Empirica, metagenomica e tecniche computazionali illuminano i meccanismi attraverso i quali salute delle API di fungicidi compromesso

Riepilogo

Consorzi microbici all'interno alveari dell'ape di bumble arricchiscono e preservare il polline per larve di ape. Mediante sequenziamento di nuova generazione, insieme al laboratorio ed esperimenti sul campo, questo manoscritto descrive protocolli utilizzati per verificare l'ipotesi che residui di fungicidi alterano il microbioma di polline e demographics di Colonia, infine conducendo alla Colonia perdita.

Abstract

I coltivatori spesso utilizzano fungicida spray durante la fioritura per proteggere le colture contro la malattia, che espone le API ai residui di fungicidi. Anche se considerato "bee-safe", c'è prova di montaggio che residui di fungicida in polline sono associate con i declini di ape (per specie di ape di bumble e miele). Mentre i meccanismi rimangono relativamente sconosciuti, i ricercatori hanno speculato che la simbiosi di ape-microbo sono coinvolti. Microbi giocano un ruolo fondamentale nella conservazione e/o elaborazione di polline, che serve come nutrimento per le API larvale. Alterando la comunità microbica, è probabile che i fungicidi interrompono questi servizi microbo-mediata e quindi compromettono la salute delle API. Questo manoscritto descrive i protocolli utilizzati per indagare i meccanismi indiretti da cui fungicidi possono essere la causa declino di Colonia. Esperimenti di gabbia esponendo le API ai fiori fungicida-trattati hanno già fornito la prima prova che fungicidi causano perdite colonia profonda in un calabrone nativo (Bombus impatiens). Utilizzando il campo rilevanti dosi di fungicidi, una serie di esperimenti sono stati sviluppati per fornire una descrizione più fine delle dinamiche di comunità microbica di polline fungicida-esposti. Cambiamenti nella composizione strutturale di assemblaggi fungine e batteriche all'interno il microbioma di polline sono indagati dal sequenziamento di nuova generazione e analisi metagenomica. Esperimenti sviluppati nel presente documento sono stati progettati per fornire una comprensione meccanicistica di come fungicidi influenzano il microbioma del polline-disposizioni. In definitiva, questi risultati dovrebbero far luce sulla via indiretta attraverso il quale fungicidi possono causare cali di Colonia.

Introduzione

Gestito e specie di api selvatiche sono verificati diffuse diminuisce, con importanti implicazioni per entrambi i sistemi naturali e agricoli¹. Nonostante sforzi concertati per comprendere le cause di questo problema, i fattori guida declini di ape del miele non sono ancora ben compreso^2,3,4. Per alcune specie di api selvatiche, native, la situazione è diventata terribile^5,6. Se le popolazioni di API non possono essere sostenute quando si intersecano con l'agricoltura industriale, la popolazione continuerà a cadere e le colture che richiedono impollinatori (35% della produzione mondiale⁷) resisterà ridotto raccolti.

Mentre molti potenziali fattori quali l'esposizione dell'antiparassitario, malattia e habitat perdita^1,4,8,9,10 sono stati implicati nel declino di API del miele, relativamente piccolo è conosciuto circa l'effetto interattivo di questi fattori di stress sulla salute delle API native, all'interno o vicino a sistemi agricoli. Molti sforzi di ricerca corrente continuano a concentrarsi su insetticidi, (ad es., neonicotinoidi^11,12), anche se in passato la ricerca indica che fungicidi possono anche svolgere un ruolo nella diminuzione di API alterando la formazione della memoria, ricezione olfattiva¹³, nido riconoscimento¹⁴, l'attività enzimatica e funzioni metaboliche^15,16,17. A livello globale, fungicidi continuano ad essere applicati alle colture di fioritura durante la fioritura. Studi recenti hanno documentato che le API comunemente riportare residui fungicida in alveare¹⁸, infatti, hanno dimostrato una grande proporzione di alveari testati contenuti fungicida residui^19,20. Ulteriore lavoro ha rivelato quel residuo fungicida è associato con alti tassi di miele ape mortalità larvale^21,22,23 e la presenza di "polline entombed" all'interno di colonie, che anche se non tossico, è privo di attività microbica e nutrizionalmente compromessa²⁴. Nonostante il fatto che fungicidi lungamente sono stati considerati "bee-safe", ora c'è prova che l'esposizione al fungicida da solo può causare perdite gravi Colonia in una specie di ape di bumble nativo, Bombus impatiens²⁵.

Per stabilire la causalità tra l'esposizione fungicida e Colonia mortalità, il modus operandi di queste sostanze chimiche devono essere determinate. Come evidenziato nei suoli²⁶, sedimenti²⁷e ambienti acquatici²⁸, mirando ai funghi, fungicidi più probabile alterano fungina abbondanza e diversità all'interno di polline-disposizioni, quindi richiamando un'importante comunità shift che fortemente può favorire i batteri. Senza concorrenti fungine o antagonisti, alcuni batteri patogeni possono proliferare relativamente incontrollato, facilitando il deterioramento di polline-disposizioni. Ricerca passata ha dimostrato che i microrganismi, in particolare lieviti e funghi filamentosi, servire come simbionti nutrizionale per le API^29,30,31, proteggere contro parassiti e patogeni^{32 ,33}e fornire la conservazione a lungo termine dei depositi di polline. Fungicidi, pertanto, indirettamente possono danneggiare le API immature interrompendo la comunità microbica che è necessario per fornire tali servizi e/o aumentando la suscettibilità a parassiti e patogeni opportunistici¹². Con l'aumento di richieste sulla produzione alimentare, raccolti in tutto il mondo vengono spruzzati ogni anno con fungicidi durante la fioritura, sottolineando la necessità di comprendere la portata di tali effetti indotti da fungicida.

A-data, le lacune di conoscenza primaria relative API native microbica ecologia può essere rappresentato dalle seguenti domande: fino a che punto cambia fungicida della comunità microbica nel ape polline-disposizioni? Quali sono gli effetti a valle di consumare polline con una comunità microbica profondamente alterata? In linea con queste domande ecologicamente germane, gli esperimenti sono stati sviluppati con gli obiettivi primari di rivelare 1) quel residuo fungicida da solo può causare grave Colonia declino in una specie di API native; 2) il grado a cui le comunità microbiche in polline-disposizioni sono alterate di fungicidi e 3) come la salute delle API è influenzata da una comunità microbica gravemente alterata. Gli obiettivi sperimentali sono stati definiti per affrontare le questioni di cui sopra utilizzando una combinazione di esperimenti di laboratorio e campo-base. Utilizzando state-of-the-art metagenomica e tecniche molecolari a fianco dei tradizionali metodi di osservazione del campo, la ricerca si propone di mettere insieme i potenziali effetti dei fungicidi sulla salute delle API.

Il primo obiettivo di questo studio è di dimostrare che l'esposizione fungicida da solo può causare perdite di Colonia significativa tra specie di API native. Uno studio che coinvolge gabbie grande campo è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'esposizione di fungicida sulla crescita Colonia di Bombus impatiens, un'ape nativa onnipresente, abbondante negli Stati Uniti (Figura 1, Figura 2, Figura 3). È stato supposto che fungicida-trattati alveari presenterebbe fitness inferiore e Demografia atipico rispetto ai non esposti alveari. I dati ottenuti da questo esperimento supportano questa ipotesi, dimostrando che i residui di fungicidi all'interno di polline possono essere l'unica causa delle perdite di Colonia profonda in un nativo bumble bee specie²⁵. Il secondo obiettivo di questo studio è quello di indagare la risposta del microbioma polline all'esposizione di fungicida. È stato ipotizzato che la composizione della comunità di microbi all'interno di polline-disposizioni esposti ai fungicidi sarà diversa da quello di polline non trattati. Mentre diversità e abbondanza fungina dovrebbero diminuire significativamente, i batteri e/o una singola specie fungina dominante probabilmente crescerà incontrollata in assenza di altri funghi concorrenti. Attraverso una serie di prove in vivo , questi cambiamenti nella composizione della comunità microbica saranno analizzati utilizzando metagenomica.

Protocollo

1. esaminare l'effetto del fungicida esposizione su Bumble Bee Colony successo utilizzando campo gabbia esperimenti

1. Set 10 maglia gabbie in un campo piantato con avena. Scavare una trincea intorno ogni gabbia e tutti e quattro i bordi della gabbia della maglia di scavare nel terreno per garantire che le API non possono sfuggire. Magazzino le gabbie con piante fiorite in vaso, che sono noti per essere attraente per le API (ad es. grano saraceno, borragine, alyssum, cosmos e girasoli) ( Figura 2).
2. Supplemento le gabbie con un unico cassetto (36 x 42 cm) di trifoglio in fiore. Risorse floreali all'interno di un angolo della gabbia, occupando uno spazio di circa 2,5 m x 1 m. vegetare la restante area di gabbia di avena cluster.
3. Assegnare casualmente il calabrone colonie, ciascuna contenente i lavoratori e una singola con letto queen, un trattamento (fungicida presente/assente, N = 5 colonie per ogni trattamento, 10 colonie totale), quindi inserirli all'interno di una gabbia di campo (N = 1/gabbia) per 29 giorni (23 giugno -21 luglio 2014).
4. Orient le caselle di Colonia tale che la Colonia ' aperture s punto a sud per fornire le API con condizioni di navigazione ottimale. Sovvenzionare le colonie con vesciche di acqua zucchero, collocati all'interno delle scatole di alveare per integrare disponibilità di nettare.
5. Applica basati su clorotalonil fungicida a livello campo-pertinenti (20 g/L) per piante fiorite nelle gabbie trattamento cinque fungicida, utilizzando una mano tenuta spruzzatore dell'antiparassitario, due volte durante lo studio (giorno 0 e 13). Cappotto in modo uniforme i fiori tale che nessun ulteriore liquido aderisce a superfici floreale ( Figura 3).
6. A conclusione dello studio gabbia campo, rimuovere a mano le colonie di b. impatiens dalle gabbie, raffreddare gli alveari mettendo nel congelatore a -20 ° C per 20 min.
7. Rimuovere le API utilizzando pinze sterili e registrare il numero di larve, pupe, le femmine adulte (i. e. raccoglitrici) e i maschi adulti. Utilizzando una bilancia analitica registrare il peso a secco della regina madre, larve, pupe, femmine adulte (cioè raccoglitrici) e maschi adulti.

2. Esaminare gli effetti di fungicida esposizione sulle comunità microbiche in polline-disposizioni di Bumble Bee nidi utilizzando laboratorio basato In Vivo studi

1. Pulverize commercialmente acquistato polline polvere finissima utilizzando uno standard laboratorio-laminatoio di sfera. Sterilizzare in polvere polline ammollo in etanolo al 70%, lasciandolo evaporare durante la notte sotto la luce UV. Verificare la sterilità del polline di placcatura ~0.5 mg su General-Purpose agarizzati.
   1. a secco, polline sterilizzato, utilizzando pipette sterilizzati, aggiungere il dosaggio relativo campo del fungicida: propiconazolo al 14,3%; azoxystrobin 22,9% per trattamenti (0.74 µ l e 0,65 µ l rispettivamente / giorno / alveare). Mescolare bene usando bastoni di legno sterilizzati.
2. Posto 6 alveari sperimentali (n = 3 ciascuno per il controllo e trattamento) in un laboratorio pulito, igienico benchtop mantenuta a temperatura ambiente. Ogni giorno pesare 4,27 g di polline ^{34 , 35}, mescolato con acqua sterile (per controllo) all'interno di una cappa usando una tecnica asettica standard o fungicidi (per i trattamenti).
   1. Utilizzando le porte trappola fornite dal lato della scatola di cartone che racchiude le arnie, introdurre il polline all'interno le arnie. Supplemento gli alveari con soluzione di zucchero sterilizzato ogni settimana. Continuare il regime d'alimentazione per quattro settimane.
3. a conclusione dello studio lab-basata, raffreddare gli alveari mettendo in congelatore a-20 ° C per 20 min. raschiare fuori il polline-disposizioni contenute all'interno di covata chambers utilizzando pinze sterili e spatole e posto in tubi di stoccaggio sterile. Conservare a-80 ° C. Count e registrare il peso dei lavoratori e regina madre all'inizio e alla fine dell'esperimento (punto 1.7).
4. Isolare il DNA da campione di polline-fornitura mediante isolamento del DNA disponibile in commercio Kit (Vedi materiali tavolo per dettagli).
   1. Aggiungere 0,25 g di polline-disposizione per estrazione tubi, brevemente vortice mescolare.
   2. Fare un 200 mg/mL soluzione di lisozima in acqua distillata deionizzata, abbastanza per 50 µ l di campione. Agitare vigorosamente per soluzione completamente forma.
   3. Aggiungere 50 µ l della soluzione di lisozima per i tubi di estrazione con il campione in esso e mescolare bene capovolgendo più volte. Incubare la provetta per 10 min a 37 ° C in un bagno d'acqua. Se ha forma un precipitato, riscaldare la soluzione a 60 ° C fino a quando disciolto prima dell'uso.
   4. Aggiungere 70 µ l di soluzione acquosa Lisi per tubi di estrazione, fissare orizzontalmente su un pad di vortice a base piatta con nastro adesivo, e tubi di vortice per 10 min. centrifuga a 10.000 x g per 30 s a temperatura ambiente.
   5. Trasferire il surnatante in una provetta di raccolta pulita 2 mL. Aggiungere 250 µ l di soluzione di precipitazione della proteina e vortexare per 5 s. Incubare a 4 ° C per 5 min in un bagno di ghiaccio.
      Nota: Si aspettano tra 400 µ l a 500 µ l del surnatante. Surnatante potrebbe ancora contenere alcune particelle.
   6. Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 1 min a 10.000 x g e trasferire fino a 600 µ l del surnatante in una provetta di raccolta pulita 2 mL. Aggiungere 200 µ l di soluzione per la rimozione acquosa inibitore, brevemente, vortex e incubare a 4 ° C per 5 min. Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 1 min a 10.000 x g. trasferire fino a 750 µ l del surnatante in una provetta di raccolta pulita 2 mL.
   7. Aggiungere 1200 µ l di soluzione acquosa bind per il surnatante e vortexare per 5 s. caricare circa 675 µ l del surnatante in un filtro spin e centrifugare a 10.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Scartare il flusso attraverso.
   8. Ripetere 2.4.7. due volte.
      Nota: Un totale di tre carichi per ogni campione elaborato sono necessari.
   9. Aggiungere 500 µ l etanolo e centrifuga a temperatura ambiente per 30 s a 10.000 x g. scartare il flusso attraverso e centrifugare nuovamente a temperatura ambiente per 1 min a 10.000 x filtro spin di g. posto in una provetta pulita 2 mL.
   Buffer di
   10. aggiungere 100 µ l di eluizione al centro della membrana del filtro. Centrifuga a temperatura ambiente per 30 s a 10.000 x g. gettare il filtro spin. Archivio raccolto DNA tra-20 ° C e -80 ° C
5. uso isolato del DNA per il sequenziamento.
   1. Quantificare e normalizzare il DNA isolato a 2 ng / µ l di analisi fluorometrica. Reazioni
      1. preparare in triplice copia per ogni campione estratto confrontare la quantità relativa di 28S (pianta), analizzare i suoi (funghi) e 16S (batterica) componenti di ogni campione di polline-disposizione ³⁶. Garantire che ogni reazione contiene 10 ng di DNA totale e 2 x di mix master di tintura base asimmetrica cianina 2,5 µ l di primer forward e reverse coppie 28KJ/28B ³⁷ per pianta e ITS1/ITS5.8R per DNA fungoso ³⁸ .
   2. Amplificare DNA utilizzando i seguenti parametri: pre-denaturazione 2 min a 50 ° C, 2 min denaturazione iniziale a 95 ° C, 40 cicli di (15 s a 98 ° C, 15 s a 58 ° C, 60 s a 72 ° C), seguita da una curva di fusione.
   3. Preparare un protocollo PCR 2-step, nidificato utilizzando librerie di sequenziamento di nuova generazione rRNA 16S di targeting regione variabile V3/V4 e ITS / 5.8s regione distanziatore rRNA.
      1. Aggiungere 12,5 µ l di DNA a 5 pmoli di ciascun primer e 2 x mix master. Fare reazioni separate per ciascuna regione (16S o ITS; cfr. tabella 1). Modificare primers specifici regione come descritto in precedenza ^{39 , 40} aggiungere sequenze nucleotidiche di adattatore specifico sequencer sporgenza per le sequenze di gene-specific del.
      2. Eseguire amplificazione iniziale utilizzando i seguenti parametri: 3 min denaturazione iniziale a 95 ° C, 25 cicli di (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), 5 min estensione finale a 72 ° C.
      3. Seguente iniziale amplificazione, verificare la dimensione di biblioteca e la quantità di mobilità elettroforetica e pulire usando un 1 x volume fase solida reversibile immobilization perline per rimuovere primer residuo e reagenti di reazione. Piscina 16S e sua ampliconi quantitativamente per creare un pool di amplicon singolo per ciascun campione.
      4. Aggiungere schede specifiche di sequencer e assaggiare gli indici dual specifici utilizzando i seguenti primer (Vedi tabella 1). Aggiungere 2,5 µ l di DNA amplificato a 5 pmoli di ciascun primer e 2 x mix master. Eseguire amplificazione libreria utilizzando i seguenti parametri: 3 min denaturazione iniziale a 95 ° C, 8 cicli di (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), 5 min estensione finale a 72 ° C.
   4. Seguente PCR, pulito finite librerie utilizzando un volume di 1 x di perline reversibile immobilizzazione in fase solida. Valutare la qualità e la quantità delle librerie finite utilizzando la mobilità elettroforetica e fluorimetria, rispettivamente. Standardizzare le librerie a 2 µM e piscina prima del sequenziamento.
   5. Eseguire il sequenziamento di nuova generazione su una piattaforma analoga per le schede aggiunte nella PCR secondario, con una lunghezza adeguata per coprire l' intero amplicone ⁴¹.
6. Sequenza annotazione e analisi della composizione microbica.
   1. Combine coppia-fine dati di sequenziamento (R1 e R2) nel singolo contigs per librerie tutte in sequenza. Dopo l'Unione di file sia R1 e R2, viene prodotto un file di singolo fasta per ognuna delle librerie.
      Nota: Questo passaggio e i processi descritti di seguito (se non diversamente indicato) sono eseguiti in Mothur versione 1.38.0 ³⁸.
   2. Schermo ogni file fasta per rimuovere basi ambigui, inaspettati lunghe sequenze e lunghi omopolimeri.
      Nota: I parametri per lo screening e la rimozione di sequenza sono maxambig = 0, maxlength = 600 e maxhomop = 8 per entrambi i geni. Rimuovere le sequenze identiche, ma mantenere una tabella di contingenza separatamente per tutte le librerie (a.k.a. tabella di conteggio in Mothur).
   3. Allineare sequenze uniche della biblioteca gene 16S contro la versione del database SILVA 123 e la biblioteca ITS gene contro l'unire ITS database ⁴².
      Nota: Sequenze devono essere annotate dal livello unito al livello di genere.
      1. Successivamente, cluster allineati sequenze con la funzione pre.cluster utilizzando diff = 5 e rimuovere le chimere.
   4. Classificare sequenze utilizzando il metodo Wang ⁴³ basato sui file di unire la sua (per gene ITS) Tassonomia (valore massimo di 80%) e SILVA (per gene 16S).
   5. Caricare in R ⁴⁴ le tabelle di contingenza (uno per ogni gene) generate durante il processo di classificazione in Mothur. Ad ogni livello tassonomico, ottenere abbondanza relativa a libreria per un'ulteriore analisi della comunità microbica modifiche.
      Nota: Ogni livello tassonomico, unire insieme gruppi tassonomici quando abbondanza relativa è inferiore al 2% per tutte le ripetizioni sperimentale.

Risultati

Studio di gabbia di campo:

I dati ottenuti dagli esperimenti gabbia colonie dell'ape di bumble presentava una significativa risposta all'esposizione di fungicida. Le arnie fungicida-trattati prodotta significativamente meno lavoratori (12,2 ± 3.8, media ± SE) che gli alveari di controllo (43,2 ± 11,2, F_1,9= 6.8, p = 0,03) (Figura 4). Inoltre, la biomassa delle A...

Discussione

Le indagini sugli effetti dei fungicidi sulla salute delle API sono rimaste un aspetto understudied di strategie di lotta. Il nostro studio si propone di colmare questo divario di conoscenza utilizzando una suite di tecniche complementari che isolano in modo esplicito i potenziali fattori ape declini. La pianificazione, la spiegazione razionale e il rendering di questi esperimenti sono dettagliati sotto.

È importante garantire che nessuna ape sono ammessi per sfuggire la mesh degli esperiment...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR