JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

קונסורציומים חיידקים בתוך bumble דבורים כוורות להעשיר ולשמר אבקה של דבורה הזחלים. באמצעות רצף הדור הבא, יחד עם המעבדה, המבוסס על שדה ניסויים, כתב יד זה מתאר פרוטוקולים המשמשים כדי לבדוק את ההשערה כי שאריות פטריות לשנות את microbiome אבקה, ודמוגרפיה המושבה, המוביל בסופו של דבר אל המושבה הפסד.

Abstract

מגדלים מרבים להשתמש פטריות תרסיסים במהלך בלום, להגן על היבולים מפני המחלה, אשר חושף את הדבורים כדי פטריות שאריות. למרות נחשב "דבורה-בטוח", יש עדויות הרכבה פטריות שאריות אבקה משויכים דבורה ירידות (עבור גם דבש bumble דבורים מינים). בעוד המנגנונים עדיין לא ידועים יחסית, החוקרים העריכו כי דבורה-חיידק symbioses מעורבים. חיידקים לשחק תפקיד מרכזי לשימור ו/או עיבוד של אבקה, המשמש תזונה עבור דבורים זחל. על ידי שינוי בקהילה מיקרוביאלי, סביר כי קוטלי פטריות לשבש את שירותי אלה בתיווך חיידק, ובכך לסכן את בריאות דבורה. כתב יד זה מתאר בפרוטוקולים המשמשים כדי לחקור את mechanism(s) עקיף שבאמצעותו קוטלי פטריות עלול לגרום ירידה המושבה. כלוב ניסויים חשיפת דבורים פרחים שטופלו פטריות כבר סיפקו העדויות הראשונות כי קוטלי פטריות לגרום הפסדים המושבה עמוקה מקורית הדבורה (בומבוס הפרח). באמצעות שדה רלוונטי מינונים של קוטלי פטריות, סדרה של ניסויים פותחו כדי לספק תיאור עדינה יותר של הקהילה מיקרוביאלי הדינמיקה של אבקה החשופים פטריות. משמרות בהרכב מבנית של במכלולים פטרייתי ובקטריאליות בתוך microbiome אבקה נחקרות על-ידי הדור הבא רצפי וניתוח metagenomic. ניסויים שפותחו בזאת עוצבו כדי לספק הבנה מכניסטית של כיצד קוטלי פטריות משפיעים על microbiome של אבקה-הוראות. בסופו של דבר, ממצאים אלה צריך לשפוך אור על מסלול עקיף שדרכו קוטלי פטריות עלול לגרום ירידות המושבה.

Introduction

הצליח, דבורה בר מינים חווים ירידות נפוצה, עם השלכות עיקריים עבור שתי מערכות חקלאיות טבעי1. למרות המאמצים מתואמת כדי להבין את הסיבות לבעיה זו, הגורמים נהיגה דבש דבורים ירידות הם עדיין לא הבין היטב2,3,4. עבור מינים מסוימים של דבורים פראי, מקורית, המצב נהיה קשה5,6. אם אוכלוסיות דבורה לא יכולה להתקיים כאשר הם מצטלבים עם חקלאות תעשייתית, אוכלוסיות שלהם ימשיכו ליפול היבולים הדורשים למאביקים (35% ייצור ברחבי העולם7) ימשיכו מופחת יבול.

בעוד גורמים פוטנציאליים רבים כגון חשיפה לחומרי הדברה, מחלות גידול הפסד1,4,8,9,10 היו מעורבים בהתדרדרות דבורים דבש, יחסית מעט מאוד ידוע על השפעת לחצים אלו אינטראקטיבית על דבורים יליד בריאות, בתוך או ליד ומערכות חקלאיות. מאמצים רבים במחקר הנוכחי להמשיך להתמקד קוטלי חרקים, (למשל, neonicotinoids11,12), למרות שהמחקר העבר מצביע על כך קוטלי פטריות עשוי גם לשחק תפקיד בהתדרדרות דבורים על ידי ופוגע היווצרות הזיכרון, חוש הריח הקבלה13, קן זיהוי14, פעילות אנזים, פונקציות מטבוליות15,16,17. באופן כללי, קוטלי פטריות להמשיך להחיל על היבול פורח במהלך בלום. המחקרים האחרונים תיעדו כי דבורים נפוץ להחזיר פטריות שאריות כוורת18, ואכן, מחקרים הראו שיעור גדול של כוורות שנבדקו הכיל פטריות שאריות19,20. עבודה נוספת חשף את שאריות פטריות קשורה עם שיעור גבוה של דבש דבורים התמותה זחל21,22,23 ואת נוכחותם של "אנטומבד אבקה" בתוך מושבות, אשר למרות שאינם רעילים, נטול פעילות מיקרוביאלית והוא פרוץ תזונתית24. למרות העובדה כי קוטלי פטריות יש מזמן נחשב "דבורה-בטוח", עכשיו יש ראיות כי החשיפה פטריות לבד יכול לגרום הפסדים המושבה חמור של זן דבורה במבל מקורית, וטופל בומבוס25.

