziazione

  1. Per formare goccia d'attaccatura corpi embrionali (EBS), coltivare singole gocce (2.000 cellule / ml 20) sul coperchio di piastre Petri, utilizzando il mezzo di differenziazione.
  2. Incubare i piatti a 37 ° Ce 5% CO 2 per 4 giorni.
  3. Trasferire EBs in 100 mm piatti batterica-grade in coltura in sospensione per 3 giorni in media di differenziazione.
  4. EB piastra in 24 e piastre rivestite con matrice di membrana basale (diluito 1:10 in DMEM) per altri 14 giorni.
  5. Per analisi immunofluorescenza, utilizzare anticorpi primari: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37.

Formazione 9. In Vivo Teratoma

  1. Iniettare 100 ml di 1x PBS contenente 1 x 10 6 cellule iPS-AF nel muscolo della arti posteriori di RAG2 - / - γc - / - mice.
  2. Sacrificio topi tramite dislocazione cervicale 6 settimane dopo l'iniezione delle cellule.
  3. Rimuovere le masse tumorali, che si distinguono per le loro dimensioni, dalla arti posteriori dei topi per le seguenti analisi.
  4. Tagliare 7-10 micron di spessore sezioni trasversali del tumore isopentano congelato con un criostato.
  5. Per Ematossilina und Eosin (HE) Stain:
    1. Macchia con SE di valutare la composizione del tessuto tumorale, seguendo il protocollo del produttore.
  6. Per Stain dell'immunoperossidasi:
    1. Fissare sezioni teratoma con 4% PFA per 15 min a temperatura ambiente.
    2. Permeabilize con 0,1% Triton X-100.
  7. Incubare con i seguenti anticorpi: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) e αSMA (1: 100) diluito in 1% BSA in PBS 1x. Incubare per 1 ora a 37 ° C (per Tubb3) o per una notte a 4 ° C (per gli altri anticorpi).
  8. perossidasi blocco utilizzando il 100% di metanolo per 20 minuti.
  9. Incubare per 45 minuti a 37 ° C con l'anticorpo secondario HRP-coniugato (1: 150) anti-topo.
  10. Risciacquare con PBS 1x.
  11. Incubare con perossidasi (HRP) substrato (vedi Materiali Tavolo) per 5 min.
  12. Risciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti.
  13. Macchia con ematossilina QS per 9 sec.
  14. Risciacquare con acqua di rubinetto.

10. RNA Estrazione da cellule

  1. Utilizzare un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo consigliato dal produttore.

11. RNA Estrazione da teratoma

  1. Omogeneizzare il teratoma con un pestello e mortaio e di azoto liquido per evitare lo scongelamento del campione.
  2. Pesare 25 mg di tessuto.
  3. Aggiungere 1 ml di reagente commerciale per l'estrazione di RNA e 200 ml di cloroformio.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  5. Centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 15 min.
  6. Trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta.
  7. Per purificare l'RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo del produttore.

12. trascrizione inversa-polimerasi Analisi Reazione a catena

  1. Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando una trascrittasi inversa per la trascrizione inversa (RT) reazione a catena -polymerase (PCR) e oligo Accor (dT)ding il protocollo del produttore, per ottenere 50 ng / ml di cDNA. Diluire cDNA con acqua priva di RNasi ad una concentrazione di 10 ng / ml.
  2. Eseguire RT-PCR utilizzando la DNA polimerasi secondo il protocollo del produttore, utilizzando 1 ng / ml di cDNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Per valutare la capacità di riprogrammazione, le cellule del mouse AF sono stati raccolti da feti di topi GFP. Le cellule sono state trasfettate con il plasmide trasposoni circolare PB-tetO2-IRES-OKMS, che esprime i fattori di Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4) legati alla proteina fluorescente mCherry in maniera doxiciclina-inducibile, e invertire tetraciclina transactivator (PB CAG-rtTA) plasmidi insieme con il plasmide espressione trasposasi (mPBase). Cellule di topo AF sono state tr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il metodo scelto per ottenere l'induzione di pluripotenza è rilevante per la sicurezza clinica cellule rispetto al trapianto di lungo termine. Oggi, ci sono diversi metodi adatti per la riprogrammazione. Tra i metodi non-integrative, il virale (SeV) vettore Sendai è un virus a RNA in grado di produrre grandi quantità di proteine senza integrare nel nucleo delle cellule infette 40 e potrebbe essere una strategia per ottenere cellule iPS. vettori SEV potrebbe essere un candidato per la gener...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029For in vitro differentiation
2-mercaptoethanol SigmaM6250For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secondary antibody (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secondary antibody (immunofluorescence)
Alkaline Phosphatase kit Sigma85L1Alkaline Phosphatase  staining
AmpicillinSigmaA0166For bacterial selection
Bovine Serum Albumin SigmaA7906BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1x
ChloroformSigmaC2432For RNA extraction
DH5α cellsThermo Fisher Scientific18265-017Bacteria for cloning procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Doxycycline SigmaD9891For exogenous factors expression
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Sarstedt 72.706For PB production 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106For MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolation
GelatinJ.T.Baker131Used 0.1%, diluted in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718For blocking solution. Diluted in PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detection
HE Bio-Optica04-061010Histological analysis of teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detection
Horse Serum Thermo Fisher Scientific16050-122For blocking solution
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secondary antibody (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G)TerumoSS+01H25161Amniocentesis procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Rabbit polyclonal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
LB broth (Lennox)SigmaL3022For bacterial growth
LIF SigmaL5158For mouse AF and iPS-AF cells medium
Matrigel BD354234For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blocking
MULTIWELL 24 well plateBD Falcon353047For in vitro differentiation
MULTIWELL 6 well plateBD Falcon353046For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FRabbit polyclonal IgG
Non-essential amino acids SigmaM7145For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000For blocking solution. Diluted in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0For cell permeabilization. Diluted in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Mouse monoclonal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012For RT-PCR
Paraformaldehyde (solution)Sigma441244PFA, fixative, diluted in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1x
Penicillin - Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium
Petri Dish (150 mm)BD Falcon353025For MEF culture, tissue culture
PiggyBac transposase expression plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidProvided by professor Andras Nagy laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663For plasmids purification
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmids purification
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Provided by professor Andras Nagy laboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134For RNA extraction
Sox2 SantaCruzsc-17320Goat polyclonal IgG
SSEA1 Abcamab16285Mouse monoclonal IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific18064-014For RT-PCR
T Abcamab20680Rabbit polyclonal IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Cell culture passaging
Triton X-100Bio-Rad161-047For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596-026For RNA extraction
Tubb3  Promega G712AMouse monoclonal IgG1
TWEEN-20SigmaP1379For cell permeabilization, diluted in PBS 1x
αfp   R&D SystemsMAB1368Mouse Monoclonal IgG1
αSMA Abcamab7817Mouse Monoclonal IgG2a
Transfection Reagent (FuGENE HD)Promega E2311For AF cells transfection
StereomicroscopeNikonSM2645To perform amniocentesis 
200 μl tipsSarstedt 70.760012To pick bacteria colonies
ScissorF.S.T14094-11 stainless 25UTo perform amniocentesis 
EthanolSigma2860To clean the abdominal wall of the pregnant dam
Tissue culture petri dish (150 mm) BD Falcon353025For MEF expansion
Mitomycin CSigmaM4287-2MGFor MEF inactivation
MULTIWELL 96 well plateBD Falcon353071For iPS-AF culture

Riferimenti

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologia dello SviluppoNumero 120cellule del liquido amnioticocellule staminali pluripotenti indottepiggyBac trasposonimedicina rigenerativala riprogrammazionemouse

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati