איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Summary

בדיקות תפוקה גבוהה של פתוגנים מבוססים DNA ו- RNA על ידי ננו PCR מתוארות באמצעות כלבים syndromic ולוח PCR נשימת סוסים.

Abstract

סולם Nanoliter בזמן אמת PCR משתמשת ריבוב מרחבים לאפשר מבחני מרובים שיופעלו במקביל על צלחת אחת ללא חסרונות הטיפוסיים של שילוב תגובות ביחד. עיצבנו ומוערכת פאנל מבוסס על העיקרון הזה כדי לזהות את נוכחות במהירות של סוכני מחלה נפוצה אצל כלבים וסוסים עם מחלה נשימתית חריפה. כתב יד זה מתאר עבודה PCR ננו איבחוני הכנת המדגם, הגברה, וניתוח רצפי הפתוגן היעד, תוך התמקדות והליכים שונים מתגובות מידה מיקרוליטר. בחלונית הנשימה שהוצגה, 18 מבחנים היו כל להגדיר בשלושה עותקים, להכיל עד 48 דגימות לכל צלחת. חילוץ אוניוורסלי זרימת עבודה מראש הגברה הוטבה הכנת מדגם תפוקה גבוהה כדי להכיל מטריצה ​​מרובה פתוגנים מבוסס DNA ו- RNA. נציג נתונים מוצגים עבור היעד RNA אחד (שפעת A מטריצה) ויעד DNA אחד (הרפס סוסים1). היכולת מהירה ומדויק לבדוק עבור קבוצה מקיפה, מבוסס-תסמונת של פתוגנים היא כלי רב ערך לשיפור יעילות ארגונומיה של בדיקות אבחון לאבחון מחלה נשימתית חריפה וניהול.

Introduction

עם ביקוש איתור מהיר ומקיף של סוכנים מרובים לדיאגנוסטיקה רפואית לבני אדם ולבעלי חיים, שיטות אבחון מולקולריות היחיד-אורגניזם לגילוי הפתוגן הם מכבידים אלא ממשמשים מספר רב של דגימות נבדקות עבור מחלה אחת. בהקשר הווטרינרים, מתודולוגיות אבחון תפוקה גבוהה חשובות במיוחד בשל צורך הנוסף לכיסוי פתוגנים ממגוון רחב של מינים. OneHealth גישות לניהול המחלה שמקורן במזון ומעקב הפתוגן המתעוררים הם דוגמאות של הצרכים בדיקות הכוללות מספר חיידקים, וירוסים (DNA או RNA מבוסס), טפילים ופטריות. האתגר שילוב בדיקות עבור analytes מרובים יחד (ריבוב) על מנת לשפר את יעילות הבדיקה היא הפסד אפשרי של רגישות נטל גדול עבור אופטימיזציה ואימות של מבחני.

תגובת שרשרת בקנה מידה Nanoliter פולימראז בזמן אמת (PCR) הוא האלטריליד לפרקטיקה של ריבוב המאפשרת תגובות נפרדות רבות לרוץ בו זמנית על אותו המדגם ^1. פלטפורמת OpenArray היא יישום של עיקרון זה ^2; הוא משלב טכנולוגיה microarray עם PCR בזמן אמת. מבוסס על הרעיון של ריבוב מרחבים, כל מדגם הוא נבדק על מספר רב של מטרות נפרדות דרך חורים. פלטפורמה זו שמשה בתחילה עם כימית מחייב cyanine מבוסס פעמים התקועות DNA ^2, והיא זמינה כעת עבור כימיה מבוססת בדיקה באמצעות ³ בדיקות מרווה כהות. פלטפורמה זו נעשה שימוש בעיקר עבור פרופיל גנטי בבני אדם ובעלי חיים ^{4 5.} זה הותאם לאחרונה לזהות פתוגנים DNA ו- RNA-מובל בדם על ידי ואח Grigorenko. ⁶ באמצעות הליך שני שלבים הפוכה שעתוק / טרום הגברה (preamp).

אנו מתארים כאן הליך מבוסס קדם מגבר אחד-צעד לגילוי שני סוגי פתוגנים שניות נשימהretions ומגוון של סוגי מדגם אחרים שיכול להתבצע אך ורק בתוך יום עבודה רגיל. עם ההשלמה קדם מגבר אחד-צעד, דגימות מועברות צלחת 384 גם, המהווה את הפורמט המקובל על ידי מערכת טיפול נוזל האוטומטית שמגיעה עם פלטפורמת ה- PCR ננו זה. המערכת שואבת את תערובת מאסטר ו המדגם על פני השטח של עד 4 צלחות (192 דגימות ובקרות) בכל פעם. בעקבות תהליך טעינה זה נתאר כיצד דגימות הם מוגברים ונותחו באמצעות גיליון אלקטרוני מאקרו המסכם את הממוצע של 3 משכפל טכני עבור כל שילוב מדגם / יעד בטבלה שמתאימה על דף מודפס אחד.

שיטה אחידה לניתוח DNA חילוץ ו / או RNA מן הדגימות באמצעות פלטפורמה זו הוקמה. מגוון רחב של דוגמאות חולץ, הפוך עבד, וטרום-מוגבר בפורמט 96-היטב, מזעור האפשרות לטעויות. דגימות נשימה שנבחנו כללו בין היתר מטליות אף, מטליות בלוע עמוקות,שטיפות טרנס-קנה הנשימה, שטיפה ברונכואלוואולרית, ואת רקמת הריאה. מכיוון שהחלק מהסוכנים הנבדקים עשויים להיות גם בהווה בדם היקפי או צואה, שילבנו סוגים אלה של דגימות לתוך ההליך. זרמי עבודה זה עוזר לחסוך זמן ומשאבים לעומת הפעלת ניסויים ב צלחות מרובות, בכך שהיא מאפשרת בדיקה יעילה באמצעות זיהוי גן לוח מבוסס הפתוגן הרעלן במקום של בדיקות בודדות. פנל הנשימה הפגין כאן היה 18 מבחנים בכל מודפס בשלושה עותקים באמצעות חורים, להכיל עד 48 דגימות לכל צלחת. הפתוגנים סוסים זוהה כלולים אדנו סוסים 1 ו -2, וירוס arteritis סוסים, וירוס נזלת סוסים ו- B, הרפס סוסים (EHV) סוגים 1 ו -4, או סטרפטוקוקוס שוה. הפתוגנים הכלבי כלול קורונה נשימת כלבים (betacoronavirus), וירוס כלבלבת, אדנו כלבים, וירוס parainfluenza כלבים, pneumovirus כלבים, Bordetella bronchiseptica, ו cynos Mycoplasma. אAssay שפעת אוניברסלית שליטה פנימית (הפאג RNA MS2) נכללו גם.

Protocol

לא בבני אדם או בחיות מעבדה שימשו לפיתוח של פרוטוקול זה. בקרות נוצרו על ידי טיהור של amplicons-אשר רצף בתעתיק במבחנה עבור מטרות RNA. דגימות קליניות הוגשו לבדיקת אבחון שיגרתית למרכז אבחון לבריאות בעלי חי קורנל.

עיצוב פלייט 1.

1. השתמש בתוכנת עיצוב פריימר כדי לוודא כי כל assay תואמת מבוסס בדיקה סטנדרטית תנאי אופני PCR בזמן אמת עם חישול 60 ° C באמצעות כלי בדיקת בדיקת פריימר (בחר את חללית כימות הגדרה עם פרמטרי ברירת מחדל).
   הערה: יעד RNA נציג בשימוש הותאמה מן השפעת האוניברסלית assay ממוקד מטריקס בהוצאת שו והאח ^'7.. פריימרים ואת החללית הן כדלקמן: פריימר קדימה: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, הפוך פריימר: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, בחון: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. את assay DNA הנציג משמש כאן הותאם לכאן ולכאןמ שיטת הזיהוי (EHV-1) ההרפס מסוג 1 סוסים בהוצאת איליה ואח '. ^8. פריימרים ואת החללית הן כדלקמן: פריימר קדימה: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, הפוך פריימר: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, בחון: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY.
2. להזמין צלחות הגברת ננו PCR בתצורה הרצויה.
   הערה: במחקר זה, פורמט ביטוי גני 18x3 שמש (טבלה 1). ספק רצפים לכל פריימרים וזונדים (או מזהי assay inventoried) לכל יעד דעתו של היצר.

2. הפקת חומצות גרעין

1. חלץ חומצות גרעין כולל (DNA ו- RNA) בכל דרך רצויה.
   הערה: ערכת חילוץ מגנטית אוטומטית מבוסס חרוז שמשה כאן על פי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים).
2. הכינו דגימות כדלקמן:
   1. נקה את החלק החיצוני של כל מכולת מדגם עם 10% אקונומיקה ולייבש היטב. נגב f הנתונה בכפפהטיפים אינגר עם אקונומיקה 10% בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.
   2. אף מקום או מטליות בלוע עמוקות בכל בקבוקון סטרילית, אטום (כגון צינור איסוף דם אדום העליון) עם כמה טיפות של תמיסת מלח הוסיפו למנוע התייבשות לפני העיבוד.
      הערה: כותנה, פלסטיק, עץ מטופל, ואת דקרון ו מטליות סינטטיות אחרות הן כל מקובל, אך להימנע מטליות אלגינט סידן.
   3. עבור מטליות ושוטפות קנו נשימה, להוסיף בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), כך שיש לפחות 1-2 מיליליטר של נוזל. וורטקס ספוגית ו DMEM במרץ בצינור. לאחר מכן, השתמש פיפטה להעביר כ 1 מ"ל של התקשורת לצינור חדש.
   4. מבחינה מכנית lyse רקמות (100-200 מ"ג 1 מ"ל של DMEM) באמצעות המשבש רקמת פי הוראות היצרן ואחריו צנטריפוגה 3 דקות ב 825 x ז. העבר 500 μl של supernatant לצינור חדש.
   5. עבור צואה, לשלב 400 מ"ג של צואה עם 800 μl של sa פוספט שנאגר 1xקו pH 7.4 (PBS). וורטקס ההשעיה דקות 1 או יותר עד המדגם הוא הומוגני או מושעה לחלוטין. לאחר הומוגני, צנטריפוגה ההשעיה עבור 10 דקות ב 18,000 XG, ולאחר מכן להעביר 400 μl לצינור חדש.
   6. עבור דם uncoagulated כולו, מערבולת המדגם ולעשות aliquot 250 μl. הוסף שש טיפות מגיבות ממס ו מערבולת לערבב. דגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
3. כן מאגרי תמוגה ולהתרחץ פי הוראות היצרן. להוסיף הפאג MS2 או בקרה פנימית של בחירה למאגר תמוגה כפקד חילוץ פנימי חיובי ^9.
4. להוסיף 235 μl של חיץ תמוגה 175 μl של המדגם (או PBS לבקרה שלילית) על צינור אחד חרוז. להמשיך עם הפרוטוקול של היצרן.
   הערה: מטוהרים חומצות גרעין הכולל היה eluted כאן 90 μl.

3. הפוך-שעתוק / Pre-הגברה (preamp)

הערה: שמור את כל ריאגנטים דגימות בשימושתגובת preamp על קרח בכל העת. בעקבות קדם מגבר, לשמור את כל ריאגנטים בטמפרטורת החדר.

1. להרכיב DNA eluted ו / או RNA, תערובת תגובת PCR, מים חופשיים nuclease כביקורת שלילית, ותקנים ויקוו לבקרת הגברה חיובית.
   הערה: עד 48 דגימות ניתן להריץ על צלחת הגברה לרבות בקרות (לכלול לפחות שליטת חילוץ שלילית אחד לכל צלחת חילוץ שממנו הדגימות הן להיות משך).
2. הדפס מפה מדגם. יש לבדוק אדם שני כי משחק פריסת המפה מדגם.
3. בתוך צינור 1.5 מ"ל, להוסיף את הדברים הבאים כדי להכין את תערובת הורים קדם מגבר.
   הערה: נפח סופי של 14 μl שימש כאן.
   1. הוספת מאגר של פריימרים מעורבבים מראש מכל יעד כזה כי הריכוז הסופי של כל פריימר הוא 900 ננומטר.
      הערה: הברכה משמשת כאן הוכנה בריכוז 10x, ו- 1.4 μl הוסיף לכל תגובה.
   2. להוסיף פריימרים אקראיים לריכוז סופי של 600 ננומטר או 0.1x.
   3. להוסיף תערובת RT-qPCR 2x למחצית הנפח הסופי (7 μl כאן).
   4. מערבבים את מרכיבי תערובת אמן יחד על ידי vortexing ו שצנח בעדינות.
4. בצעו את preamp בצלחת 96-היטב רגיל באמצעות בצד שמאל של הצלחת בלבד (עמודות 1-6).
5. להוסיף 8.5 μl של תמהיל מאסטר קדם מגבר ו -5.5 μl של דגימת DNA / RNA היטב כל אחד.
6. לאחר שילוב כל ריאגנטים (דגימות, בקרות חיוביות שולטים שלילי עם תערובת preamp), ביסודיות לאטום את הצלחת 96-היטב הרגילה עם חותם דבק ברור. הסר את כל חותם עודף באמצעות סכין גילוח כדי למנוע היווצרות של פערים חותמים במהלך רכיבה על אופניים. צנטריפוגה צלחת חתומה במשך 20 שניות באמצעות טווה הצלחת ה- PCR. בדוק כדי לוודא את כל ריאגנטים משולבים בתחתית בארות הצלחת.
7. הפעל את assay preamp על thermocycler קונבנציונאלי בתנאים הבאים: 15 דקות ב 50 מעלות צלזיוס; 1 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 20 מחזורים של 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 2 דקות ב 60 מעלות; 99.9 & #176; צלזיוס למשך 10 דקות; להחזיק ב 4 ° C.. תכנית אלה תנאים לפני התחילה.
8. הפעל את thermocycler הקונבנציונלית, בחר את תכנית האופניים קדם מגבר ולהתחיל את התכנית. מניח את הצלחת 96-היטב thermocycler רק כאשר החלק התחתון של thermocycler (לא העטיפה) מגיע לטמפרטורה הנדרשת לייצור cDNA (50 ° C) על ידי ניטור הטמפרטורה לקרוא על המסך. עוד קודם לכן, לשמור על קור הצלחת כדי למזער את הסיכון של הפקת תוצאות חיוביות כוזבות.
9. לאחר הריצה קדם המגבר תושלם, לוודא את הצלחת נותרה אטומה.
10. המשך מיד לשלב 4.1. כדי לאחסן צלחת זה לילה, לבצע הדילול כמתואר בשלבי 4.2 כדי 4.5, למעט במקום רופף מכסה את הצלחת, לאטום את הצלחת עם חותם דבק ברור ומקום בתוך שקית רוכסן נעילה, לאחסן 4 מעלות צלזיוס.

4. דילול של פלייט preamp

1. הסר את המספר המתאים של צלחות הגברה הלוך ושובמ במקפיא (עד 4 ניתן להפעיל בו-זמנית). אל תפתחו את האריזה. אפשר הצליח להתחמם במשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת חדר. רשום את מספר מספר הרבה הסידורי של הצלחת.
   הערה: צלחות שלא נפתחו יכולות להישאר בטמפרטורת חדר למשך עד 24 שעות, אבל עבור עבודה מומלצת, להסיר אלה מהמקפיא לא יותר מ -30 דקות הצורך לפני.
2. צנטריפוגה צלחת קדם המגבר השלימה במשך 20 שניות באמצעות טווית צלחת ה- PCR. הפעילו את מכונת הגברה המחשב ולהתחיל את התוכנית המשויכת.
3. הסר את כל הפריטים מיותר מאזור ההתקנה PCR. לבש כפפות כפולות וכיסויי שרוול.
4. הסר את החותם מהצלחת קדם המגבר ובזהירות להסיר ולסלק את הכפפות החיצוניות. לדלל את מוצרי קדם מגבר של 1: 5 על ידי הוספת 56 μl של חיץ TE היטב בכל עמודות 1-6 של הצלחת קדם מגבר 96-היטב ערבוב ידי pipetting למעלה ולמטה. לך רק התחנה הראשונה של פיפטה, aspirating מלמטה מהחלק גבוה יותר אבל לא יוצרבועות. להוסיף חיץ TE לכל 6 עמודות קשר בארות בשימוש.
5. יש לחתום מחדש את הצלחת עם או חותם דבק או רדיד ברור, צנטריפוגות במשך 20 שניות באמצעות טווית צלחת ה- PCR. גדר צלחת זה צידה (מכוסה באופן רופף) עד שלב 6.1 הושלם. בטל כפפות נותרים וכיסויי שרוול.

5. הכנת העברת 384 גם על רפידת ההגברה

1. הגדר את החומרים הדרושים כדי לכסות ולאטום את צלחת ההגברה: מכסה, תקע, מזרק של נוזל טבילה, לחץ צלחת, בקבוק להשפריץ אתנול, ומגבוני מעבדה נטולי סיבים. הסר את מכסת המזרק וכלא טיפ פלסטיק קטן על המזרק (דורש כוח). הוצא כמות קטנה של נוזל טבילה על מגבת נייר כדי להסיר הצטברות אוויר (זה בסדר אם בועות אוויר קטנות כמה להישאר הקצה). השתמש נוזל טבילה בתוך 60 דקות של הסרת מזרק מהשקית אלומיניום אטום ואקום. לאחר מזרק נפתח, לא לצרף את הכובע לשימוש מאוחר יותר.
2. לבדוקכי לפח האשפה של המטפל נוזל טעינת הצלחת ריק ופתח את קופסא טיפים. כתוב את תאריך התפוגה של הטיפים על עטיפת אריזת העצה כאשר תיבה חדשה נפתחת, ולהבטיח כי הטיפים הם לא פגו. הפעל את המטפל ואת המחשב הנוזלי לפתוח את תוכנת מטפל הנוזלית, אשר תבצע בדיקה עצמית.
3. לחץ על "הגדרת עומס". לחץ על "עיון" כדי לבחור את קובץ ה- CSV שנוצר מתוכנת Tracker לדוגמא. אם הקובץ אינו מופיע, עבור אל "העדפות Instrument / ערוך" ולאחר מכן לחץ על "שינוי" על ידי "תיקיית קבצים פלייט מדגם". בחר את התיקייה שבה נמצא קובץ CSV נשמר. לאחר מכן, לחץ על "Setup ו טען", ואז "עיון" ובחרו את הקובץ.
4. לאחר מכן, לחץ על "עיון" ליד "מיקום פלייט מחזיק 1" ובחר בקובץ TPF (המסופק על ידי היצרן) שיש לו את אותו מספר סידורי כמו הצלחת.

6. העברת נוזלי הנדלר

הערה: אל תתחיל fiומילא את הצלחת 384 גם עד כל השלבים לעיל הושלמו. אידוי הוא דאגה עם כמויות קטנות - לא נותן את צלחת 384 גם לשבת חשפה עם נוזל בפנים.

1. לאחר כל השלבים לעיל הושלמו לשים על חדשות, מצוידת היטב כפפות כפולות ושרוול מכסה. לאחר מכן, להוסיף 2.5 μl של תמהיל מאסטר הגברה לצלחת 384 גם.
2. העבר 2.5 μl של מוצר קדם מגבר מדולל לצלחת 384 גם על פי המפה בטבלה 2 ומייד לכסות את הצלחת בחוזקה עם חותם אלומיניום. בטל כפפות חיצוניות וכיסויי שרוול.
3. צנטריפוגה צלחת 384 גם במשך 20 שניות ב טווה הצלחת ה- PCR.
4. אין להסיר את חותם האלומיניום, אך למקם את הצלחת 384 גם במטפל הנוזלי.
5. פתח את החבילה המכילה צלחת הגברה עטופה ולמקם אותו בזהירות במטפל הנוזלי בחריץ הראשון עם המספר הסידורי בצד ימין - להחזיק במקרה בקצותיו בלי לגעת o המשטחf הצלחת. להשתמש בצלחות לא עטופות בתוך שעה אחת של פתיחה.
   הערה: המטרה במקרה היא להגן על הצלחת מלהיות נגעו, שכן זה יכול להפריע את הכמויות הקטנות של primers ו בדיקות בתוך החורים דרך.
6. הסר את חותם האלומיניום מצלחת 384 גם בתוך המטפל הנוזלי כל פעם הוא במקום. לחץ על הבא ולאחר מכן לבדוק את כל תיבות כמו כל שלב הושלמה. לחץ על אישור כדי להתחיל את הריצה.
7. סגור את הדלת אל המטפל נוזלי ומיד להתחיל את תהליך המילוי. הישאר ליד המטפל הנוזלי ומייד להמשיך לשלב הבא לאחר הצלחת מלאה.
8. בעוד המטפל הנוזלי פועל, הסר את סרט המגן מהחלק התחתון של מכסה מקרה.
   הערה: הדבק בתחתית מכסת המקרה מכוסה על ידי סחבת וסרט מגן. הסרט צריך להיות מוסר ראשון שניגש הסחבת.
   1. השאר את הסרט העליון במקום עד שלב 6.15. ראש הסחבת ידי משיכת מעט releasדואר זה מחומר ההדבקה.
9. הסר את צלחת הגברה (מלא) טעון מן המטפל נוזלי ומניחים בעדינות זה בעיתונות צלחת עם המספר הסידורי בצד ימין.
10. מניחים את המכסה על גבי צלחת עם המגרעת מימין ההדבקה שבחלק התחתון (מצביעה לעבר צלחת).
11. לנתץ על מנוף העיתונות צלחת בזהירות סגירתו; האור יהבהב במשך 20 שניות. אל תיגע בעיתונות צלחת במהלך הזמן הזה. ברגע שהאור יתחלף לירוק מוצק, להרים את הידית בזהירות ובזהירות להסיר את צלחת חתומה על ידי מחזיק אותו על הקצוות.
12. תוך כדי לחיצה על צלחת ההגברה האטומה אנכית בקצותיו של המקרה, מייד להכניס את קצה המזרק לתוך בנמל הטעינה בסוף המקרה, אז לוותר על נוזל הטבילה לאט באחד תנועה רציפה עדינה כדי למלא את החלל בין הצלחת ואת מִכסֶה. השאר בועות אוויר אחד קטנות בפינה אחת הצלחת הוא שקועה.
13. תוך המשך hאנכי הצלחת הישנה בקצותיו, לאטום בנמל הטעינה על ידי הוספת התוספת ליציאה, פוכר את שעון התקע, הפעלת לחץ מספיק עד הידית משתתקת. גריפ את הקצוות של המקרה בחוזקה, כך שהכח של שבירת הידית אינו גורמים במקרה לרדת. אם צלחת הוא ירד, ושומרים אותו.
14. נקו את המקרה עם ונטולת מוך לנגב כי כבר ריססו ביסודיות עם אתנול. כדי לייבש את המקרה, לנגב את המקרה כלפי מטה עם נקי לנגב. בעדינות לטפל במקרה; לא להיות בטוח כדי להפעיל לחץ על הזכוכית מעל הבארות.
15. תביא את צלחת החתום על מכונת ההגברה. בכרטיסייה "כלי", בחר "כלי מסוף". בחר את מכונה ההגברה ואז ללחוץ על כפתור ה "הדלת הפתוחה".
16. מניח את הצלחת ההגברה בחריץ הראשון של מתאם הצלחת, בדיקה שהמתאם מיושר נכון עם A1 בפינה השמאלית העליונה. אוריינט הצלחת עם ברקוד פונה כלפי מעלה וכלפיהחלק הקדמי של המכשיר. לחץ על כפתור "סגור את הדלת". שים לב לשימוש של מגש המתאם - יש גבול של 10 שימושים.
17. בכרטיסיית דף הבית בתחתית המסך, תחת תפריט ההפעלה, בחר OpenArray. לחץ על "קבל מזהי פלייט." התיבות הריקות תמולאנה אוטומטית עם מידע על הצלחת. כדי להתחיל את הריצה, לחץ על "התחל הפעלה".
18. סגור את תוכנת מטפל הנוזלית ומכבה את המטפל הנוזלי. מניח את המכסה להתהפך מדף הקצה. מחק את הטיפים מהסל פסולת ולנקות אותו. נקי לטהר את כל הפריטים כוללים משטח העבודה, פיפטה, דלי פסולת, ותיבות טיפים.
19. יש לחתום מחדש את הצלחת קדם מגבר עם חותם ולאחסן דבק ברור ב -20 ° C.

7. ניתוח תוצאות

1. לאחר הריצה השלימה, שמור את הקובץ ולאחר מכן לחץ על "X" על הלשונית עם שם ריצה בתחתית המסך כדי לסגור את התיק.
2. לחץ על "דלת פתוחה"בחלק העליון של המסך כדי לפתוח את הדלת. הסר את צלחת ההגברה, בדיקה ששום נוזל טבילה יש דלף החוצה. לחץ על" סגורה דלת "בחלק העליון של המסך כדי לסגור את הדלת.
3. לחץ על "פתח" ולבחור את הקובץ לרוץ כדי לפתוח אותו. לחץ על ירוק לנתח כפתור בפינה הימנית העליונה של המסך. לחץ על "ייצוא" בצד שמאל של המסך ולאחר מכן "ייצוא התחל" כדי לייצא את התוצאות (כקובץ .txt). מזער את הקובץ לאחר שהוא פותח. לאחר מכן, לחץ על "ייצוא תמונות QC."
4. בדוק את תמונות QC בתכנית ניתוח תמונה על פי הקריטריונים הבאים:
   1. הערכת איכות הפריקה השתמשו PRE-READ_CHANNEL_4.tiff ופוסט READ_CHANNEL_4.tiff, על ידי סימון כי אין כתמים או כתמים כהים.
      הערה: לצבוע זוהה על ידי ערוץ זה מתווספת על ידי היצרן אל primers ו בדיקות, אשר שוחרר לתוך פתרון כאשר התגובה נטענת. הקריאה באפיק זה עולה כי התגובות היו כמו שצריךטיעון וכי פריימרים ואת החללית מעורבבת עם צבע נכחו.
   2. בדוק דליפות או תסיסה לצלחת לאחר הטעינה באמצעות S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. אם התמונה נראית כהה, להגביר את הבהירות (לחץ על Ctrl + Shift + C כדי לפתוח את פקדים) עד הצלחת כולו גלויה. בדוק כי התמונה נראית אחידה ללא צללים, בועות, או דוגמאות מבתיהם.
   3. הערכת מיקום מכסה ופסולת מתחת למכסה (כתמים בהירים) באמצעות STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff ו STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff.
5. אופציונלי: פתח גיליון אלקטרוני המכיל את מאקרו תוצאות (קובץ קוד משלימה). בקובץ הנתונים המיוצא, לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה בתחתית המסך ובחר "העברה או העתקה". בשדה "כדי להזמין", בחר "תוצאות Macro.xlsm". לחץ על "העבר עד הסוף" וסמן את התיבה "צור עותק". לאחר מכן, לחץ על אישור.
   1. אם האפשרות מאקרו תוצאות אינה מופיעה בשדה "להזמין", simרובדי להעתיק את התוכן של גליון העבודה קובץ הנתונים המיוצאים (לחץ על התא בפינה השמאלית העליונה כדי להדגיש את כל התאים ו- Ctrl-C) ולהדביק אותו לתוך לשונית חדשה.
6. מחק את הכרטיסייה "יצוא" הישנה ולאחר מכן שנה את הכרטיסייה חדשה שנוספה כמו "יצוא".
7. לחץ "Alt-F8" (או לחץ על הצג ולאחר מכן פקודות מאקרו) ולאחר מכן בחר "מאקרו" ולחץ על "הפעל". ואז חוזר על זה Macro2 ידי לחיצה על "Alt-F8" ובחירה באפשרות "Macro2" ולחיצה על "הפעל".
8. שנה את שם קובץ מאקרו תוצאות באמצעות המידע הרלוונטי (תאריך מספר סידורי), לשים את המידע הזה מעל השולחן, ולשמור כמו אותו שם קובץ בתיקיית התוצאות המיוצאת. לבסוף, להדפיס את טבלת התוצאות שנוצר מאקרו.
9. בשנת את תוכנת המכשיר הגברה, לבדוק את עקומות עבור כל דגימה ובקרה על השולחן המאקרו על ידי בחירת מגרש ניתוח / הגברה בצד שמאל של המסך. לאחר מכן, בחר בכרטיסייה לדוגמא, ולחץ על כל דגימה כדילאשר שיש 2 או 3 עקומות הגברה חיוביות לכל אחת התוצאות החיוביות בטבלה.
10. כבה את מכשיר ההגברה.

תוצאות

תוצאות מוצגות איורי 1 ו -2 עבור assay RNA נציג (מטריקס שפעת) ו assay DNA (EHV-1) עם שילוב של בקרות חיוביות דגימות קליניות שהוגשו לבדיקת אבחון שיגרתית. אותות הקרינה הנפלטת ברחבי תגובה אופיינית זו מוצגים באיור 1, אשר מגרש ערכי קרינת גלם למחזור. כל סף מחזור יחסית (CT) הערכים שנוצרו באופן אוטומטי על ידי תוכנת מכשיר הגברה. רקע קרינה שמשה כמדד נפרד עבור הערכה של איכות טעינה ולא לשלב אותו לתוך קריאות הקרינה לפני חישוב ערכי ה- CT.

מגבלת אנליטי של זיהוי (לוד) לכל יעד חושבה על בסיס ממוצע הכולל של ערכי ה- CT ברמת זיהוי 95% בתוספת 2 סטיות תקן בתוך שלולית של בקרות עבורכל המטרות. הדילול הגבוה ביותר שבו לפחות 95% של המשכפל היו חיוביים עבור מבחני הנציג היה 50 עותקים; זיהוי של 5 עותקים היה מוצלח ב -50% של משכפל. assay לא זוהה ב להלן עותק אחד. LODs עבור assay רנ"א ודנ"א חושבו ערכי ה- CT של 21.92 ו 20.05. ערכים אלה נחשבו להיות ההפסקות עבור ערכי דיווח כחיוביים לעומת חשוד (בפוטנציה לא דיר).

היבטים אחרים של ביצועים האנליטי של המטרות הוערכו באמצעות דילולי סדרה של בקרות חיוביות ותקווינה לרוץ על שלושה ימים שונים (איור 2). הנצילות הממוצעת של מבחני רנ"א ודנ"א נציג היו 101.1% ו 106.6%; את היעילות הכוללת הממוצעת עבור כל המטרות היה 101.3%. המבחנים גם היו ליניאריות טובים (R ^2> 0.98). וריאציה בתוך לשכפל דרך חורים בדרך כלל הייתה בתוך סטיות תקן של 0.2 הם דגימות קליניותשולט ד. אין תגובה צולבת בין המיקודים נצפתה.

גיליון התוצאות הסופיות בקובץ המשלים מראה תוצאות כמותיות נציג 10 דגימות אבחון קליניות ו -4 שולטת. הדגימות הקליניות הן קבוצת משנה של סוגי דגימות שנבדקו שגרתי כולל אף / מטליות לוע תחתונות, רקמת ריאה, דגימות צואה. אחת (סוסים) דגימת צואת קבוצה זו מציגה בקרה פנימית MS2 נכשלה, אשר מעידה על קיומו של מעכבים במדגם. זה בדרך כלל מנוהל על ידי דילול של המדגם eluted ו / או מחדש החילוץ. כמו במקרה כאן, שליטת ההגברה השלילית צריכה להיות שלילית עבור כל המטרות, ואת שליטת החילוץ השלילית צריכה להכיל רק את הבקרה הפנימית. במערכה הקלינית, דגימות פיק ערכי ה- CT עבור betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, וירוס כלבלבת, וירוס parainfluenza כלבים, pneumovirus כלבים, ושפעתא.

איור 1. חלקות הגברה. קריאות הקרינה הם זממו נגד מחזורים הגברה עבור assay RNA (א) ו assay DNA (B). משולשים מוצגים המציין ערכי ה- CT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. עקומות סטנדרטיות. עקומות סטנדרטיות מן assay רנ"א ודנ"א נבדק על שלושה ימים שונים הם זממו כדי להדגים את הליניאריות ומגוון הגברה באמצעות בקרות חיוביות. סף מחזור (CT) ערכים הם זממו נגד יומן (10) של מספר העותקים של RNA (א) או DNA ( B) סטנדרטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סכמטי לוח 1. ממיקומי צלחת יעד ההגברה. הצלחות המשמשות לבדיקות ננו בזמן אמת PCR על פלטפורמה זו הוא מיקרוסקופ שקופיות בגודל מסודרים 48 subarrays של 64 דרך נקבית, עם סך של 3,072 דרך חורים עבור שתגובות אישיות. subarray אחד מוצג כאן, עם 18 מטרות בשלושה עותקים. מדגם כל מתווסף subarray אחד על ידי המטפל הנוזלי. צלחות מצופות תרכובות הידרופילי הידרופובי לשמור ריאגנטים ב-חורים דרך באמצעות מתח הפנים. שבב הנירוסטה "מתובנת photolithographically ורטוב-חרוט כדי ליצור מערך מרובע של 3,072-במכונת מייקרו, 320 מיקרומטר diamete. r חורים של 33 nl כל ^"2 קיצורים עבור המטרות הן כדלקמן: BCOR, קורונה הנשימה כלבים (betacoronavirus); Bord, Bordetella bronchiseptica CAV, אדנו כלבים; CPIV, וירוס parainfluenza כלבים; CPNV, pneumovirus כלבים; DISTA / B, כלבים כלבלבת וירוס A ו- B; EADV1 / 2, אדנו סוסים 1/2; EAV, וירוס arteritis סוסים; EHV1 / 4, סוג ההרפס סוסים 1/4; ERVA / B, וירוס נזלת סוסים A / B; IVM, שפעת A מטריצה; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, הבקרה הפנימית (הפאג RNA MS2); SEQU, שוה סטרפטוקוקוס.

מפת פלייט העברת טבלת 2.. מפת העברה בצבעי צלחת בעזרת פיפטה 8 ערוצים קבועים להעביר מהצלחת קדם מגבר 96-גם הצלחת 384 גם מוצגת. לחילופין, פיפטה מתכווננת ניתן להשתמש. ההליך אותו מבוצע בכל פעם ללא קשר h ow דגימות רבות נמצאות הצלחת.

קובץ משלימה. קובץ גיליון אלקטרוני מאופשר מאקרו המכיל שתי פקודות מאקרו עבור תוצאות עיצוב לתוך טבלת סיכום (כמתואר בפרוטוקול) מסופק. שולחן תוצאה אופייני שנוצר על ידי הפקודות מאקרו נכלל בקובץ (תחת תוצאות סופיות). שתי פקודות מאקרו ימלא את שמות מדגם בעמודה הראשונה (עד 48 דגימות) ואת הממוצע של שלושת ערכי ה- CT לכל יעד עבור אלה עם תוצאות חיוביות; מטרות לב שלא להגביר להופיע ריקות בטבלה זו. זה יכול בקלות להיות מודפס על פיסת נייר אחד והשתמש כהפניה לבדיקת הנתונים הגולמיים ביעילות. בלשונית התוצאות הסופיות, תוצאות נציג 10 דגימות קליניות ו -4 שולטת מוצגות. קיצורים לשמות assay הם שבאגדה של טבלה 1."Target =" www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

הליך זה נעשה שימוש עבור בדיקות שיגרתיות של פתוגנים נשימה במעבדה שלנו במשך שישה חודשים (2-3 פעמים בשבוע). גם יש לנו הצלחה באמצעות אותו התהליך עבור פרופיל הפתוגן מעיים בדגימות צואה ומבודדת חיידקים על צלחת אישית בנפרד. לאחר הצלחות יוצר, צוות מנוסה יכול לבצע את שלבי 2-7 בתוך יום עבודה אחד רגיל. השלבים הקריטיים ביותר הם האיטום התקין של הצלחת קדם המגבר, העברת דגימות preamplified בין לוחות (אשר חייב להיעשות במהירות כדי למנוע אידוי), ואת הכיסוי הסופי של צלחת ההגברה. שימוש בגיליון האלקטרוני מאקרו כמדריך לניתוח תוצאה (בדיקת עקומות עבור דגימות ובקרות) היה קריטי גם כפי שהוא הקטין באופן משמעותי את משך הזמן ואת הניירת דרושה בתהליך זה. הגיליון המאקרו סיפק דוגמה; זה היה צריך להיות שונה או נוצר מחדש עבור צלחות עם תצורות שונות. זה יכול בקלות להיות PErformed ידי מישהו עם ידע גיליון אלקטרוני בסיסי.

בשל כמות קטנה מאוד של המדגם טעון לצלחת הגברה (33 NL), נדרשת הגברה מראש. בשנת אופטימיזציה של פרוטוקול זה (לא מוצג), השווינו מספר פרמטרים preamplification כולל מיקס מאסטר, תוספת של פריימרים אקראיים, מספר מחזורי, זמן חישול, ודילול לפני הגברה. היו כל יעד תנאים אופטימליים משלה, ואלה המתוארים כאן מייצגים אלה הניבו את הגבול הטוב ביותר של הכללית זיהוי לפנל שלנו. פנל זה מכסה מגוון רחב של מטרות פתוגניים וסוגים מדגם כי הם נתקלו בדיקות אבחון וטרינרים שיגרתיות, אבל שינויים לנהלי preamplification עשויים להיות נחוצים עבור פנלים שונים. תנאי הגברת אופטימיזציה היצרניות מבוססים על פרוטוקול ה- PCR בזמן אמת המבוססת על בדיקה סטנדרטית עם 10 דקות ב 95 מעלות הפעלת אנזים C ואחריו denaturation על 95 מעלות צלזיוס ו אןאילינג / רחבה על 60 מעלות צלזיוס. פריימרים וזונדים הם מודפס מראש על הצלחות גם באמצעות תנאי אופטימיזציה יצרן ולכן אינו דורש טיטרציה. שילוב היפך-שעתוק צעדי הגברה מראש עבור כל הדגימות (ללא תלות בסוג של יעד) היה הכרחי על מנת לשמור על יעילות בתהליך העבודה. לאחר כל הדגימות הפוכות עבדו הוא גם מועיל עבור למקסם את הרגישות. יתר על כן, שימוש תערובת אמן עבור קדם המגבר כי הוא מותאם במיוחד מעכבי מזעור מאפשר צדדי שילוב סוגי מדגם שונים על אותה הצלחת.

המרכז לבקרת מחלות (CDC) assay מטריקס שפעת מתואר על ידי שו et al. ⁷ והמותאמים כאן לתגובות בקנה מידת nanoliter הוא שפעת אוניברסלית assay שמתאימה מדגמי בדיקות מבני אדם ובעלי חי לוויה. זה היה מתוכנן לגילוי אוניברסלי של הגן מטריצה ​​של כל וירוסים שפעת באמצעות מחשבה בקנה מידה מיקרוליטרctions. זה כבר נעשה שימוש ברחבי העולם כחלק לוח וירוס האדם שפעת CDC ולוח שפעת החזירים CDC. את assay EHV-1 ⁸ מותאמים כאן מזהה פתוגן נשימה חשוב של סוסים שיכולים לגרום הפלות ומחלות נוירולוגיות (נבדק על ידי Pusterla ו Hussey ^10). המשמעות של התאמת בדיקות אלה פלטפורמת תפוקה גבוהה עם בקרה פנימית-עצמאי מינים היא שהם יכולים להיות משולבים בתוך גישת מעקב OneHealth. בשניהם של מבחנים אלה על פלטפורמת בדיקות תפוקה גבוהה יקל כוננות חירום עבור מתקנים קליניים, מקלטים, ואירועי ביצועים.

התוצאות שתוארו לעיל היו נציג של כל המטרות על הצלחת למעט Mycoplasma cynos, אשר הראה הרבה יותר וריאציה בביצועים אנליטית. זה היה כנראה עקב טמפרטורת ההתכה תת אופטימלית _(מ T) של פריימרים, אשר אידיאלי צריך להיות 58-60 &# 176; C (החללית האידיאלית TM היא 68-70 מעלות צלזיוס). הגבלה של פלטפורמה זו היא כי זה לוקח יותר זמן כדי לתכנן ולייצר הצלחות מאשר להזמנת בדיקות בודדות, אשר מגבילה את היכולת לשנות רצפים במהירות. מגבלה נוספת של real-time PCR בכלל היא חוסר היכולת לזהות רומן או פתוגנים לא צפויים. זו ניתן להתגבר במידה מסוימת על ידי עיצוב מבחני תואמי רצפי מינים רבים, אבל רצף הגנום משוחד כולו מתודולוגיות מבוסס מתאימות יותר עבור חשיפת סוכני רומן. ^11,12

PCR בזמן אמת ננו מאפשר פרדיגמה חדשה מבוסס תסמונת ולא בדיקות מינים מבוססים, אשר הן שימושי עבור הפחתת עלויות מגיבים ועבודת אבחון מולקולרי תפוקה גבוהה. בדיקות לוח בקנה מידה גדול על ידי גישה זו יכולה להקל המאמצים מעקב OneHealth כגון אלה המתוארים על ידי דאן Gurfield ¹³ ו Moutailler et al. ^14. אוסף של דגימות ספוגיות מוקדם,בדרך כלל בתוך 3 ימים מהופעה קלינית, מספק את הסיכוי הטוב ביותר לזהות את נוכחותם של פתוגנים נשימה. הופעתה מחל זיהומיות היא לעתים קרובות בלתי צפויה, ובדיקות שניתן לבצע על מינים שונים ללא צורך שינוי של ריאגנטים הן אידיאליות עבור מוכנות. יישומים עתידיים של הטכנולוגיה הזו צפויים להיות ב pathotyping, פרופיל עמידות לאנטיביוטיקה, ולוחות אבחון קליניים מבוסס תסמונת נוספת. PCR בזמן אמת ננומטריים שימושי ביותר עבור לסינון מהיר, תפוקה גבוהה של סוגי מדגם הפתוגן מרובים, יהיה כהשלמת גישות המבוסס על רצף משוחדים או מוטות חלקית לזיהוי פתוגנים חדשים המתהווה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zap-OGlobin II lytic reagent	Beckman Coulter	7546138	Optional reagent for preparing blood samples.
Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.
2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
Gene-specific primer pool	IDT	custom order	Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.
Random primer mix	New England Biolabs	S1330S
Standard 96-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	N8010560	This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.
Amplification master mix (OpenArray master mix)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4462164
Clear adhesive seal	Thermo-Fisher	430611
Foil seal	Excel Scientific	AF-100
384-well plate	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4482221
Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.
Accessories kit	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4469576	Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
Liquid handler (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	This is purchased with the amplification machine.
Primer design software (Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications.
Image analysis program (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4375786	Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.
PCR plate spinner	VWR	89184-608	This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.
TE buffer	Millipore	8890-100ML	10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0