כדי לקבוע סיבתיות בין חשיפה פטריות המושבה התמותה, המודוס אופרנדי של כימיקלים אלה צריך להיקבע. כפי שמעידים קרקעות26, משקעים27ו סביבות הימית28, מיקוד פטריות, קוטלי פטריות סביר לשנות השפע פטרייתי, גיוון בתוך אבקה-הוראות, ובכך מפעיל קהילה גדולה משמרת את זה ייתכן מאוד ממליץ חיידקים. ללא מתחרים פטרייתי או היריבים, חיידקים פתוגניים מסוימים יכולים להתרבות יחסית לא מסומן, להקל את קלקול של אבקה-הוראות. מחקרים שנעשו בעבר הוכיחה כי מיקרואורגניזמים, במיוחד שמרים ופטריות filamentous, לשמש אנחנו חיים איתם בסמביוזה תזונתי עבור דבורים29,30,31, להגן מפני טפילים פתוגנים32 ,33, ולספק שימור לטווח ארוך של חנויות אבקה. קוטלי פטריות, לכן, ייתכן בעקיפין לפגוע דבורים ילדותי באמצעות שיבוש הקהילה מיקרוביאלי, יש צורך לספק שירותים אלה ו/או על ידי הגדלת הרגישות פתוגנים וטפילים הזדמנותית12. עם הגדלת דרישות על ייצור מזון, יבולים ברחבי העולם להיות ריססו בכל שנה עם קוטלי פטריות במהלך בלום, דבר המלמד הצורך להבין את סדר הגודל של תופעות כאלה הנוצרות על-ידי פטריות.

עד היום, הפערים הידע העיקריים הנוגעים מיקרוביאלי יליד דבורה אקולוגיה יכול להיות מיוצג על ידי בשאלות הבאות: באיזו מידה פטריות משנה הקהילה חיידקים בתוך דבורה אבקה-הוראות? מהן ההשפעות במורד הזרם של צריכת אבקה עם קהילה מיקרוביאלי שינו עמוקות? לשמור על השאלות האלה שהם נוגעים מבחינה אקולוגית, ניסויים שפותחו עם המטרות של חשיפת 1) את שאריות פטריות לבד יכול לגרום המושבה חמורה שקיעתה של מין יליד דבורה; 2) מידת שבה קהילות מיקרוביאלי בהוראות-אבקה שונו על ידי קוטלי פטריות ו- 3) כיצד דבורה בריאות מושפע על-ידי קהילה מיקרוביאלי שינו באופן חמור. מטרות הניסוי הוגדרו להתייחס אל כל השאלות הנ ל באמצעות שילוב של ניסויים במעבדה שדה מבוססות. מחקר זה באמצעות המדינה-of-the-art metagenomic טכניקות מולקולריות לצד שיטות מסורתיות של התבוננות שדה, שואפת לחבר את השפעת קוטלי פטריות אפשריות על בריאות דבורה.

המטרה הראשונה של מחקר זה היא להדגים כי חשיפה פטריות לבד יכול לגרום הפסדים משמעותיים המושבה בקרב ילידי דבורה מינים. מחקר מעורבים כלובים גדולים שדה שימש לחקור את ההשפעות של חשיפה פטריות על הגידול המושבה של הפרח בומבוס, דבורה מקורית בכל מקום, שפע בארה ב (איור 1, איור 2, איור 3). זה היה שיערו כי כוורות שטופלו פטריות שיציג כושר נמוך, ודמוגרפיה טיפוסיות בהשוואה כוורות שאינו חשוף. והנתונים שהתקבלו בניסוי תמיכה השערה זו, הוכחת כי שאריות פטריות בתוך אבקה יכול להיות הגורם הבלעדי של המושבה עמוקה הפסדים מינים דבורה במבל יליד25. המטרה השנייה של מחקר זה היא לחקור את התגובה של microbiome אבקה פטריות חשיפה. זה זה שיערו כי הרכב הקהילה של חיידקים בתוך אבקה-הוראות נחשפים קוטלי פטריות תהיה שונה מזו של אבקה ללא טיפול. בעוד פטרייתי השפע והמגוון צפויים לירידה משמעותית, חיידקים ו/או בזן פטרייתי דומיננטי אחד סביר יגדל לא מסומן בהיעדרו של פטריות מתחרים אחרים. דרך סדרה של ניסויים ב- vivo , אלה משמרות בהרכב הקהילה מיקרוביאלי ינותחו תוך שימוש metagenomics.

Protocol

1. לבחון את ההשפעה של החשיפה פטריות על Bumble דבורים המושבה הצלחה באמצעות שדה כלוב ניסויים

  1. סט למעלה 10 כלובי רשת בשדה נטועים שיבולת שועל. נחפור תעלה סביב כל הכלוב, חופר לכל ארבעה קצוות של הכלוב רשת באדמה כדי להבטיח כי דבורים לא יכול לברוח. מלאי את הכלובים עם צמחים בעלי פרחים בעציץ, אשר ידועים להיות מושך דבורים (למשל כוסמת, borage, אליסון, קוסמוס, חמניות) ( איור 2).
  2. תוספת הכלובים עם מגש אחד (36 ס מ x 42 ס מ) תלתן, בלום. אשכול פרחוני המשאבים בתוך פינה אחת של הכלוב, כובש שטח כ 2.5 מ' x 1 מ' Vegetate שטח הכלוב שנותרו על ידי שיבולת שועל.
  3. להקצות באופן אקראי הדבורה מושבות, כל העובדים המכיל, מיטה זוגית, טיפול (פטריות המתנה/נעדרים, N = 5 מושבות לכל טיפול, הכולל 10 מושבות), ואז למקם אותם בתוך כלוב שדה (N = 1/כלוב) 29 ימים (23 ביוני -21 יולי 2014).
  4. אוריינט בתיבות המושבה כך המושבה ' s פתחים הצבע לדרום, כדי לספק תנאים אופטימליים ניווט הדבורים. לסבסד את המושבות עם סוכר מים שלפוחיות, בתוך התיבות כוורת להשלמת צוף זמינות.
  5. החל מבוסס chlorothalonil פטריות ברמה שדה רלוונטי (20 גרם/ליטר) כדי צמחים פורחים בכלובים טיפול 5 פטריות, תוך שימוש ביד שנערך ריסוס חומרי הדברה, פעמיים במהלך המחקר (יום 0 ו- 13). מעיל הפרחים בצורה אחידה, כך אין נוזל נוסף לאנאפוליס פרחוני משטחים ( איור 3).
  6. בתום המחקר כלוב שדה, להסיר את המושבות וטופל דרב מהכלובים בעבודת יד, מגניב הכוורות על-ידי הצבת במקפיא-20 ° C עבור 20 דק.
  7. להסיר דבורים באמצעות מלקחיים סטרילי ולהקליט את המספר של הזחלים, גלמים, נשים בוגרות (אני. e. איוראו), וזכרים בוגרים. באמצעות איזון האנליטי להקליט את משקל יבש של אמא מלכה, הזחלים, גלמים, נשים בוגרות (קרי איוראו), הזכרים הבוגרים.

2. לבחון את ההשפעות של החשיפה פטריות על קהילות מיקרוביאלי האבקה-מהוראות Bumble דבורים קינים באמצעות מעבדה המבוסס על ניסויים Vivo ב

  1. Pulverize שנרכשו באופן מסחרי אבקה אבקה באמצעות תקן מעבדה-טחנת הכדור. לחטא אבקה אבקת למסמס ב-70% אתנול, ולאפשר לו להתאדות במשך הלילה תחת אור UV. לוודא עקרות של אבקה על-ידי ציפוי ~0.5 מ"ג במדיה אגר למטרות כלליות.
    1. כדי היבשה אבקה מעוקר, באמצעות פיפטות מעוקר, הוסף שדה רלוונטי במינון של פטריות: propiconazole-14.3%; azoxystrobin ב 22.9% עבור טיפולים (0.74 µL ו- 0.65 µL בהתאמה / יום / כוורת). מערבבים היטב בעזרת מקלות עץ מעוקר.
  2. מקום 6 ניסיוני כוורות (n = 3 עבור בקרה וטיפול) ב- benchtop מעבדה נקייה, היגיינה נשמר בטמפרטורת החדר. כל יום שוקלים 4.27 גר' אבקה 34 , 35 מעורבב עם קוטלי פטריות (עבור טיפולים) או במים סטריליים (עבור פקד) בתוך ברדס באמצעות הטכניקה aseptic רגיל.
    1. באמצעות הדלתות שסופקו על-ידי הצד של תיבת קרטון תוחמת את הכוורות, להציג את האבקה בתוך הכוורות. תוספת ההייבס עם סוכר סטיריליים פתרון בכל שבוע. המשך האכלה המשטר במשך ארבעה שבועות.
  3. המסקנה של המחקר במעבדה מבוסס, מגניב הכוורות על-ידי הצבת במקפיא-20 ° C עבור 20 דקות מגרדים החוצה האבקה-הוראות הנכלל צ'יימברס שבוחרים באמצעות מלקחיים סטיריליים שפכטלים ומקום אחסון סטריליים צינורות. בחנות-80 ° ג ספירת ולהקליט המשקל של העובדים ואת המלכה האם-ההתחלה והסוף של הניסוי (שלב 1.7).
  4. לבודד דנ א מהדגימה אבקה-הוראה באמצעות בידוד ה-DNA זמינים מסחרית ערכות (לפרטים, ראה טבלה חומרי).
    1. להוסיף 0.25 גרם של אבקה-הוראה על החילוץ צינורות, בקצרה מערבולת לערבב.
    2. להפוך 200 מ"ג/מ"ל ליזוזים פתרון יונים מים מזוקקים, מספיק למדגם/50 µL. טלטל נמרצות כדי פתרון הטופס לגמרי.
    3. להוסיף 50 µL של הפתרון ליזוזים הצינורות חילוץ עם מדגם זה, ומערבבים היטב על ידי היפוך מספר פעמים. דגירה הצינור 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. אם התמיסה הקימה, חום פתרון עד 60 ° צלזיוס עד התפרקה לפני השימוש.
    4. µL להוסיף 70 פירוק מימית לפתרון צינורות החילוץ, לאבטח בצורה אופקית על משטח מערבולת גרר עם קלטת, מערבולת במשך 10 דקות צנטריפוגה צינורות ב g x 10,000 ל 30 s בטמפרטורת החדר.
    5. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי mL 2 אוסף. להוסיף 250 µL של חלבון משקעים פתרון, מערבולת של Incubate ס' 5 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט קרח.
      הערה: מצפה בין µL 400 עד 500 µL של תגובת שיקוע. תגובת שיקוע עדיין עשויה להכיל כמה חלקיקים.
    6. Centrifuge הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה ב 10,000 x g, להעביר עד 600 µL של תגובת שיקוע צינור נקי mL 2 אוסף. להוסיף 200 µL של פתרון להסרת מעכב מימית, בקצרה, מערבולת, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק צנטריפוגה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות ב- 10,000 x ג' להעביר עד 750 µL של תגובת שיקוע לתוך צינור נקי mL 2 אוסף.
    7. 1200 להוסיף µL של bind מימית פתרון תגובת שיקוע, ו מערבולת עבור 5 ס לטעון כ 675 µL של תגובת שיקוע על גבי ספין ומסנן צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה.
    8. חוזר 2.4.7. פעמיים.
      הערה: בסך הכל שלושה מטענים עבור כל דגימה מעובד נדרשים.
    9. להוסיף 500 µL אתנול, צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ב- 10,000 x ג למחוק את הזרימה, ו צנטריפוגה שוב בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות ב- 10,000 x ג מקום ספין מסנן בשפופרת איסוף mL 2 נקייה.
      10. מאגר
    10. להוסיף 100 µL של • תנאי למרכז של קרום מסנן. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 30 s ב 10,000 x ג למחוק את המסנן ספין. חנות שנאספו DNA בין-20 ° C ל-80 מעלות צלזיוס
  5. שימוש מבודד DNA עבור רצף.
    1. Quantify, ואת לנרמל מבודד דנ א נג 2/µL על ידי ניתוח fluorometric. תגובות
      1. הכן דולר עבור כל דגימה שחולצו להשוות את כמויות יחסיות של 28S (צמח), לנתח שלה (פטריות), ורכיבים 16 (חיידקים) של כל מדגם אבקה-סעיף 36. ודא כי כל התגובה מכילה 10 ng של DNA הכולל, 2 x של cyanine סימטרית צבע המבוסס על מיקס מאסטר 2.5 µL כל תחל ואחורה זוגות 28KJ/28B 37 למפעל, ITS1/ITS5.8R עבור ה-DNA פטרייתי 38 .
    2. דנ א להגביר שימוש בפרמטרים הבאים: 2 דקות דנטורציה טרום ב 50 מעלות צלזיוס, 2 דקות דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס, 40 מחזורי של (15 s ב 98 ° C, 15 s-58 ° C, 60 s ב-72 מעלות), ואחריו עיקול להמיס.
    3. להכין 2-צעד, מקוננת PCR פרוטוקול באמצעות ספריות הדור הבא רצפי פילוח של rRNA 16 אזור משתנה V3/V4 ו- ITS / 5.8s אזור מרווח rRNA.
      1. µL להוסיף 12.5 של ה-DNA ל- 5 pmol של כל פריימר ו- 2 x מיקס מאסטר. להפוך לתגובות נפרד לכל אזור (16 או ITS; ראה טבלה 1). שינוי אזור ספציפי תחל כפי שתואר לעיל 39 , 40 להוספת מתאם ספציפי הרצפים (sequencer) החריגה רצפי רצפי הגן הספציפי.
      2. לבצע הגברה הראשונית באמצעות הפרמטרים הבאים: 3 דקות דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס, 25 מחזורי של (30 s ב 95 ° C, 30 s-55 ° C, 30 s ב-72 מעלות), 5 דקות הארכה הסופי-72 מעלות צלזיוס
      3. הבאות הראשוני הגברה, לאמת גודל הספרייה וכמות על ידי ניידות electrophoretic, לנקות באמצעות 1 x נפח מעבדתי imm הפיךחרוזים obilization כדי להסיר תחל שיורית, ריאגנטים התגובה. בריכה מטוסי אף-16, amplicons שלה באופן כמותי כדי ליצור בריכה אמפליקון יחיד עבור כל דגימה.
      4. להוסיף מתאמי ספציפי הרצפים (sequencer), לטעום באינדקסים ספציפיים כפול באמצעות את תחל הבאים (ראה טבלה 1). להוסיף 2.5 µL של ה-DNA מוגבר pmol 5 של כל פריימר ו- 2 x מיקס מאסטר. לבצע הגברה הספרייה באמצעות הפרמטרים הבאים: 3 דקות דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס, 8 מחזורים של (30 s ב 95 ° C, 30 s-55 ° C, 30 s ב-72 מעלות), 5 דקות הארכה הסופי-72 מעלות צלזיוס
    4. הבאים PCR, ספריות סיים לנקות באמצעות נפח 1 x של מחרוזת הנייח הפיך מעבדתי. להעריך את האיכות והכמות של ספריות סיים באמצעות ניידות electrophoretic ו- fluorometry, בהתאמה. לתקנן ספריות 2 מיקרומטר, בריכת לפני רצף.
    5. לבצע רצף הדור הבא על פלטפורמה מקביל המתאמים שנוספו ב- PCR המשני, באורך המתאים כדי לכסות את כולו אמפליקון 41.
  6. רצף ביאור וניתוח הקומפוזיציה מיקרוביאלי.
    1. לשלב זוג רצף נתונים (R1 ו- R2) לתוך contigs יחיד עבור ספריות הכל ברצף. לאחר מיזוג קבצים R1 ו- R2, מופק קובץ fasta יחיד עבור כל הספריות של.
      הערה: שלב זה ואת התהליכים המתוארים להלן (אלא אם כן צוין אחרת) מתבצעות ב- Mothur גירסה 1.38.0 38.
    2. מסך כל קובץ fasta להסיר בסיסים רב-משמעי, רצפים ארוכים לא צפויה, homopolymers ארוך.
      הערה: הפרמטרים עבור הקרנה, וגם להסרת רצף הם maxambig = 0, maxlength = 600 ו- maxhomop = 8 עבור שני גנים. להסיר רצפים זהים, אך לשמור טבלה contingence בנפרד עבור כל ספריות (המוכר גם בשם הרוזן טבלה ב- Mothur).
    3. יישור רצפים ייחודי של ספריית הגן מטוסי אף-16 יצאו נגד גירסת מסד הנתונים סילבה 123, ואת הספריה ITS ג'ין נגד מסד הנתונים לאחד שלה 42.
      הערה: רצפים חייב להיות מבואר מרמת ממלכת לשלב סוג.
      1. לאחר מכן, אשכולות המיושרים רצפים עם pre.cluster הפונקציה באמצעות diff = 5, ולהסיר כימרות.
    4. לסווג רצפים בשיטת וואנג 43 בהתבסס על סילבה (עבור ג'ין 16) טקסונומיה לאחד שלה (עבור ג'ין ITS) קבצים (ערך סף של 80%).
    5. לטעון לתוך R 44 contingence הטבלאות (אחת בכל גן) שנוצר במהלך תהליך סיווג ב- Mothur. בכל רמה בטקסונומיה, לקבל שפע יחסי לכל ספריה עבור ניתוח נוסף של הקהילה מיקרוביאלי שינויים.
      הערה: בכל רמה בטקסונומיה, מתמזגים יחד קבוצות בטקסונומיה בעת השפע היחסי הוא פחות מ 2% עבור כל החזרות ניסיוני.

תוצאות

מחקר שדה הכלוב:

והנתונים שהתקבלו כלוב הניסויים הראו כי המושבות bumble דבורים היה בתגובה פטריות חשיפה משמעותית. ההייבס שטופלו פטריות המיוצר באופן משמעותי פחות עובדים (12.2 ± 3.8, זאת אומרת ± SE) מאשר ההייבס שליטה (43.2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p ...

Discussion

חקירות ההשפעות של קוטלי פטריות על דבורה בריאות נשארו היבט understudied של אסטרטגיות ניהול בפשט. המחקר שלנו שואפת את פער הידע זה באמצעות חבילה של טכניקות משלימים במפורש לבודד את הגורמים הפוטנציאליים נהיגה דבורה ירידות. תכנון הרציונל, עיבוד של ניסויים אלה מפורטים להלן.

חשוב לוודא ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

והמלצה תודה של אוניברסיטת ויסקונסין ביוטכנולוגיה במרכז DNA רצף המתקן למתן הגברה, רצף מתקנים ושירותים, קייטלין קרלסון, ג'ניפר המיומנות, ג'ייק אוטו, וכן מקס Haase למתן סיוע טכני עם אנליזה מולקולרית. עבודה זו נתמכה על ידי שירות המחקר החקלאי-USDA הופקעו קרנות (מחקר מידע המערכת הנוכחית 3655-21220-001). תמיכה נוספת סופק על ידי הקרן הלאומית למדע (תחת גרנט מס DEB-1442148), DOE הגדול אגמים Bioenergy המרכז לחקר (DOE משרד המדע בער דה-FC02-07ER64494), לבין משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון חקלאות (פתח פרוייקט 1003258). C.T.H. הוא חוקר הספסל למדעים ביו ועמית של אלפרד Toepfer סגל, הנתמך על-ידי בוטח צדקה הספסל ועל קרן אלכסנדר פון הומבולדט, בהתאמה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Natupol BeehiveKoppertUSRESM116 hives
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3%
AboundSyngenta4033540Azoxystrobin 22.9%
ChlorothalonilSyngenta3452Fungicide used for trials
Pollen granulesBee rescuedB004D5650C3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculationCurrie Lab
Yeast strains for inoculationHittinger lab
Primer pairsUW Biotech Center
DNA Isolation KitMo Bio12830-50Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851DNA quantification tool
Select Master Mix for CFXThermo Fisher4472952Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection SystemBio Rad1855196Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,Axygen10159-696Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 KitAgilent5067-1504Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq SequencerIlluminaUsed for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)VWR

References

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines?. Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -. M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754 (2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182 (2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547 (2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -. Y., Ho, C. -. H., Lin, C. -. J., Lo, C. -. C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125 (2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency?. Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf (2010)
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  42. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  43. Team, R. C. . R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , (2015).
  44. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  45. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  46. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  47. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  48. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  49. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  50. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  51. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  52. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  53. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  54. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235 (2012).
  55. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals?. Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128metagenomicsmicrobiome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved