אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה פרוטאומיקה כמותית באמצעות טכניקה של תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) כדי לנתח את ההשפעות של זיהום HIV-1 על proteomes מארח exosomal. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם תאים בתנאי קיצון או זיהום שונים.

Abstract

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introduction

מחל אנושיות רבות, כוללים זיהומים נגיפיים, הקשורים לעתים קרובות עם תהליכים תאיים ייחודיים המתרחשים בתוך ומסביב התאים הנגועים. חלבונים, לעיתים קרובות מתנהג כמו effectors הסלולר האולטימטיבי, לתווך תהליכים אלה. ניתוח של חלבונים יכול לעיתים קרובות לספק מידע רב ערך לגבי הסביבה המקומית של התאים הנגועים ולעזור לנו להבין את המנגנון הבסיסי של בהיווצרות המחלה. בין טכניקות ניתוח חלבון שונות, פרוטאומיקה מחזיקה במיוחד הבטחה גדולה. ככלי רב עוצמה, בקנה מידה גדול, פרוטאומיקה יכול לספק הבנה מערכתית של תהליכים תאיים, במיוחד בתחום של הפונקציה ואת האינטראקציה של חלבונים. ניתוח חלבונים ספציפיים נעשה פשוט יותר באמצעות הפיתוח של טכניקות תיוג, המאפשרות לחוקרים לעקוב אחר הביטוי של מרכיבים תאיים, במיוחד חלבונים, באתר של חקירה. למרות ניתוחים proteomic רבים בוצעו על הסלולרסולם proteome, אפיוני proteomic על תאי subcellular הוכיח להיות במיוחד אינפורמטיבי ^1. זה בא לידי ביטוי גם במחקרים של הידבקות ב- HIV-1.

Exosomes, 30-100 שלפוחית קרום ננומטר המופרש על ידי מגוון רחב של סוגי תאים ^{2, 3,} הם מרכיבים קריטיים של תקשורת בין תאית ותחבורה מולקולרית. הם התגלו בעבר למלא תפקידים חשובים בתהליך ⁴ ניצני ^{HIV-1, 5.} על ידי שילוב של ניתוח proteomic עם לנתיחה פונקציונלית, מצאנו כי exosomes שוחרר מבית HIV-1 תאים נגועים מורכב מולקולות רגולטוריות חתימה ונמל חלבון ייחודיות כמותית שונים המשפיעות תכונות הסלולר על תאי שכנים פתוחים, כוללים אפופטוזיס הסלולר ושגשוגם ^6. השיטות מתוארות פרוטוקול זה,כלומר SILAC (תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים) ⁷ אפיון proteomic מבוסס של exosomes מתאי נגועים ב- HIV-1. ניתן ליישם גישות דומות כדי להבין טוב יותר תאים subcellular אחרים בזמן בפתוגנזה ידי התאמת הלחץ ניסיוני לתא או חלק מסוים של עניין ולהפוך את השינויים הדרושים כדי ההליכים המתוארים.

בהינתן ההתפתחות האחרונה של שיטות proteomic כמוני, יש הרבה לבחירה בעת בחירת השיטה היעילה ביותר עבור ניסוי מסוים. ביניהם ניתן למנות את iTRAQ מבוסס הכימי (תגי isobaric כימות יחסית ומוחלטת) ⁸ ואת ללא התווית MRM (ניטור תגובה מרובה) ⁹ טכניקות. שתי השיטות הם כלים רבי עוצמה הם בחירה טובה עבור הגדרות ספציפיות. עבור מעבדה אופיינית בעיקר בעבודה עם שורות תאים, עם זאת, יש שתי שיטות אלה relatively עלויות גבוהות יותר והם יותר זמן רב בהשוואה לשיטה המבוססת SILAC. SILAC היא טכניקה תיוג מבוסס מטבולית המשלבת צורות איזוטופי nonradioactive של חומצות אמינו מן התקשורת והתרבות לתוך חלבונים תאיים. בדרך כלל, ניסויי SILAC להתחיל עם שתי אוכלוסיות תאים, למשל, נגוע נגוע. כל שכותרתו דיפרנציאלי בסביבת איזוטופים הספציפית שלה עד תיוג מלא מושגת. Exosomes שכותרתו של תאים אלה חשופים אז כדי מיצוי חלבון. לאחר שחולץ, חלבוני exosomal שכותרתו מנותחים באמצעות ספקטרוסקופיית מסות טנדם כרומטוגרפיה הנוזלית ^10. לבסוף, את התוצאות ספקטרומטריית מסה וחלבונים שכותרתו משמעותית חשופים סטטיסטי וביואינפורמטיקה מנתח וכן אימות ביוכימיים קפדנית. התחקירים הקודמים שלנו מראים כי נהלי SILAC / exosome מתאימים יותר עבור שורות תאים מאשר תאים ראשוניים, כמו שורות תאים בדרך כלל נמצאותמדינה מתרבה פעילה עבור תיוג איזוטופי יעיל,

Protocol

1. תא תרבות ו- HIV-1 זיהום

הערה: לפני שמתחילים ניסויים, מומלץ לבדוק את הכדאיות של התאים באמצעות Trypan כחול מכתים ¹¹ ושגשוגם שלהם באמצעות assay MTT ^12. זה גם קריטי להשתמש בינוני SILAC מוכן חדש. שורות תאים שונות ניתן להשתמש, כל עוד הם נמצאים בשלב שגשוג פעיל, והם רגישים זיהום HIV-1, או תנאי הבדיקה של בחירה. בפרוטוקול זה, השתמש שורת תאי H9 כמו בדוגמא.

1. Seed 2 x 10 ⁶ תאים H9 לתוך בקבוק אחד תרבית תאים. לגדול קבוצה אחת ב 10 מ"ל שכותרתו RPMI 1640 בינוני המכילה סרום שור 10% dialyzed העובר (FBS), 100 מ"ג / L ¹³ C ₆ L-ליזין 100 מ"ג / L ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-arginine. לגדל את הקבוצה השנייה ב 10 מ"ל בינוני ללא תווית RPMI 1640, עם 10% dialyzed FBS, 100 מ"ג / L L- ליזין ו -100 מ"ג / L L- ארגינין.
2. לגדל את התאים במשך שש הכפלות ובנקודת החלבונים של התאים במדיום שכותרתו כמעט מסומנים לגמרי (> 99%) עם חומצות אמינו כבדות. הוסף מדיה טריה או לשנות תקשורת באופן קבוע (כל 1-3 ימים, תלוי בסוג של תאים. לקבלת תא H9, לשנות בינוני כל 3 ימים). בסוף תיוג, להגדיל את נפח תרבות (למשל ~ 30 מ"ל) כדי להתאים את הצמיחה של תאים יותר.
   הערה: בדוק תא מדויק זמן הכפלה בתחילת הניסוי באמצעות מכתים Trypan הכחול תא ספירה.
3. להדביק את התאים שכותרתו עם HIV-1 _NL4-3 באמצעות פרוטוקול הידבקות ב- HIV-1 תקן ¹³ במשך 48 שעות. דגירה התאים עם כמויות מתאימות של וירוס עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) סביב 0.3. בדוק הידבקות ב- HIV-1 על ידי כימות p24 של supernatants תרבות באמצעות ערכת ELISA אנטיגן p24 HIV-1. בצע assay immunofluorescence ¹⁴ כדי לאשר זיהום מוצלח של תאים. Keep גדל התאים ללא תווית במדיום ללא תווית ללא הידבקות ב- HIV-1.
4. קציר supernatants של שתי הקבוצות בסוף זיהום (שלב 2.1).

2. בידוד Exosome

הערה: באמצעות סדרה של צעדי ultracentrifugation, שברי exosomal מן supernatants התרבות מועשרים ^15. בצע את כל השלבים הבאים ב 4 ° C, עם הרוטור ultracentrifuge שיכולים להגיע למהירות של g x 100,000 לפחות.

1. אסוף את supernatants של תרבויות ב 50 צינורות חרוטי מ"ל, הימנעות תאים. צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ב 300 XG כדי להסיר תאים הנותרים.
2. אסוף את supernatants צינורות חרוטי חדש 50 מ"ל ו צנטריפוגות אותם במשך 10 דקות XG ב 2000 כדי להסיר תאים מתים. העברת וכתוצאה supernatants לצינורות הרוטור תואם מסחרי כי הם מסוגלים לעמוד ultracentrifugation.
3. הקפד לאזן את צינורות ultracentrifuge. צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב XG 10,000 להסירפסולת תא.
4. אסוף את supernatants צינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות במשך 70 דקות ב 100,000 x ז. מחק את supernatants.
5. Resuspend את הכדורים עשירים exosome ב 5 מיליליטר של PBS הטרי. מעביר את פתרונות צינורות צנטריפוגות ultracentrifuge טריים שוב במשך 70 דקות ב 100,000 x ז.
6. supernatants מחק. כדי לאחסן את exosomes לטווח ארוך, resuspend את הכדורים ב 50 μl של PBS ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לחלופין, להמשיך ישירות מיצוי חלבון כמוצג להלן.

3. חלבון כרייה הכנה

1. ממיסים כדורי exosomal מבודד 100-200 μl Ripa חיץ תמוגה והפקת עם קוקטיילים מעכב פרוטאז הוסיף. המאגר מורכב של 25 מ"מ טריס-הידרוכלוריד, 150 נתרן כלורי מ"מ, 1% NP-40, deoxycholate נתרן 1%, ו -0.1% SDS (סולפט dodecyl נתרן), ב- pH 7.6. קוקטיילים מעכב פרוטאז צריך להכיל מגוון של מעכבי פרוטאז, כגון aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A ו- EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic), שיכולים לעכב מגוון רחב של פרוטאזות.
2. צנטריפוגה הפתרונות מומס במשך 10 דקות ב 13,000 XG (4 ° C), ולהעביר את supernatants פינה צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש.
3. לכמת ריכוז החלבון של כל דגימה של exosomes באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או ברדפורד assay ^16.
4. מערבבים כמות שווה של חלבונים (2 מיקרוגרם) ממדגמים שכותרתו ללא תווית ולהפעיל את תערובת שווה על ג'ל 4-20% SDS-PAGE ב 120 מילי-אמפר / 200 V למשך 30 דקות.
5. ג'ל הכתם עם Coomassie כחול ואחריו destaining ^17.
6. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את שביל המדגם מן הג'ל. ואז לחתוך את השביל הג'ל לתוך 10-15 חתיכות שווות. שים כל חתיכה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר טרי עבור סכום כולל של 10-15 צינורות.
7. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ב אצטוניטריל 50%, מערבולת, וזורקים supernatants. חזור פעמיים. יָבֵשׁקוביות concentrator ואקום ^{18, 19.}
8. רעננותם קוביות עם 10 מ"מ dithiothreitol (DTT), מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה. לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. supernatant מחק.
9. לטבול קוביות ג'ל ב -55 מ"מ iodoacetamide, מערבולת, ספין. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 45 דקות. supernatant מחק.
10. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH ₄ HCO _3, מערבולת, ספין, וזורקים supernatant.
11. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ב 50% אצטוניטריל, מערבולת, ספין. חזור על 3.9 ו 3.10.
12. ייבש את קוביות concentrator ואקום. הוסף 25 μl כיתה רצף טריפסין שונה ב 25 מ"מ NH ₄ HCO _3, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וזורקים את הפתרון עודף. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ללא טריפסין, דגירה לילה בשעה 37 ° C.
13. בקצרה לסובב קוביות למטה ולהעביר את הפפטיד וכתוצאה נוסףct לצינור חדש. הוסף 30 μl של 5% חומצה פורמית ב אצטוניטריל 50% על קוביות, מערבולת למשך 30 דקות, ספין. מערבבים את supernatant עם תמצית. ייבש את התמציות פפטיד עם רכז ואקום לפחות מ 5 μl.
14. שלח דגימות למתקן ליבה ספקטרומטריית מסה לניתוח LC-MS / MS. נתוני MS הניתוח, אשר ניתן להפיק מן תוכנות קוד פתוחות, כוללים בדרך כלל מספר הצטרפות עבור כל חלבון המזוהה, שכותרתו / יחסי תווית ומספר פפטידים ייחודיים המזוהים.

4. אימות מערביות סופג

הערה: המערבי סופג מומלץ לוודא תוצאות ספקטרומטריית מסה.

1. בצע פרוטוקולים מערביים סופג סטנדרטיים להבטיח כמויות שווות של חלבון מכל קבוצה נטענת. השתמש נוגדנים נגד חלבונים בעלי עניין (A5 Annexin למשל, שרשרת B לקטט דהידרוגנאז) מזוהה על ידי MS. זיהוי מערבי סופג, יחד עם צפיפות לניתוחים, יכול לחזור ולאשר כי MS חלבון זיהוי וכימות נכונים.

5. ניתוח נתונים proteomic

הערה: הערכת איכות נתונים, מקדים נתונים, חישוב וקביעת מועמדי חלבון משמעותיים נעשית בנפרד לכל MS לשכפל. לאחר ניתוחים לעיל הושלמו, הנתונים שנותחו מן המשכפל מושווים ומשולבים ^{6, 20, 21.}

1. להעריך את איכות הנתונים MS.
   1. ראשית, log2 להפוך את SILAC-MS שכותרתו / יחסי תווית של חלבונים לכמת בתוכנית גיליון אלקטרוני.
   2. בשנת גרפים מדעיים תוכנה סטטיסטית, קבוצת היחסים לתוך 40-100 פחי יחס עלילת מספר יחסים לכל בן ליצור היסטוגרמה. התפלגות נורמלית של ההיסטוגרמה מציינת באיכות טובה של נתוני MS ^6. האם פעולה זו עבור כל MS משכפל.
2. כדי להגדיל את הביטחון ואת הדיוק של יחסי פפטיד MS, שקול להסיר חלבונים בעלי פחות משני פפטידים הניתנים לכימות.
3. כדי לקבוע מועמדי חלבון למעלה ולמטה מוסדר באופן משמעותי, בצע את הפעולות הבאות כדי לחשב משמעות ספי ^22.
   1. בשנת גרפים מדעיים תוכנה סטטיסטית, ליצור רגרסיה שאינו ליניארי או עקומה-התאמה לנתוני חלוקת תדר. צעד זה מניב ערכים שניתן להשתמש בהם כדי לחשב את ערכי הסף. חשבת את הערכים החתוכים כמו חציון ± 1.96 σ עבור גבולות סמך 95% או 2.56 σ עבור גבולות סמך 99%.
      הערה: פרטים ספציפיים חישוב הפסקות ניתן למצוא בכתובת Emmott et al. ^22.
   2. בחר את מועמדי חלבון יחסיים אשר הם או גבוהים מ -1.96 (או 2.56) סטיות תקן מעל החציון (משמעותי ביטוי יתר) או נמוך יותר מאשר 1.96 (או 2.56) סטיות תקן מתחת לחציון (תת הביע באופן משמעותי).
4. השווה את המשכפל של המועמדים המשמעותיים-שזוהו לעיל כדי להשיג עקביות. ודא כי הם עומדים בקריטריונים הבאים כדי לעבור שלב בחירה סופי זה: מועמדים חייבים להיות מזוהים באופן עקבי בכל המשכפל; ו משכפל של מועמד חייב להיות עקבי בכיוון של רגולציה שלהם (רצוי, לפחות 2 מתוך 3 משכפל של מועמד צריכים להיות או למעלה מוסדרים או למטה מוסדר).
5. לסיים נתונים עבור מועמדים העונים על הקריטריונים הנ"ל על זיווג של קובצי 'משכפל שלהם.

6. אימות ביואינפורמטיקה ואפיון

הערה: מידע גנומי bioinformatic קיים מציע שפע של מידע כמעט על כל חלבון. כריית נתונים וניתוח ביואינפורמטיקה על מידע שיכולים לסייע בהשגת מידה רבה של תובנה הנכס והפונקציות של המועמדים המשמעותיים. proce זהss הוא בדרך כלל יש צורך לתכנן את הניסויים רטוב-מעבדה במורד הזרם הנכון.

1. שימוש במספרי הצטרפות GenBank שלהם או מזהי UniProt, חיפוש המועמדים מול מסדי נתוני exosome נוכחיים (Exocarta ^23, Evpedia ²⁴⁾ כדי לוודא את החלבונים המועמדים נמצאו בעבר exosome. צעד זה מוסיף שכבה של ביטחון כי המועמדים הם אכן exosomes.
   1. http://www.exocarta.org/ Access, לחץ על "שאילתה" וקלט גם במספר גנים או חלבונים שם / ההצטרפות. דף סיכום יופיע ראיות exosome יוצגו, ובלבד אם יש.
2. חיפוש המועמדים כנגד HIV-1 ואת מסד אינטראקציה חלבון אנושי ^25. לחלופין, חפש מסדי נתונים הספציפיים שיכול לספק מידע על האינטראקציה של החלבונים המועמדים ואת תנאי הבדיקה.
   1. לגשת אל מסד הנתונים ב- www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVיחסי גומלין. על כניסת חלבון שם תחום ', הזן את מספרי הצטרפות שמות או המועמדים, ולחץ על חיפוש. תוצאות החיפוש יכולים לספק תובנה אינטראקציות בין HIV-1 והמועמדים חלבון, ולהציע איזה מבין המועמדים עלולה להיות באמת HIV-1 קשורים.
3. מספרי היבוא GenBank הצטרפות או UniProt תעודות זהות של המועמדים לתוך תוכנת ניתוח GO (כגון FunRich, כלי ניתוח העשרה פונקציונלית ²⁶⁾ ולהפעיל את התוכנה.
   1. הורד את התוכנה ב http://www.funrich.org/. לאחר ההתקנה, פתח את התוכנה, תחת ניתוח העשרה, לחץ על "הוסף למערך הנתונים", ולהעלות את רשימת חלבון / גנים. לאחר מכן, בחר את סוג התרשים כדי להמחיש את ניתוח GO.
      הערה: GO תוצאות הניתוח יהיה דמיינו בצורה של תרשימי עוגה. פעולה זו מסייעת לנו לקבל תובנות עולמיים קשורים המועמדים בתחומי תהליכי ביולוגים (BP), רכיב סלולארי (CC), ותפקוד מולקולרי (MF).
4. גישה דוד http://david.ncifcrf.gov/ ^27, לחץ על "ביאור כלי פונקציונלי" באתר האינטרנט שלה. הזן את רשימת המועמדים, בחר "מזהה" של הגן כגון "UniProt ID", בחר "ג'ין רשימת" וחיפוש. תנאי GO המועשרים, p-הערכי, והפרמטרים נוספים ניתן למצוא על ידי לחיצה על "תוצאות סיכום ביאור" הדף תחת קטגורית "Gene_Ontology".
5. כדי לחקור אינטראקציות פוטנציאל של המועמדים עם חלבונים אחרים, לשימוש באתר STRING נגיש בגלוי ²⁸ להבהיר אינטראקציות חלבון-חלבון פוטנציאליים הביוכימיים אפשרית.
   הערה: GO ניתוח ביאור פונקציונלי (סעיף 6.3-6.4) יכולה גם להתבצע באמצעות תוכנת STRING האחרונה.
   1. לגשת אל מסד הנתונים ב- http://string-db.org/. הזן את המזהה או רצף חלבון לתוך הים המיועדתיבת earch ובחר המין הנכון לניתוח. לחץ על "חפש". התוצאות יתנו מידע משני עמותות ישירה (פיזית) ועקיפים (תפקודית). המשחקים הידועים בעשירייה הראשון עבור מועמד exosomal יוצגו צריך להיחשב לבחירת מועמד משמעותית.
      הערה: מידע רב הקשורים המועמדים ניתן לנתח באמצעות השלבים לעיל. המועמדים המשמעותיים ביותר עשויים להיבחר לניתוח מולקולרי ביוכימיים במורד זרם.

תוצאות

איור 1 א הוא תרשים זרימה המפרט את ההליך תיוג SILAC ^21. על מנת לטהר את exosomes, הדגימות חייבות להיות סובבות למטה באמצעות צנטריפוגות. איור 1B מציגה את השלבים של טיהור exosome ידי ultracentrifugation סדר ^21. לאחר מטוהרים, את exosomes כפ?...

Discussion

בשנת ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו הוכחנו את היישום של טכניקת SILAC כדי לחקור את ההשפעה של זיהום HIV-1 על proteome המארח exosomal. בתחילה, נגוע ו- HIV-1 תאים נגועים הם איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. Exosomes שכותרתו דיפרנציאלי אז הם מטוהרים לפני ביצוע מיצוי חלבון. לאחר מכן, ספקטרומטריית מס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details